The authors would like to acknowledge Drs. Jonathan Reichner and Angle Byrd for cell experiment insight. The National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (GRFP) supported this work.

1. 3D-Formenbau und Parts <ol><li> Schimmel <ol><li> Vor der Arbeit, eine Silikonelastomer-Kit, ein Live Cell Imaging Kammer, eine 22 mm Deckglas und einer bearbeiteten Aluminium-Metall-Würfel mit den Abmessungen 10,07 mm x 3,95 mm x 5,99 mm. Bereiten Sie das Live Cell Imaging Kammer zur Formung, indem das Deckglas in der unteren Halterung und Montage der Rest der Kammer, wie den Angaben des Herstellers. </li><li> Als nächstes wird mit einer Pinzette, legen Sie die bearbeiteten Aluminium-Metall-Würfel in der Mitte des Live Cell Imaging Kammergehäuse und auf der Oberseite des Deckglases und dann beiseite stellen. </li><li> Mischungssiliconelastomerlösungen gemäß dem Protokoll des Herstellers zu 5 ml Elastomer bilden. </li><li> Mit einem Einweg-Labor Spatel, gießen Siliconelastomer-Lösung in Live Cell Imaging Kammer-Setup und stellen Sie sicher nicht platziert bearbeitetem Aluminium Metallwürfel bewegen. Stellen Sie die Anlage auf dem Labortisch, an einem sicheren Ort O / N für die Heilung. </li><li> Am nächsten Morgen, dekonstruierendas Live Cell Imaging Kammer, wie vom Hersteller empfohlen wird, und ziehen Sie Form mit einer Pinzette. Mit einer Pinzette vorsichtig heraus das bearbeitete Aluminium-Metall-Würfel von Schimmel. Gehen Sie auf die Wanne und spülen Sie die Form mit VE-Wasser. Legen Sie die Form auf einem Papiertuch, um zu trocknen. </li><li> Nach dem Trocknen mit einem Hobby-Messer, schneiden Schlitze durch die Form, Abstand 2,34 mm von jedem Längsende, in der Silikonform. Achten Sie darauf, die Form bleibt in einem sicheren und trockenen Ort, bis Sie bereit sind, um das System für ein Experiment zu konstruieren sind. </li></ol></li><li> Hydrophilen und hydrophoben Deckgläser Vorbereitung <ol><li> Damit der Kollagenmatrix zu einer Oberfläche haften, zu schaffen hydrophilen Deck: <ol><li> Unter Verwendung einer Einwegpipette, abmessen 150 ul 3-Aminopropyltrimethoxysilan und gießen Lösung in ein 50 ml Röhrchen. 30 ml 100% Ethanol auf die 50-ml-Röhrchen mit einem zweiten Einwegpipette und den Deckel schließen. Vortex die Lösung für 2 min, wodurch eine vollständige Durchmischung. Punsere Lösung in einer Glaspetrischale und beiseite stellen. </li><li> Gießen Sie 15 ml 100% Ethanol in eine zweite Petrischale und beiseite stellen (stellen Sie sicher, um Gerichte zu markieren). </li><li> Mit Hilfe einer neuen Einweg-Pipetten, abmessen 30 ml VE-Wasser und gießen Lösung in einen 50-ml-Tube. Als nächstes wird mit einer neuen Einweg-Pipetten Maßnahme aus 1.875 ul Glutaraldehyd und gießen Lösung in den gleichen 50-ml-Tube und den Deckel schließen. Vortex die Lösung für 2 min, wodurch eine vollständige Durchmischung. Die Mischung in Drittpetrischale, und beiseite stellen. </li><li> Mit einer Pinzette, nehmen Sie eine 22 mm runden Deckglas und spülen Sie beide Seiten mit 100% Ethanol-Gemisch mit einer Einwegpipette. </li><li> Platzieren gespült Deckglas in 3-aminopropyl-trimethoxysilan mit 30 ml 100% ige Ethanollösung Schüssel und zu ermöglichen, in