Wir möchten die gesamte Maurer Gruppe an der Washington University, deren kollektives Wissen hat dieses Protokoll möglich anzuerkennen. Die Finanzierung dieser Arbeit wird durch das National Institute of Mental Health (1R01MH085495) zur Verfügung gestellt.

1. Vorbereitung der Patterned Master (Abbildung 1) <ol><li> Zentrum der Silizium-Wafer auf dem Spin-Coater und spülen Sie die Wafer mit Aceton in der ersten Stufe des zweistufigen Spin-Programm in Tabelle 1. Das Aceton wird im zweiten Schritt des Spin-Programm hinterlässt eine saubere, trockene Wafer verdampfen. </li><li> Wenden Sie ca. 1 mL AZ9245 Fotolack / in (im Durchmesser) auf den Wafer-und Spin-Mantel mit den in Tabelle 1 beschrieben. </li><li> Soft-backen der Fotolack beschichtete Wafer bei 110 ° C für 2 m mit einem High-Uniformität Kochplatte. </li><li> Photopattern das Substrat entweder mit einem direkten Schreib-Photolithographie-System oder ein Mask Aligner und geeignete Maske. Masken können aus einer Reihe von kommerziellen Quellen bezogen werden. Darüber hinaus können Folien mit UV-absorbierenden Druckfarbe, mit Klebeband an eine optische flache, gedruckte verwendet, um Muster mit großen Zügen zu produzieren. </li><li> Entwickeln Sie die strukturierten Wafer in 1:2 400K Entwickler: Halbleiter-grade VE-Wasser für 1 m 45 s unter leichtem Schütteln. Gründlich mit Halbleiter-grade deionisiertem Wasser abspülen und mit einem Strom von Stickstoff (N 2) Gas. Pattern Entwicklung kann mit Hilfe eines Mikroskops mit einem UV-Filter sein. Wenn das Muster nicht vollständig entwickelt ist, kann der Wafer in die Entwicklungsländer für zusätzliche Zeit zurückgegeben werden. </li></ol> Hinweis: Für beste Ergebnisse Photostrukturierungsverfahren sollte in einem Reinraum durchgeführt werden. 2. Vorbereitung der PDMS-Stempel (Abbildung 2) <ol><li> Bereiten Sie eine 10:1 Gewichtsteile Harz: Härter Mischung aus Sylgard 182 (PDMS) und vollständig zu bedecken den Master (photostrukturierten Wafer) mit der Mischung in einem Einweg Petrischale. </li><li> De-gas die PDMS-bedeckten Master in einem Vakuumexsikkator bis keine Luftblasen mehr sichtbar sind und lassen Sie den Stempel, um in einem Ofen bei 65 ° C aushärten für 1,5 h. Vor dem Härten, ist es wichtig sicherzustellen, dass der Meister ist an der Unterseite der Schale, wie sie an der Oberfläche während der Entgasung Schritt ansteigen kann. </li><li> Schneiden Sie die PDMS-Stempel aus dem Master-und trimmen, um die richtige Größe. Bewahren Sie den Stempel in einen Behälter (Feature Seite nach oben), um sie vor Staub und Schmutz zu schützen. </li></ol> 3. Vorbereitung der Patterned Gold-Substrat (Abbildung 3) <ol><li> Bereiten 25 mm nicht. 1 Runde Deckgläser für die Metallabscheidung durch Behandlung mit Sauerstoff-Plasma für 10 m. Spülen Sie zweimal mit 18,2 MOhm entionisiertes Wasser durch zweimal mit Ethanol, Trocknen mit einem Strom von N 2-Gas zwischen jedem Schritt. </li><li> Mit einer Multi-Pocket-Elektronenstrahl-Abscheidung System, gefolgt Anzahlung 50 Å Titan von 150 Å Gold. Nicht vent des Verdampfers zwischen Abscheidung der Titan-Schicht und Goldschicht. Alternativ, gold-beschichtete Deckgläser aus einer Vielzahl von Anbietern erworben werden kann, ist es jedoch wichtig, dass die Metallschichten durch Elektronenstrahl-Verdampfung und nicht thermische Verdampfung vorbereitet sind. 11 vor Gebrauch: Wenn aus einer externen Quelle erworben haben, können Goldsubstraten durch Plasma-Oxidation oder &quot;piranha&quot; (. 