Mischen Sie zunächst Wasser, 10-fach konzentriertes PBS und ein molares Natriumhydroxid in einem Röhrchen. Als nächstes pipettieren Sie 500 Mikroliter der entsprechend dichten Hautzelllösungen in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 300 g drei Minuten lang bei Raumtemperatur.
Sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist, pipettieren Sie den Überstand heraus und resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig in einer Mischung aus Wasser, PBS und Natriumhydroxid. Geben Sie nun 200 Mikroliter der Kollagenlösung in die Mischung. Pipettieren Sie die Suspension, um sie gut zu vermischen.
Pipettieren Sie anschließend 500 Mikroliter der vorbereiteten Mischung in einen Einsatz in einer 24-Well-Platte. Pipettieren Sie für ein Modell ohne Stratum corneum 500 Mikroliter der Mischung in eine Vertiefung ohne Einsatz. Nachdem Sie die Platte 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert haben, stellen Sie sie für 30 Minuten in einen Inkubator.
Pipettieren Sie 500 Mikroliter PBS in jede Vertiefung, um die Hydrogeloberfläche zu spülen. Mischen Sie anschließend 200 Mikroliter der Keratinozytensuspension mit einem gleichen Volumen Melanozytensuspension in dem supplementierten DMEM-Medium. Pipettieren Sie vorsichtig 500 Mikroliter der gesamten Zellsuspension in jede Vertiefung.
Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius für zwei bis fünf Tage. Tauschen Sie das Medium alle 48 Stunden aus und verwenden Sie ein optisches Mikroskop, um das Zellwachstum zu überwachen. Es wurde ein äquivalentes 3D-Modell mit unterscheidbarer Dermis und Epidermis erstellt, das in Echtzeit überwacht werden konnte.
Es wurden Keratinozyten in verschiedenen Stadien des Zellwachstums beobachtet, die Indikatoren für ein lebendes Äquivalent sind. Es wurden auch Mastzellen mit erkennbaren Granulaten gesehen.