Lösung 5 min stehen lassen. </li><li> Mit einer Pinzette herausnehmen Deckglas und spülen wieder mit 100% Ethanol-Lösung mit Einwegpipette. </li><li> Drop gespült Deckglas in 1875ul Glutaraldehyd und 30 ml entionisiertem Wasser-Gemisch und beiseite für 30 min eingestellt. </li><li> Nach 30 Minuten, entfernen Sie Deckglas mit einer Pinzette und spülen mit VE-Wasser und legen Sie auf das trockene Gewebe O / N bei RT trocknen. </li><li> Wiederholen Sie die Deckeintauchen und Bewegen für so viele Deckgläser als mit den gleichen erzeugten Lösungen benötigt. </li></ol></li><li> Machen hydrophoben Deckgläser durch das gegebene Protokoll. <ol><li> Gib 500 ul Tridecafluor-1,1,2,2-tetrahydrooctyl wurden 100 ul Essigsäure und 19,4 ml Hexan in einem 50 ml-Röhrchen und Vortex für 2 min. Gießen Lösung in Glaspetrischale und beiseite stellen. </li><li> Mit sauberen Pinzette, nehmen Sie ein Deckglas-and-Drop in die vorbereitete gemischte Lösung für 2 Minuten. Nach 2 Minuten vergangen sind, nehmen Sie Deckglas mit einer Pinzette und spülen mit VE-Wasser unter Verwendung einer Einwegpipette und Ort Deckglas auf das trockene Gewebe O / N bei RT trocknen. Shop Deckglas in Kunststoff-Petrischalen bis zur Verwendung. </li><li> Wiederholen Sie die Deck dipping und Bewegen für so viele Deckgläser als mit den gleichen erzeugten Lösungen benötigt. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Mold Assembly <ol><li> Vor der Verwendung von Formen, mit einem Einweg-Pipetten spülen Sie die Form mit 90% Ethylalkohol in einem Behälter für Chemieabfälle. Als nächstes legen Sie die Form in einer Petrischale mit entionisiertem Wasser gefüllt und lassen Sie O / N sitzen. </li><li> Nehmen Sie Form aus der Lösung mit einer Pinzette und auf einem Handtuch an der Luft trocknen, bevor Sie den Formaufbau. </li><li> Während die Form Lufttrocknung, schneiden Sie die quadratische hydrophile Deckgläser in zwei Rechtecke etwas größer als 3,95 mm x 5,99 mm mit einem hochpräzisen Diamantritzwerkzeug. Schieben Sie die Schnitt Rechteck Deckglas in die in die Silikonform geschnitten Slots. </li><li> Drehen Sie die Form auf den Kopf und gelten Vakuumfett auf dem Boden der Silikonform mit einer Einwegpipette. Als nächstes drehen Sie die Form wieder rechten Seite nach oben und drücken Sie den Boden der Form auf die kreisförmige hydrophile GlasabdeckungenLippe, um eine Dichtung zu schaffen. </li><li> Mit Einweghandschuhe, nehmen Sie den zusammengesetzten Form und in einen Einweg-Petrischale und dann in eine Bio-Haube. Schalten Sie UV Bio-Haube-Lampe für 1 Stunde, um die Form zu sterilisieren, bevor Experimente auftritt. </li></ol> 3. Kollagen Mixture und 3D-Matrix <ol><li> Vor der Herstellung der Kollagenmischung, Färbung und Vorbereitung der Zellen zum Abbilden gemß Standardprotokollen 28. </li><li> Verwendung von Standard-Labortechniken und Protokolle 29,30, in einem bio-Haube, mischen Zellmedien und chemische Lockstoffe in einer 15 ml Tube, um die gewünschte Konzentration chemoattractant. Pipette 5 ml spezifischer Zellmedien chemoattractant Konzentration Lösung in einen 15-ml-Röhrchen und bewegen Sie die Lösung in ein beheiztes Wasserbad. </li><li> Mit einer Pipette extrahieren 5 ml nur