30% H 2 O 2 7.03 Conc H 2 SO 4) gereinigt werden. </li></ol> Hinweis: &quot;Piranha&quot;-Lösung ist explosiv in der Gegenwart von organischen Verbindungen. <ol start="3"><li> Bereiten Sie die Stanz-Lösung, 10 mM Hexadecanthiol in absolutem Ethanol, und die Verfüllung Lösung, 1 mM Glykol-terminierten Thiol in absolutem Ethanol. </li><li> Spülen Sie den Stempel mit Ethanol und gründlich trocknen mit N 2-Gas. Bewerben Stanzen Lösung für die PDMS-Stempel tropfenweise bis zur vollständigen beschichtet. Trocknen Sie die Stempel gründlich mit N 2-Gas. Fahren Sie mit 5a oder 5b gegebenenfalls auf die Eigenschaften des PDMS-Stempel auf. </li><li><ol class="lalpha"><li> Drücken Sie den Stempel auf die Gold-Substrat und ermöglichen die Monoschicht für 15 bilden s. </li><li> Legen Sie die Gold-Substrat in eine Petrischale mit 18,2 MOhm entionisiertes Wasser, wodurch das Substrat eingetaucht ist. Drücken Sie den Stempel auf die Gold-Substrat und ermöglichen die Monoschicht für 15 bilden s. </li></ol></li><li> Spülen Sie den Stempel Substrat zweimal mit Ethanol, Trocknen mit N 2-Gas nach jedem Spülen und Ort des Substrats in einer Petrischale. </li><li> Abdeckung des Substrats mit Verfüllung Lösung und Dichtung die Schale mit Parafilm, um Verdunstung zu verhindern. </li><li> Lassen Sie den Hintergrund Monoschicht im Dunkeln für 12-14 h. Form </li><li> Entfernen Sie die gemusterten Deckglas aus der Verfüllung und spülen Sie zweimal mit Ethanol, Trocknen mit N 2-Gas nach jedem spülen. </li></ol> 4. Anwenden von Protein und Zellen, um das strukturierte Substrat <ol><li> Legen Sie die gemusterten Deckglas in einer kleinen Petrischale oder Zellkulturkammer und decken mit 500 ul zu 1 ml Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS). Die DPBS muss vollständig bedecken das Substrat während Protein Inkubation auch Protein Abdeckung zu gewährleisten. </li><li> Fügen Sie eine konzentrierte Lösung von Protein an die DPBS und mischen Sie die Lösung durch das Rohrting mehrmals. Inkubieren Sie die Protein-Mischung mit dem Substrat bei 37 ° C für 1 h. Endkonzentrationen für Laminin und Fibronektin sind in der Regel 12 ug / ml und 20 pg / ml. Protein kann mit einem Amin reaktiven Fluoreszenzfarbstoff markiert werden, um für die einfache Muster Visualisierung zu ermöglichen. Allerdings sollte markierten Proteins 1:1 gemischt mit unmarkiertem Protein-Protein Beschriftung kann mit biologischer Aktivität beeinträchtigt wird. </li><li> Nach der Inkubation spülen Sie das Substrat gründlich mit DPBS (4-5x), um ungebundene Protein zu entfernen, dabei nicht auf das Substrat trocken oder bringen Sie es durch die Luft-Wasser-Grenzfläche. Nach den ersten drei Spülungen, fügen Sie etwa 500 ul von kompletten Zellwachstum Medien zu einem nassen Untergrund zu erhalten. </li><li> Ersetzen Sie den Nährmedien verwendet werden, um das Substrat mit frischem Medium spülen. </li><li> Distanzieren und Zählen von Zellen für die Beschichtung auf das Substrat. Entweder dissoziiert primäre Zellen, wie Neuronen im Hippocampus oder immortalisierten Zelllinien, wie CHO-K1-Zellen, verwendet werden können. </li><li> Platte dissoziierten Zellen auf das Substrat. In der Regel 30 bis 200 Zellen / mm 2 verwendet werden. