Preparation of FFPE DNA and RNA Samples for Sequencing Using an Automated Purification Instrument (API)

Schneiden Sie zunächst die formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten oder FFPE-DNA- und RNA-Proben ab. Schalten Sie das automatische Reinigungs- oder API-Instrument ein und melden Sie sich mit dem Benutzernamen und dem Kennwort an. Klicken Sie anschließend in der Integrated Genomic Viewer-Software unter "Proben" auf "Proben erstellen", geben Sie den Probennamen ein und wählen Sie die Anwendungskategorie aus.

Nachdem Sie die Probendetails eingegeben haben, klicken Sie auf Speichern"Wählen Sie dann Läufe"Klicken Sie auf Probe bis zum Ergebnis" und geben Sie den Namen des Laufs ein, bevor Sie auf "Weiter" klicken"Wählen Sie den Assay gefolgt von einer gewünschten Probe aus und klicken Sie auf Weiter"Nachdem Sie jede Probe ausgewählt haben, klicken Sie auf Zuweisen", überprüfen Sie dann die Elutionsparameter und speichern Sie den Lauf. Platzieren Sie FFPE-Gewebeproben und Probenverarbeitungsröhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen eine Minute lang bei 2.000 g.

Geben Sie den Protease Digest Mastermix, der aus einem Nukleinsäure-Reinigungskit hergestellt wurde, in das Röhrchen. Inkubieren Sie die Probe eine Stunde lang bei 60 Grad Celsius und anschließend eine Stunde lang bei 90 Grad Celsius. Nach dem Abkühlen der Proben heben Sie das Innenrohr des Probenbehandlungsröhrchens an und verriegeln es durch Drehen nach links.

Zentrifugieren Sie das Innenröhrchen 10 Minuten lang bei 2.000 g. Entriegeln Sie dann die Röhre, indem Sie sie nach rechts drehen und von der anderen Röhre trennen. Entsorgen Sie den Innenschlauch und legen Sie den Außenschlauch auf Eis, bis er auf den Wirkstoff geladen wird.

Bereiten Sie eine Mastermischung für den DNA-Aufschluss vor und legen Sie sie in die vorgefüllte FFPE-DNA- und RNA-Aufreinigungsplatte zwei. Laden Sie die vorbereiteten Proben in die erste FFPE-DNA- und RNA-Aufreinigungsplatte. Klicken Sie auf dem API-Bildschirm auf "Ausführen", wählen Sie dann den Ausführungsplan aus und klicken Sie auf "Weiter"Befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm, um die erforderlichen Verbrauchsmaterialien und Reagenzien für den Reinigungslauf zu laden.

Sobald alle Reagenzien geladen sind, klicken Sie auf Weiter, schließen Sie die API-Tür und klicken Sie auf Start, klicken Sie am Ende des Laufs auf Entladen, und entfernen Sie sofort die 48-Well-Nukleinsäure-Archivplatte mit der gereinigten DNA und RNA. Nach Beendigung der Probenreinigung versiegeln Sie die Platte und lagern sie bei minus 80 Grad Celsius.