Zellmedium in einen zweiten 15-ml-Tube und in ein erhitztes Wasserbad zum Aufheizen der Lösung für die Mikroskopie Experimente. </li><li> In einem bio-Haube, Pipette 30 ul 10x Phosphatpuffered Lösung (PBS) in Mikrozentrifugenröhrchen. In 6 ul 1 N Natriumhydroxid (NaOH) in derselben Mikrozentrifugenröhrchen und Vortex für 15 Sekunden. </li><li> Zu erhalten Kollagen I Rattenschwanz-Lösung aus dem Kühlschrank und zu bewegen, um die bio-Haube mit Standard-Labortechniken und Protokolle 29. Stellen Sie sicher, das Kollagen noch kalt ist. Pipettieren 168,3 ul Kollagen in derselben Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Als Nächstes fügen Sie 18 ul der gelb-grün fluoreszierende Carboxylat-modifizierte Mikrosphären mit einer Pipette auf die gleiche Mikrozentrifugenröhrchen. Wirbel das Mikrozentrifugenröhrchen mit allen Lösungen für 30 sec. </li><li> In 77,7 ul der gewünschten Zellmedien-Zellgemisch (ca. 2 x 10 6 Zellen / ml-Konzentration) in Mikrozentrifugenröhrchen und mischen mit Pipettenspitze 20 Sek. Wie nötig, ändern Sie die Matrixdichte, indem Sie die benutzerdefinierte Collagen Mischung für den Zusatz von fluoreszierenden Kügelchen und die Lebensfähigkeit der Zellen Tabelle (Tabelle 1) angepasst. </li><li> Pipette 300 &amp; #181; l von Kollagen-Zellen-Mischung in der Mitte gut (gut # 2) des hergestellten Formanordnung. Legen Sie die Form auf einem Einweg-Petrischale und verschieben Sie sie in ein Standard-Inkubator für 20 min bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li><li> Entfernen System von Inkubator und legen wieder in bio-Haube. Mit einer Pinzette, entfernen Sie die beiden hydrophoben Deckgläser durch Klemmen auf der Oberseite jedes Deckglas und Ziehen nach oben und weg von der Form. </li><li> Bewegen des gesamten Systems auf die gewünschte Mikroskopie und Bild sicherzustellen Kollagen Kokillenseiten noch direkt auf eine planare Diffusionsgradienten ermöglichen. </li><li> Mit dem System immer noch unter dem Mikroskop, mit einem 100 &amp; mgr; Einkanalpipette, fügen Sie 100 ul der Zellmedien in gut # 1. Dann wurde unter Verwendung eines 100 &amp; mgr; Einkanalpipette fügen 100 ul Zellmedium mit den gewünschten chemoattractant Konzentration in gut # 3. </li><li> Unmittelbar nach der Zugabe von Lösungen in beiden Brunnen, beginnen Bildgebung. </li></ol> 4. Imaging und DiffusionModellieren <ol><li> Wenn man die Diffusionskoeffizienten für die spezifische Kollagendichte, die spezifische Konzentration berechnen finden will, folgen Sie der unten Protokoll: <ol><li> Folgen Sie der oben angegebenen Protokoll mit dem Titel &quot;Collagen Mixture und 3D-Matrix&quot;, anstatt Erzeugung Zellmedium mit den gewünschten chemoattractant Konzentration, machen 5 uM Rhodamin in einer 15-ml-Röhrchen mit Standard-Berechnungen und Protokolle 30. </li><li> Bild der 3D-Kollagen-Matrices mit einem konfokalen System auf einem inversen Mikroskop unter Verwendung eines Argon-Laser (488 nm), um die Fluoreszenz zu erfassen montiert. Bild alle 2 oder 3 sec für bis zu 7 Std. </li></ol></li><li> Für Diffusion Modeling: Mit Hilfe der unten mathematisches Modell, einen Rechensoftwarecode für die Verarbeitung und Analyse mit diesen allgemeinen