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Allgemeine schematische für die Photolithographie Vorbereitung eines strukturierten Master. In diesem Prozess wird ein Silizium-Wafer mit Aceton gereinigt, beschichtet mit Fotolack, ausgesetzt, um das Muster des Interesses, und das Muster entwickelt. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Allgemeine schematische für PDMS-Stempel Vorbereitung. In diesem Prozess, der gemusterten Master mit Sylgard (10:1 Harz: Härter) abgedeckt ist, in einem Vakuum-Exsikkator, in einem Ofen bei 60 ° C gehärtet entgast und auf Maß geschnitten. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Allgemeine schematische für Substrat Musterung. In diesem Prozess werden Glassubstrate mit Titan (50a) und Gold (150a) beschichtet mit einem Elektronenstrahl Verdampfer, durch Mikrokontaktdrucken Hexadecanthiol mit einem PDMS-Stempel gemustert, mit Glykol beendet Alkanthiole verfüllt und beschichtet mit fluoreszenzmarkierten Protein. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig4.jpg" alt="Abbildung 4"/> Abbildung 4. Patterned-Master (A) und PDMS-Stempel (B) unter Verwendung der beschriebenen Methoden. Scale-Bars sind 100 um. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig5.jpg" alt="Abbildung 5"/> Abbildung 5. Gemusterte SAMs visualisiert AlexaFluor 647-markiertem Fibronektin (A) und CHO-K1 Zellen Entbindung (B). Scale-Bars sind 100 um. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig6.jpg" alt="Abbildung 6"/> Abbildung 6. Patterned Laminin ausgesät mit E18 Maus Hippocampus-Neuronen an 4 Tagen in vitro. AlexaFluor 350-konjugierten anti-Laminin-Antikörper ist für Muster-Visualisierung (A) verwendet und E18 Maus Hippocampus-Neuronen sind mit MitoTracker Red 580 (B) gefärbt. Scale-Bars sind 100 um. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig7.jpg" alt="Abbildung 7"/> Abbildung 7. Potenzielle Fallstricke in strukturierten Substrat Vorbereitung visualisiert AlexaFluor 647-konjugierten Fibronektin Adsorption. (A) Unzureichende Durchmischung führt zu einer ungleichmäßigen Proteinadsorption. (B) Ungleiche Anwendung von Druck beim Stanzen führt zu teilweiser Patten übertragen. (C) Übermäßiger Druck beim Stanzen kann zum Zusammenbruch führen Stempel. (D) Belichtung der strukturierten Oberfläche, die Luft-Wasser-Schnittstelle beim Spülen kann im Hintergrund Proteinadsorption führen. Scale-Bars sind 100 um. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig8.jpg" alt="Abbildung 8"/> Abbildung 8. Submerged Strukturierung kann Muster mit kleinen Features, die nur schwer mit herkömmlichen Mikrokontaktdrucken in Luft gedruckt werden produzieren. Bilder (A) und (B) zeigen unterschiedliche Regionen des gleichen Muster, mit dem gleichen PDMS-Stempel in Luft (A) oder VE-Wasser (B) gedruckt. 