Mikrobiota-Analyse mit zweistufiger PCR- und 16S-rRNA-Gensequenzierung der nächsten Generation

Die Profilierung von Mikrobiom ist der erste Schritt zur Definition der Rolle des Mikrobioms bei Gesundheit und Krankheit. Hier beschreiben wir ein einfaches Verfahren zur Isolierung hochwertiger bakterieller DNA aus der Fäkalprobenvorbereitungsbibliothek, die 16SR-RNA und eine metagenomische Sequenzierung und Mikrobiom-Datenanalyse durchführt. Dieses Protokoll wird Forschern, die neu im Mikrobiombereich sind, sowie Forschern, die im Bereich des Mikrobioms arbeiten, bei der Einrichtung der Mikrobiom-Pipeline in ihrem Labor helfen. Dieses Protokoll kann für die Profilierung von Mikrobiomen aus anderen Bio-Proben wie Nasen-, Mund- oder Hautproben von tierischen und menschlichen Probanden erweitert werden. Die Perlenauswahl ist der wichtigste Schritt, da alle nachgelagerten Schritte von hochwertiger DNA abhängen. Eine ordnungsgemäße Abdichtung der Konservenplatte ist wichtig, da eine unvollständige Versiegelung zur Unterdrückung des verstärkten Produkts führen kann, was zu datenniedrigen Sequenzierungsdaten von geringer Qualität führt. Zunächst die Trennkästen mit 70% Ethanol sterilisieren. Legen Sie die Mäuse in sterilisierte Trennkästen und lassen Sie sie normal für bis zu einer Stunde defäkieren. Verwenden Sie sterile Zangen, um die Fäkalienpellets in einem leeren voretikettierten 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr zu sammeln. Schließen Sie das Rohr sicher ein. Sterilisieren Sie die Zange mit 70% Ethanol, gefolgt von einem keimtötenden Einwegtücher, nachdem fäkal von jeder Maus gesammelt wurde. Wiegen Sie 200 Milligramm Fäkalienpellets in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr mit 0,1 Milliliter Glasperlen und legen Sie das Perlenrohr in einen Perlenschlaghomogenisator und homogenisieren Sie die Proben 45 Sekunden lang bei Raumtemperatur bei einer Geschwindigkeit von 4,5 Metern pro Sekunde. Extrahieren Sie DNA gemäß den Anweisungen des Kit-Herstellers und elute DNA in einem 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr. Nach der Isolierung der DNA, quantifizieren Sie die isolierte DNA durch Laden 1 Mikroliter der DNA auf einem Fluorometer. Einrichtung 16S ribosomale RNA-Genverstärkung PCR1 in einer 96-Well PCR-Platte mit einem Reaktionsvolumen von 25 Mikrolitern. Mit einer Mehrkanal-Pipette, fügen Sie 40 Nano Gramm DNA, 13,5 Mikroliter 2X High-Fidelity-Polymerase-Enzym-Mix, enthält Puffer, plus DNTPs in Vorwärts- und Reverse-Primer. Versiegeln Sie die PCR-Platte entlang aller vier Kanten ordnungsgemäß von oben nach unten. Und Zentrifuge bei 1000 mal G bei 20