Schritten. <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/52948/52948eq1.jpg" /><ol><li> Import von Bildern in Computersoftware für Skalierung und Normalisierung durch die maximale intensity. Konvertieren von Bildern in einer grauen Farbe-Karte des Bildes, um die Kante zu wählen. Pick eine Achse entlang der Mitte des Bildes, auf der rechten Seite der Mitte und links von der Mitte. </li><li> Verwendung der Rechensoftware Code plotten die normalisierte Intensität zusammen mit der wahre Intensität und der Unterschied zwischen den beiden. </li><li> Danach geben die Parameter für die Montage (Konzentration, Zeit und Länge) notwendig. </li><li> Plotten der normierten Konzentration gegen die Zeit und das Konzentrationsprofil in der x-Achse mit einem Polynom-Anpassung an die Daten. </li><li> Berechnen der Diffusionskoeffizient mit Hilfe der Rechensoftwarecode. </li></ol></li></ol> 5. Experimentelle Messungen <ol><li> Rückbezug auf die Diffusionsgleichung, schreiben die Gleichung, um die spezifische Konzentration an jedem Ort innerhalb des Systems zu finden, wie in unten gezeigt. <img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/52948/52948eq2.jpg" /> Wo: L = Länge der the Kollagenmatrix x = Lage in Untersuchung D = Diffusionskoeffizient t = verstrichene Zeit, </li><li> Während Chemo Experimenten sicherzustellen, um die spezifische Zeit, die das Moment Chemokin wurde System hinzugefügt aufzuzeichnen. Sobald die Zellmigration Bewegung gefunden wird, um sicherzustellen, konfokale Zeitrafferaufnahme aufzeichnen, und beachten Sie den genauen Zeitpunkt und Ort vom Rand, wo Bildgebung aufgetreten. </li><li> Bei der Datenanalyse, schließen die erwähnte abgelaufene Zeit, Standort und der Diffusionskoeffizient für die spezifische Zelle, in der Gleichung auf die normierte spezifische Konzentration an jedem Punkt innerhalb der Kollagen sowohl Diffusion und Zellexperimenten gefunden. </li></ol> 6. Tracking-Zellmigration Verwendung TFM <ol><li> Zu verfolgen, die Zellmigration mit TFM / DVC-Techniken folgen dem Protokoll im Handumdrehen: <ol><li> Nach Zugabe der gewünschten Konzentration chemoattractant in Vertiefung 3, Start Abbilden der 3D-Kollagen-Matrices mit einem konfokalen System auf einem invertierten MICR montiertenOscope zu finden, um eine Zelle zu untersuchen. </li><li> Sobald eine Bewegung Zelle gefunden wird, setzen Sie die Zelle, in der Mitte des Sichtfeld und nutzen eine piezoelektrische Motor (für Bild in der z-Achse), Bild alle 1 oder 2 min. </li><li> Für die Berechnung Zellkrafterzeugung und Verformung, erzeugen eine Rechencode, um die Verschiebungen der Fluoreszenz Perlen nach den TFM / DVC-Protokolle 31 zu finden. </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Diffusionsexperimente mit oder ohne Zellen sind: richtig Einrichten der Formanordnung; Entwicklung der notwendigen Fingerfertigkeit, um bei der Extraktion von hydrophoben Deckschäden zu vermeiden; gewährleisten eine sehr gute lineare Startlinie, um den Diffusionskoeffizienten korrekt berechnen zu finden; korrigieren experimentelle Berechnungen von sowohl Kollagen und chemische Lockstoffe; von Live Cell Imaging System, um sicherzustellen, Matrix trocknet nicht aus richtig...