10 um-breite Unterstützung Linien, die das Muster (hinzugefügt, um zu verhindern Stempel Kollaps) umgeben, sind in (A), aber die kleineren dot Funktionen wie in (B) nicht gesehen wird. Dies zeigt, dass der Druck in der Luft eignet sich gut für größere Features, aber der Druckvorgang in Wasser kann es notwendig sein für Muster mit kleineren Features. Scale-Bars sind 20 um. <table border="1"><tbody><tr><td> Zyklus </td><td> Beschleunigung (rpm / s) </td><td> Endgeschwindigkeit (rpm) </td><td> Time (s) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 500 </td><td> 1000 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 3800 </td><td> 3800 </td><td> 30 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1.Zwei-Takt-Spin-Programm verwendet, um eine 4,5 um dicke Beschichtung von AZ9245 auf einem Silizium-Wafer zu erzeugen. Zur Vorbereitung PDMS-Stempel für die Bildung von gemusterten Substrate, ein Meister in Fotolack wird zunächst hergestellt (Abb. 1 und 4A). Der Master ist der Kehrwert des Stempels und erstellt entweder mit einem direkten Schreib-Lithographie-System oder ein Mask Aligner. Wenn eine positive Photoresist, wie AZ9245, für Master-Produktion verwendet wird, wird der Resist-beschichteten Wafer, um Licht mit dem gleichen Muster, die auf das endgültige Substrat erscheint ausgesetzt. Zwar ist es nicht immer möglich ist, ist berichtet worden, dass die ideale Seitenverhältnis (Strukturgröße zu Dicke widerstehen) für PDMS-Stempel Meister 1:2 ist. 13 Wir haben festgestellt, dass Seitenverhältnisse von 1:40 möglich sind, abhängig von der Natur des Musters. AZ9245 beschichteten Silizium-Wafern unter den hier beschriebenen Bedingungen geben Photoresist mit einer nominalen Dicke von 4,5 um. Wir haben festgestellt, dass diese Dicke AZ9245 verwendet werden, um PDMS Meister mit Features von&gt; 100 um bis 2 um zu produzieren. PDMS-Stempel sind aus Sylgard 182 (oder Sylgard 184) mit dem Meister aus Fotolack (Abbildung 2) hergestellt gegossen. Photoresist Meister kann mehrfach verwendet werden, um viele Kopien der gleichen Marke zu schaffen. Nach dem Aushärten des PDMS, sind Briefmarken aus der Master mit einer Rasierklinge und der daraus resultierenden Stempel kann unter dem Mikroskop sichtbar gemacht, indem Stempel-Funktion unten auf einem Deckglas (Abbildung 4B) entfernt Proper Stanzen ergibt sich eine scharfe, klare Proteinmuster, die durch Anwendung von fluoreszenzmarkierten Protein (Abb. 3 und 5) sichtbar gemacht werden können. Alternativ kann die Immunhistochemie verwendet werden, um das Proteinmuster nach Zellfixierung (Abbildung 6) zu visualisieren. Das Wachstum der Zellen ist gut mit dem Protein-Muster für beide immortalisierten Zelllinien und Primärzellen (Abbildungen 5 und 6) beschränkt. Während diese Technik leicht zu beherrschen ist, können mehrere gemeinsame Probleme auftreten. Die Anwendung von Protein ohne ausreichende Durchmischung der konzentrierten Proteinlösung in die DPBS kann zu einer ungleichmäßigen Protein-Muster (Abb. 7A) führen. Unsachgemäße Stanzen kann zu einer teilweisen Pattern-Transfer oder Stempel Zusammenbruch (7B-C) führen. Darüber hinaus Freilegung der strukturierten Substrat mit adsorbiertem Protein an der Luft der Monoschicht verursachen verringerte Widerstand in den Hintergrund (Abbildung 7D) stören können. Patterns von sehr kleinen Features (&lt;5 um) und hohen Aspektverhältnissen umfasste erfordern oft den Einsatz von getauchten Mikrokontaktdrucken. In diesem Verfahren (3.5b) Wasser als Barriere zur Verhinderung von Ablagerungen auf dem Substrat außerhalb der Muster (Abbildung 8) Hexadecanthiol verwendet. 14

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	<li>Wilbur, J., Kumar, A., Biebuyck, H., Kim, E., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing+of+self-assembled+monolayers:+Applications+in+microfabrication.">Microcontact printing of self-assembled monolayers: Applications in microfabrication.</a> Nanotechnology. 7, 452-457 (1996).</li><li>Chang, J., Brewer, G., Wheeler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+microstamping+technique+enhances+polylysine+transfer+and+neuronal+cell+patterning.">A modified microstamping technique enhances polylysine transfer and neuronal cell patterning.</a> Biomaterials. 24, 2863-2870 (2003).</li><li>Lange, S., Benes, V., Kern, D., Horber, J., Bernard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing+of+DNA+molecules.">Microcontact printing of DNA molecules.</a> Analytical Chemistry. , 1641-1647 (2004).</li><li>Xia, Y., Mrksich, M., Kim, E., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing+of+octadecylsiloxane+on+the+surface+of+silicon+dioxide+and+its+application+in+microfabrication.">Microcontact printing of octadecylsiloxane on the surface of silicon dioxide and its application in microfabrication.</a> J. 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Am. Chem. Soc. , 8916-8920 (1997).</li><li>Hanson, E., Schwartz, J., Nickel, B., Koch, N., Danisman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bonding+self-assembled,+compact+organophosphonate+monolayers+to+the+native+oxide+surface+of+silicon.">Bonding self-assembled, compact organophosphonate monolayers to the native oxide surface of silicon.</a> J. Am. Chem. Soc. , 16074-16080 (2003).</li><li>Johannes, M., Cole, D., Clark, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscope+based+nanofabrication+of+master+pattern+molds+for+use+in+soft+lithography.">Atomic force microscope based nanofabrication of master pattern molds for use in soft lithography.</a> Applied Physics Letters. , (2007).</li><li>Bessueille, F., Pla-Roca, M., Mills, C. A., Martinez, E., Samitier, J., Errachid, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submerged+microcontact+printing+(S&#x03BC;CP):+An+unconventional+printing+technique+of+thiols+using+high+aspect+ratio,+elastomeric+stamps.">Submerged microcontact printing (S&#x03BC;CP): An unconventional printing technique of thiols using high aspect ratio, elastomeric stamps.</a> Langmuir. , 12060-12063 (2005).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+microcontact+printing+as+a+microlithographic+technique.">Extending microcontact printing as a microlithographic technique.</a> Langmuir. , 2059-2067 (1997).</li><li>Biasco, A., Pisignano, D., Krebs, B., Pompa, P. P., Persano, L., Cingolani, R., Rinaldi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+of+microcontact-printed+proteins+by+atomic+force+miroscopy+molecular+sizing.">Conformation of microcontact-printed proteins by atomic force miroscopy molecular sizing.</a> Langmuir. , 5154-5158 (2005).</li><li>Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing+of+proteins+for+cell+biology.">Microcontact printing of proteins for cell biology.</a> J Vis Exp. 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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Eine Reihe von Fragen kann in die lithographische Herstellung des Masters für PDMS-Stempel-Erstellung verwendet entstehen. Unterbelichtung der Resist beschichteten Wafer Ergebnisse in verschwommen und undeutlich Muster und Überbelichtung der Resist beschichteten Wafer Ergebnisse in einer vergrößerten oder fehlende Funktionen. Im Allgemeinen sind die Meister mit großen Strukturgrößen (&gt; 10 um) relativ leicht zu Muster und entwickeln, während Meister mit kleineren bietet umfangreiche Optimierung der Photostrukt...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Silizium-Wafer </td><td> Wafer Reclaim Dienstleistungen </td><td></td><td> 2 Zoll </td></tr><tr><td> Spin Coater / Heizplatte </td><td> Brewer Science </td><td> Cee 200CB Spin-Bake-System </td><td></td></tr><tr><td> AZ9245 Fotolack </td><td> Mays Chemical Company </td><td> 105880034-1160 </td><td></td></tr><tr><td> Direct-schreiben Photolithographie-System </td><td> Microtech srl </td><td> LW325 LaserWriter-System </td><td></td></tr><tr><td> Mask Aligner </td><td> HTG </td><td> 3HR </td><td></td></tr><tr><td> AZ 400K Entwickler </td><td> Mays Chemical Company </td><td> 105880018-1160 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 182 Silikon-Elastomer-Kit </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 25 mm nicht. 1 Runde Deckgläser </td><td> VWR </td><td> 16004-310 </td><td></td></tr><tr><td> Plasma Oxidizer </td><td> Diener </td><td> Femto </td><td></td></tr><tr><td> Titanium Stücke Kamis </td><td> Incorporated </td><td></td><td> 99,95% reinem </td></tr><tr><td> Gold-Pellets </td><td> Kamis Incorporated </td><td></td><td> 99,999% reines </td></tr><tr><td> Elektronenstrahl-Verdampfer </td><td> Kurt J. Lesker </td><td> PVD 75 Thin Film Deposition System </td><td> mit Elektronenstrahl-Zubehör </td></tr><tr><td> Hexadecanthiol </td><td> Alfa Aesar </td><td> A11362 </td><td></td></tr><tr><td> 1-mercaptoundec-11-yl) Tetra (Ethylenglykol) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 674508 </td><td></td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Pharmco-aaper </td><td> 111000200 </td><td> 200 Proof, absolute </td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> VWR </td><td> 52858-000 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> VWR </td><td> 4500-434 </td><td> Ohne Kalzium und Magnesium </td></tr><tr><td> Maus Laminin I </td><td> VWR </td><td> 95036-762 </td><td></td></tr><tr><td> Humanem Plasma Fibronectin </td><td> Invitrogen </td><td> 33016-015 </td><td></td></tr><tr><td> AlexaFluor ® 647 Carbonsäure, Succinimidylester </td><td> Invitrogen </td><td> A-20006 </td><td></td></tr><tr><td> MitoTracker Red 580 </td><td> Invitrogen </td><td> M22425 </td><td></td></tr><tr><td> AlexaFluor ® 350 Carbonsäure, Succinimidylester </td><td> Invitrogen </td><td> A-10168 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Laminin-Antikörper </td><td> Fisher Scientific </td><td> AB2034MI </td><td></td></tr></tbody></table>