Die bevorzugte Bewegung von Zellen in Richtung eines Konzentrationsgefälles Chemotaxis bekannt, spielt eine wichtige Rolle bei pathologischen und physiologischen Prozessen im Körper. Solche Beispiele sind Haut- und Schleimhaut Wundheilung 1, 2 Morphogenese, Entzündungen 3, und das Tumorwachstum 4,5. Es wurde auch gezeigt, daß Krebszellen durch beide individuelle und kollektive Zellmigrationsstrategien 6 migrieren. Darüber hinaus können Diffusionsinstabilität Mechanismen die Trennung von einzelnen oder gruppierten Zellen aus einer Tumor Körper / Objekt zu induzieren und dann kann auf eine Quelle von Nährstoffen einzuwandern und so dringen größere Gebiete und Gewebe 7. Ferner hat es sich gezeigt, dass die vielfältigen Migrationsmechanismen aktiv in 2D und 3D werden, wegen der unterschiedlichen Rollen von Adhäsionsmolekülen 8. Daher ist ein Umzug in physiologisch relevanten in-vitro-Tests an Zellbeweglichkeit in einem measureabl untersuchene und einfache Weise von Bedeutung für das Verständnis Zellbewegung Phänomene 9. Leider ist die Schwierigkeit bei der Analyse von Zellmigration, eine umfassende quantifizierbare Chemotaxis-Assay erfordert in der Regel eine lange mühsame Methode, auf der Messung der unparteiische Zellbeweglichkeit und Transportphänomene Modelle gegründet. Vergangenen experimentellen Ansätzen, um die Zellchemotaxis zu untersuchen sind der Boyden-Kammer 10 und der unter Agarose-Assay 11. Doch innerhalb dieser frühen Tests, die Zellmigration Experimente nicht die Bewegung in Bezug auf die Zeit zu überwachen. Weitere, besonders wichtig, die Konzentrationsgradienten für die Experimente verwendet wurden, nicht gut definiert oder vollständig verstanden, während nur die Erhaltung der Signalisierung für nicht mehr als ein paar Stunden. Weiterhin frühen Chemokammer Versuche beschränkt Zellmigration auf zwei Dimensionen und nicht erlauben, die Kinetik der Migration 12 überwachen. Mit Blick auf die Boyden-Kammer, ein Endpunkt-Assaywürde nicht zulassen, dass der Forscher, um die Migration visuell zu beobachten und nicht direkt zu unterscheiden Chemotaxis (Bewegungsrichtung) von Chemokinese (Zufallsbewegung). Darüber hinaus mehrere Variablen-Unterschiede in der Porengröße und Dicke der Membranen verursachten die Kammer sehr schwierig, einfach zu reproduzieren und verdeckte die Wander Reaktion von Zellen auf Chemokine 13,14. Mit dem neuen Verständnis der Mikrofluidik, haben neue Kammern und Mikrogeräten als Instrument untersucht worden, um Zellbewegung unter Zwischenströmungsbedingungen zu untersuchen oder Chemotaxis 15,16. Unter diesen neuen Geräten wurden neue Zell Metriken eingeführt und untersucht, wie die Wirkung von Scherspannung auf eine Zelle 17,18. Leider vergangenen und aktuellen mikrofluidischen Chemotaxiskammern begrenzt Untersuchungen von Zellmigration, um 2D-Substrate eine wichtige Rückschlag seit vielen biologischen Prozessen wie Tumorzellinvasion und Metastasierung, und imImmunzellmigration, beinhalten 3D-Migration. Direkte Beobachtung Kammern, wo-a chemoattractant Lösung in Kontakt mit einer 3D-Gel enthaltenden Zellen wurden ebenfalls berichtet 19,20. Diese Kammern haben zwei Kammern, von denen eine Lockstoff und eine mit Zellen, die nebeneinander horizontal 21 oder als konzentrische Ringe 22 verbunden sind. Diese Systeme werden in die richtige Richtung, aber nicht über ein Chemotaxis-System zu halten für eine ausgedehnte Zeitperiode. Darüber hinaus haben Forscher auch durch Kollagenmembranen in Dialysezellen sowie die Diffusion von Tracermolekülen durch Kollagenproben gegen hydrostatischen Druck unterworfen 23-25 ​​geprüft Leitfähigkeit. Einige Diffusionsexperimente in Kollagengelen beruhen auf physikalischen und chemischen Modifikationen des Gels mit Magnetfeldern und chemischer Einbau 26. Eine beliebte Methode zur Modellierung von Diffusionsvermögen in collaGenous Gewebe beruht auf der Fluoreszenzabbildung der kontinuierlichen Punkt Photobleichen. Dieses Verfahren wurde Anisotropie der Diffusionskoeffizienten von Makromolekülen in orientierten Kollagengewebe offenbart. Dennoch hat Photobleichens im Gelenkknorpel benutzt und nicht-Kollagen-Matrices. Zwar ähnlich, müssen die erforderlichen Modellversuche durch speziell Verständnis der Diffusionskoeffizient von Kollagengelen erfolgen. Noch wichtiger ist, die Systeme nicht ein Verfahren zur Messung Zellkrafterzeugung nutzen. Leider sind die meisten Systeme scheinen auf ein oder zwei Schlüsselelemente für ein ideales System fehlen: das ermöglicht der Zelle Tracking, einem Diffusionsgefälle Verständnis mit einem chemotaktischen Faktor durch die Matrix, einem relativ einfachen Aufbau mit einer Leichtigkeit der Reproduzierbarkeit, der Minimierung von Zell-Zell-Wechselwirkungen, sowie