creating two-dimensional patterned substrates for protein and cell confinement

Mikrokontaktdruck bietet eine schnelle, reproduzierbare Methode für die Schaffung von gut definierten Muster Substraten. 1 Während Mikrokontaktdrucken kann zur direkten Drucken einer großen Anzahl von Molekülen, einschließlich Proteinen, 2 DNA, 3 und Silane, 4 die Bildung von Selbst zu sein Monoschichten (SAMs) aus langkettigen Alkan Thiolen auf Gold bietet eine einfache Möglichkeit, um Proteine ​​und Zellen in bestimmten Mustern mit Klebstoff und beständig Regionen beschränken. Diese Beschränkung kann zur Zellmorphologie zu kontrollieren und ist nützlich für die Prüfung einer Vielzahl von Fragen in Protein-und Zellbiologie. Hier beschreiben wir ein allgemeines Verfahren für die Schaffung von gut definierten Protein-Muster für die zelluläre Studien 5 Dieser Prozess umfasst drei Schritte:. Die Herstellung eines gemusterten Master mittels Photolithographie, die Schaffung eines PDMS-Stempel und Mikrokontaktdrucken einer Gold- beschichteten Substrat. Sobald gemustert, sind diese Zellkultursubstraten der Lage beschränken Proteine ​​und / oder Zellen (primäre Zellen oder Zelllinien), um das Muster. Der Einsatz von selbstorganisierten Monoschicht Chemie ermöglicht eine präzise Kontrolle über die strukturierte Protein / zelladhäsive Regionen und nicht klebend Regionen, dies kann nicht erreicht werden durch direkte Protein Stanzen werden. Hexadecanthiol, die lange Kette Alkanthiol in der Mikrokontaktdrucken Schritt verwendet, erzeugt eine hydrophobe Oberfläche, die leicht adsorbiert Protein aus der Lösung. Der Glykol-terminierten Thiol, zur Verfüllung der nicht bedruckten Bereichen des Substrats verwendet, schafft eine Monoschicht, die resistent gegen Proteinadsorption und damit das Zellwachstum ist. 6 Diese Thiol Monomere produzieren stark strukturierten Monolagen, die genau definieren Bereiche des Substrats, die unterstützen können Proteinadsorption und Zellwachstum. Als Ergebnis werden diese Substrate für eine Vielzahl von Anwendungen nützlich aus dem Studium der interzellulären Verhalten 7 zur Erstellung der Mikroelektronik. 8 Obgleich auch andere Arten von Mono-Chemie für Zellkultur-Studien, darunter Arbeiten aus unserer Gruppe mit Trichlorsilanen um Muster direkt auf Glassubstraten erstellen verwendet wurden, sind 9 gemusterten Monoschichten aus Alkan Thiolen auf Gold gebildet geradlinig, sich vorzubereiten. Darüber hinaus sind die Monomere für Monoschicht Präparation im Handel erhältlich, stabil und erfordern keine Lagerung oder Handhabung unter einer inerten Atmosphäre. Gemusterte Substrate aus Alkanthiole vorbereitet können auch recycelt und mehrfach wiederverwendet werden, die Aufrechterhaltung Zelle Gefangenschaft. 10

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Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Selbstorganisierte Monoschichten (SAMs) aus langkettigen Alkan Thiolen auf Gold gebildet ist gut definierten Substraten für die Bildung von Protein-Muster-und Zell-Entbindung. Mikrokontaktdruck von Hexadecanthiol mit einem Polydimethylsiloxan (PDMS)-Stempel durch Verfüllung mit folgten einem Glykol-terminierte Alkanthiol Monomer erzeugt ein Muster, bei dem Protein und Zellen adsorbieren nur den Stempel Hexadecanthiol Region.

Erstellen Zweidimensionale Patterned Substrate für Protein-und Zell-Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

creating-two-dimensional-patterned-substrates-for-protein-cell

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JoVE Journal

Bioengineering

12.5K Aufrufe.  Washington University in St. Louis. Selbstorganisierte Monoschichten (SAMs) aus langkettigen Alkan Thiolen auf Gold gebildet ist gut definierten Substraten für die Bildung von Protein-Muster-und Zell-Entbindung. Mikrokontaktdruck von Hexadecanthiol mit einem Polydimethylsiloxan (PDMS)-Stempel durch Verfüllung mit folgten einem Glykol-terminierte Alkanthiol Monomer erzeugt ein Muster, bei dem Protein und Zellen adsorbieren nur den Stempel Hexadecanthiol Region.

Serie: Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Creating Transient Cell Membrane Pores Using a Standard Inkjet Printer

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor microfabrication.1-10 Recently, thermal inkjet printing has also been used for gene transfection.8,9 The thermal inkjet printing process was shown to temporarily disrupt the cell membranes without affecting cell viability. The transient pores in the membrane can be used to introduce molecules, which would otherwise be too large to pass through the membrane, into the cell cytoplasm.8,9,11
The application being demonstrated here is the use of thermal inkjet printing for the incorporation of fluorescently labeled g-actin monomers into cells. The advantage of using thermal ink-jet printing to inject molecules into cells is that the technique is relatively benign to cells.8, 12 Cell viability after printing has been shown to be similar to standard cell plating methods1,8. In addition, inkjet printing can process thousands of cells in minutes, which is much faster than manual microinjection. The pores created by printing have been shown to close within about two hours. However, there is a limit to the size of the pore created (~10 nm) with this printing technique, which limits the technique to injecting cells with small proteins and/or particles. 8,9,11
A standard HP DeskJet 500 printer was modified to allow for cell printing.3, 5, 8 The cover of the printer was removed and the paper feed mechanism was bypassed using a mechanical lever. A stage was created to allow for placement of microscope slides and coverslips directly under the print head. Ink cartridges were opened, the ink was removed and they were cleaned prior to use with cells. The printing pattern was created using standard drawing software, which then controlled the printer through a simple print command. 3T3 fibroblasts were grown to confluence, trypsinized, and then resuspended into phosphate buffered saline with soluble fluorescently labeled g-actin monomers. The cell suspension was pipetted into the ink cartridge and lines of cells were printed onto glass microscope cover slips. The live cells were imaged using fluorescence microscopy and actin was found throughout the cytoplasm. Incorporation of fluorescent actin into the cell allows for imaging of short-time cytoskeletal dynamics and is useful for a wide range of applications.13-15

A description of the methods used to convert an HP DeskJet 500 printer into a bioprinter. The printer is capable of processing living cells, which causes transient pores in the membrane. These pores can be utilized to incorporate small molecules, including fluorescent G-actin, into the printed cells.

Erstellen Transient Zelle Membranporen Mit einem Standard-Inkjet-Drucker

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor ...

Forschung

Biotechnik

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Erstellen Adhesive und löslichen Farbverläufe for Imaging Cell Migration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

Musterbildung auf Photolithographische Definierte Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrate

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

Bestellen Einzelzellen und Einzel Embryos in 3D Confinement: Ein neues Gerät für High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

Fluorescence Recovery nach der Zusammenführung ein Droplet, um die zweidimensionale Diffusion eines Phospholipidschicht Messen

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a large area of nanopatterned substrate is desirable so that enough cells can be cultured on the nanotopography for subsequent biochemical and molecular biology analyses. However, current nanofabrication techniques have limitations to generate highly defined nanopatterns over a large area. Herein, we present a method to expand nanopatterned substrates from a small, highly defined nanopattern to a large area using stitch technique. The method combines multiple techniques, involving soft lithography to replicate poly(dimethylsiloxane) (PDMS) molds from a well-defined mold, stitch technique to assemble multiple PDMS molds to a single large mold, and nanoimprinting to generate a master mold on polystyrene (PS) substrates. With the PS master mold, we produce PDMS working substrates and demonstrate nanotopographical modulation of cell spreading. This method provides a simple, affordable yet versatile avenue to generate well-defined nanopatterns over large areas, and is potentially extended to create micro-/nanoscale devices with hybrid components.

A protocol for producing a large area of nanopatterned substrate from small nanopatterned molds for study of nanotopographical modulation of cell behavior is presented.

Der Ausbau nano Substraten Stichtechnik für Nanotopographical Modulation des Zellverhaltens

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a ...

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. Both forms can be prepared with the same type I collagen. In general, the non-fibrous form promotes cell adhesion and proliferation. The fibril form (gels) provides more physiological conditions in many types of cells; therefore, gel culture is useful for examining physiological behaviors of cells, such as drug efficacy.
Researchers can select the appropriate form according to the purpose of its use. For example, in the case of keratinocytes, on-gel culture has been used as a wound healing model. FEPE1L-8, a keratinocyte cell line cultured on the non-fibrous form of type I collagen, promote cell adhesion. Notably, keratinocyte proliferation is slower on the fibril form than the non-fibrous form. Protocols for the preparation of type I collagen for cell culture are simple and have wide applications depending on the experimental needs.