die Fähigkeit, Dimensionseinheiten zur Quantifizierung (dh, die Geschwindigkeit, Kraft, spezifische Konzentrations) zu messen. Moghe et al. </em&gt; 27 ein System vorgeschlagen, das weitgehend die Anforderungen in der Zellen wurden zunächst im ganzen Gel dispergiert anstatt auf der Filteroberfläche konzentriert erfüllt, ist aber schwierig zu Kräften, die die Zelle erzeugt messen. Zu diesem Zweck stellen wir eine planare Gradienten-Diffusionssystem zur Chemotaxis in einem 3D-Kollagen-Matrix, die eine moderne Diffusionskammer Beschränkungen vorhandener Assays, die auf Zeitraffermikroskopie beruht, in Verbindung mit Bildanalysetechniken zu Zelle messen zu überwinden ermöglicht untersuchen Kräfte in einer 3D-Umgebung. Dieses Protokoll sieht eine einfache, aber innovative Art der Erstellung einer einfachen 3D-Diffusionskammer, die verwendet werden können, um 3D-Chemotaxis in verschiedenen Zellen zu untersuchen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning Corp</td>
			<td>182 SIL ELAST KIT .5KG</td>
			<td>a two-part misture with a 10:1 mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live cell imaging chamber</td>
			<td>Live Cell Instrument</td>
			<td>CM-B18-1</td>
			<td>CMB for 18mm round coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22mm Glass Coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0180281</td>
			<td>Neuvitro Corp. cover slip 22mm 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Machined aluminum metal cube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hobby utility knife</td>
			<td>X-Acto</td>
			<td>X3201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(aminopropyl) trimethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>281778-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Polysciences, Inc</td>
			<td>00216A-10</td>
			<td>Glutaraldehyde, EM Grade, 8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Standard floor model and tabletop centrifuges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-747A</td>
			<td>Reusable Petri Dishes: Complete (60 x 15mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-327-379</td>
			<td>Fine Point Forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-518-105A</td>
			<td>Rectangle; 30 x 22mm; Thickness No. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl</td>
			<td>Gelest</td>
			<td>SIT8174.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320099</td>
			<td>Acetic acid ACS reagent, &#8805;99.7%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296090</td>
			<td>Hexane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>anhydrous, 95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>200 proof, for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-precision diamond scribing tool</td>
			<td>Lunzer</td>
			<td>PV-081-3</td>
			<td>Straight extended tip scribe, .020&#34; (.50mm) diameter by .200&#34; (5.0mm) tip length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>14-635-5C</td>
			<td>High-Vacuum Grease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49D</td>
			<td>15 ml conical centrifuge tubes with hydrophobic, biologically inert surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X phosphate buffered solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-500</td>
			<td>1.37 M Sodium Chloride, 0.027 M Potassium Chloride, and 0.119 M Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1N sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>38215</td>
			<td>Sodium hydroxide concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354236</td>
			<td>Rat tail&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro centrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-332</td>
			<td>Volume: 2.0 ml; O.D. x L: 13 x 40 mm; sterile; single-wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxylate-modified microspheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;F-8813</td>
			<td>Carboxylate-modified microspheres, 0.5 &#181;m, yellow-green fluorescent (505/515), 2% solids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83689</td>
			<td>Rhodamine B for fluorescence</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3d collagen matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Die Fähigkeit des Assays, genau zu beurteilen die Migration der Zellen beruht auf einem guten Aufbau des Systems. Daher ist es wichtig für Sie sicher, dass die Diffusion System Form genau entwerfen und große Sorgfalt bei der Platzierung sowohl hydrophobe und hydrophile Deckgläsern, wie in Abbildung 1 veranschaulicht. Wenn das System ordnungsgemäß entworfen und während des Diffusionsmodellierungsstufe gewährleistet eine sehr finden gute lineare Startlinie, ist man in der Lage schön zu erreichen ...

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Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Planar Gradient Diffusionssystem, um Chemotaxis in einem 3D-Kollagen-Matrix Untersuchen

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.4K Aufrufe.  California State University, Long Beach. Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Serie: Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

Tissue Engineering eines Menschen 3D<em&gt; In-vitro-</em&gt; Tumor-Testsystem

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Forschung

Biotechnik

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

Analyse der Zellmigration in eine dreidimensionale Kollagenmatrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to tumor and cancer metastasis. Despite intense research efforts, the basic biochemical and biophysical principles of cell migration are still not fully understood, especially in the physiologically relevant three-dimensional (3D) microenvironments. Here, we describe an in vitro assay designed to allow quantitative examination of 3D cell migration behaviors. The method exploits the cell&#8217;s mechanosensing ability and propensity to migrate into previously unoccupied extracellular matrix (ECM). We use the invasion of highly invasive breast cancer cells, MDA-MB-231, in collagen gels as a model system. The spread of cell population and the migration dynamics of individual cells over weeks of culture can be monitored using live-cell imaging and analyzed to extract spatiotemporally-resolved data. Furthermore, the method is easily adaptable for diverse extracellular matrices, thus offering a simple yet powerful way to investigate the role of biophysical factors in the microenvironment on cell migration.

The mechanical properties and microstructure of the extracellular matrix strongly affect 3D migration of cells. An in vitro method to study the spatiotemporal cell migration behavior in biophysically variable environments, at both population and individual cell levels, is described.

Concentric Gel-System, um die biophysikalische Rolle der Matrix Mikromilieu auf 3D-Zellmigration Studieren

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Engineering 3D cellularized Kollagengele für Gefäßgeweberegeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a deeper comprehension of the neural system scientists aim to simplistically reconstruct the tissue by assembling it in vitro from basic building blocks using a tissue engineering approach. Our group developed a tissue-engineered silk and collagen-based 3D brain-like model resembling the white and gray matter of the cortex. The model consists of silk porous sponge, which is pre-seeded with rat brain-derived neurons, immersed in soft collagen matrix. Polarized neuronal outgrowth and network formation is observed with separate axonal and cell body localization. This compartmental architecture allows for the unique development of niches mimicking native neural tissue, thus enabling research on neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell and cell-matrix interactions and electrical functions.

Insight into the complex actions of the brain requires advanced research tools. Here we demonstrate a novel silk-collagen-based 3D engineered model of neural tissue resembling brain-like architecture. The model can be used to study neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell interactions and electrical activity.