Here, we present a protocol for the preparation of two different forms of culture substrates utilizing type I collagen. Depending on how collagen is handled, collagen molecules either maintain two-dimensional, non-fibrous form or reassemble into three-dimensional, fibril form. Cell proliferation on type I collagen is drastically affected by fibril formation.

Bewertung der Keratinozyten Verbreitung auf zwei- und dreidimensionale Typ I Kollagen Substrate

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that correspond to primary germ layer formation during embryogenesis. Thus, these cells represent a powerful tool with which to examine the mechanisms that drive early human development. We have developed a method to culture human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates that provides control over both the geometry of the colonies and their mechanical environment in order to recapitulate the physical parameters that underlie embryogenesis. The key feature of this method is the ability to generate polyacrylamide hydrogels with defined patterns of extracellular matrix ligand at the surface to promote cell attachment. This is achieved by fabricating stencils with the desired geometric patterns, using these stencils to create patterns of extracellular matrix ligand on glass coverslips, and transferring these patterns to polyacrylamide hydrogels during polymerization. This method is also compatible with traction force microscopy, allowing the user to measure and map the distribution of cell-generated forces within the confined colonies. In combination with standard biochemical assays, these measurements can be used to examine the role mechanical cues play in fate specification and morphogenesis during early human development.

Extracellular matrix ligands can be patterned onto polyacrylamide hydrogels to enable the culture of human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates. This method can be combined with traction force microscopy and biochemical assays to examine the interplay between tissue geometry, cell-generated forces, and fate specification.

Musterung der Geometrie menschlicher embryonaler Stammzellkolonien auf konformen Substraten zur Kontrolle der Gewebe-Level-Mechanik

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell mimicking environment. Furthermore, the development of cell-free expression systems has demonstrated the ability to reconstitute the protein production, transcription and translation processes (DNA&#8594;RNA&#8594;protein) in a controlled manner, harnessing synthetic biology. Here we describe a protocol for preparing a cell-free expression system, including the production of a potent bacterial lysate and encapsulating this lysate inside cholesterol-rich lipid-based giant unilamellar vesicles (GUVs) (i.e., stable liposomes), to form synthetic cells. The protocol describes the methods for preparing the components of the synthetic cells including the production of active bacterial lysates, followed by a detailed step-by-step preparation of the synthetic cells based on a water-in-oil emulsion transfer method. These facilitate the production of millions of synthetic cells in a simple and affordable manner with a high versatility for producing different types of proteins. The obtained synthetic cells can be used to investigate protein/RNA production and activity in an isolated environment, in directed evolution, and also as a controlled drug delivery platform for on-demand production of therapeutic proteins inside the body.

This protocol describes the method, materials, equipment and steps for bottom-up preparation of RNA and protein producing synthetic cells. The inner aqueous compartment of the synthetic cells contained the S30 bacterial lysate encapsulated within a lipid bilayer (i.e., stable liposomes), using a water-in-oil emulsion transfer method.

Herstellung von Proteinproduktion synthetischer Zellen mit zellfreien bakteriellen Extrakten, Liposomen und Emulsionstransfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. It has been used in a wide range of biophysical and molecular biological experiments, including the measurement of molecular forces, characterization of conformational dynamics of biomolecules, observation of intracellular colocalization of proteins, and determination of receptor-ligand interaction times. In a widefield microscopy configuration, experiments are typically performed using surface-immobilized probes. Here, a method combining single-molecule tracking with alternating excitation (ALEX) smFRET experiments is presented, permitting the acquisition of smFRET time traces of surface-bound, yet mobile probes in plasma membranes or glass-supported lipid bilayers. For the analysis of recorded data, an automated, open-source software collection was developed supporting (i) the localization of fluorescent signals, (ii) single-particle tracking, (iii) determination of FRET-related quantities including correction factors, (iv) stringent verification of smFRET traces, and (v) intuitive presentation of the results. The generated data can conveniently be used as input for further exploration via specialized software, e.g., for the assessment of the diffusional behavior of probes or the investigation of FRET transitions.

This article presents a method for spatiotemporal analysis of mobile, single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET)-based probes using widefield fluorescence microscopy. The newly developed software toolkit allows the determination of smFRET time traces of moving probes, including the correct FRET efficiency and the molecular positions, as functions of time.

Automatisierte zweidimensionale raumzeitliche Analyse mobiler Einzelmolekül-FRET-Sonden

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. ...