Engineered 3D Silk-Kollagen-basierten Modell von polarisiertem Neural Tissue

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single strain-induced cellular alignment on a cell-laden hydrogel by using complex experimental processes and mass controlling systems, which are usually associated with contamination issues. Thus, in this article, we propose a simple approach to building a gradient static strain using a fluidic chip with a plastic PDMS cover and a UV transparent glass substrate for the stimulation of cellular behavior in a 3D hydrogel. Overloading photo-patternable cell prepolymer in the fluidic chamber can generate a convex curved PDMS membrane on the cover. After UV crosslinking, through a concentric circular micropattern under the curved PDMS membrane, and buffer washing, a microenvironment for investigating cell behaviors under a variety of gradient strains is self-established in a single fluidic chip, without external instruments. NIH3T3 cells were demonstrated after observing the change in the cellular alignment trend under geometry guidance, in cooperation with strain stimulation, which varied from 15 - 65% on hydrogels. After a 3-day incubation, the hydrogel geometry dominated the cell alignment under low compressive strain, where cells aligned along the hydrogel elongation direction under high compressive strain. Between these, the cells showed random alignment due to the dissipation of the radical guidance of hydrogel elongation and the geometry guidance of the patterned hydrogel.

This article introduces a simple approach to providing non-continuous gradient static strains on a concentric cell-laden hydrogel to regulate cell alignment for tissue engineering.

Gradient Stamm Chip für anregende zellulären Verhaltensweisen in Zelle beladenen Hydrogel

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Herstellung von 3D-Kollagen-Gel und Mikrokanäle für das Studium der 3D-Interaktionen<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Tunable Hydrogele aus Pulmonary Extrazellulärmatrix für 3D-Zellkultur

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates

In vitro cultivated skin models have become increasingly relevant for pharmaceutical and cosmetic applications, and are also used in drug development as well as substance testing. These models are mostly cultivated in membrane-insert systems, their permeability toward different substances being an essential factor. Typically, applied methods for determination of these parameters usually require large sample sizes (e.g., Franz diffusion cell) or laborious equipment (e.g., fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)). This study presents a method for determining permeability coefficients directly in membrane-insert systems with diameter sizes of 4.26 mm and 12.2 mm (cultivation area). The method was validated with agarose and collagen gels as well as a collagen cell model representing skin models. The permeation processes of substances with different molecular sizes and permeation through different cell models (consisting of collagen gel, fibroblast, and HaCaT) were accurately described.
Moreover, to support the above experimental method, a simulation was established. The simulation fits the experimental data well for substances with small molecular size, up to 14 x 10-10 m Stokes radius (4,000 MW), and is therefore a promising tool to describe the system. Furthermore, the simulation can considerably reduce experimental efforts and is robust enough to be extended or adapted to more complex setups.

A method for determination of permeability in a membrane insert system for multi-well plates and in silico parameter optimization for the calculation of diffusion coefficients using simulation are presented.

Eine Methode zur Bestimmung und Simulation von Durchlässigkeit und Diffusion in einem 3D Gewebe-Modell in einer Membran einfügen System für Multi-well-Platten

In vitro cultivated skin models have become increasingly relevant for pharmaceutical and cosmetic applications, and are also used in drug development as ...

A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily identified and used. Currently, this gap is filled with tendon auto-, allo-, xeno-, or artificial grafts, but clinical methods to secure them are not necessarily translatable to animals because of the scale. In order to evaluate new biomaterials or study a tendon graft made up of collagen type 1, we have developed a modified suture technique to help maintain the engineered tendon in alignment with the tendon ends. Mechanical properties of these grafts are inferior to the native tendon. To incorporate engineered tendon into clinically relevant models of loaded repair, a strategy was adopted to offload the tissue engineered tendon graft and allow for the maturation and integration of the engineered tendon in vivo until a mechanically sound neo-tendon was formed. We describe this technique using incorporation of the collagen type 1 tissue engineered tendon construct.

In this paper, we present an in vitro and in situ protocol to repair a tendon gap of up to 1.5 cm by filling it with engineered collagen graft. This was performed by developing a modified suture technique to take the mechanical load until the graft matures into the host tissue.