Wir danken für die Unterstützung von der Chemical Sciences, Geosciences and Biosciences Division, Office of Basic Energy Sciences, Office of Science, US Department of Energy (Vergabe-Nummer DE-FG02-91ER20021) und der National Science Foundation (MCB 0948584) (FB). Wir sind dankbar, dass Frau Karen Vogel für die Bearbeitung des Manuskripts.

1. EMS-Behandlung Arabidopsis thaliana Samen werden mit mutagenisiert als Mutagen Ethylmethansulfonat Mittel (EMS) 3,4, die in das Genom C-zu-T-Änderungen, die sich in C / G, T / A-Mutationen 5-7 induziert. <ol><li> 0,8 g wiegen Arabidopsis Samen (~ 40.000 Samen), die den fluoreszierenden Marker Organellen (insbesondere die in dieser Studie ssGFPHDEL (Signalsequenz-GFP-Tetrapeptid HDEL) wurde als ein ER-Marker verwendet wurden). </li><li> Übertragen Sie die Samen in einem 50-ml-Falcon-Röhrchen, dann 25 ml destilliertem Wasser. </li><li> 0,2% (v / v) Ethylmethansulfonat. </li><li> Inkubieren Sie für 16 Stunden auf Taumelmischer bei niedrigen Drehzahlen. </li><li> Absaugen der Flüssigkeit und verwerfen in einen Kolben mit 1,0 M NaOH, um den EMS zu inaktivieren. </li><li> 25 ml Wasser auf das Falcon-Röhrchen mit den Samen, in der Nähe, und 5 Mal umdrehen, um die Samen zu waschen; warten, bis alle Samen niedergelassen haben, dann saugen das Wasser und in der 1,0 M Na verwerfen<html> OH-Kolben. </li><li> Wiederholen der Wasch-Schritt bis zu 10 mal. </li><li> Nach dem letzten Waschen, erneut zu suspendieren die Samen in einer minimalen Menge Wasser. </li><li> Gehen Sie zur Sterilisation Samen Zugabe von 25 ml 10% Bleichmittel, kräftig schütteln, 30 s. Lassen Samen zu Boden absetzen, dann abgießen Bleichmittel und spülen mit 25 ml sterilem Wasser. Abgießen, sterilem Wasser und 25 ml 70% Ethanol. Schütteln Röhrchen für 30 s. Lassen Samen zu Boden absetzen. Abgießen und Ethanol spülen mit 25 ml sterilem Wasser. Wiederholen Sie die Wäsche zweimal mit sterilem Wasser, dann gießen Samen auf einer Kunststoff-Petrischale mit 3 MM Filterpapier und lassen unter der Haube trocknen. Lagerung bei 4 ° C für 2 Tage. </li><li> Tafel die Samen auf S MS Phytagel (halbe Konzentration von Murashige und Skoog-Medium), 150-mm-Petrischale (~ 250-300 Samen für die Platte). </li><li> Wachsen M1 Samen auf Platte für 2 Wochen, dann in den Boden zu verpflanzen. </li><li> Sammle M2 Samen von einzelnen Pflanzen M1 bis M2 Linien (1000 unabhängige Linien) zu generieren. </li></ol>ove_title &quot;&gt; 2. Konfokale Screening von M2 und M3 Populationen In diesem Abschnitt beschreiben wir die Beobachtung von Sämlingen mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop oder wie oben beschrieben 8. <ol><li> Sechzig Samen aus jeder Linie M2 sind für 7 bis 10 Tagen auf Kunststoff-Petrischalen, ½ MS Phytagel gewachsen, auf der gleichen Platte sind auch 5 Sämlinge gewachsen EMS-unbehandelten (Kontrolle). </li><li> Fünf bis zehn Cotyledonen mit der unterseitigen Seite in Richtung der Linse (40X) auf einem Objektträger montiert und mit einem Deckglas eingeschlossen. </li><li> Jedes Keimblatt beobachtet wird, von der kortikalen zu medialen Bereich, unter Fluoreszenz für jede veränderte subzelluläre Verteilung der Organellen-Marker. </li><li> Positiv Pflanzen werden in Erde und ihre Samen werden gesammelt und erneut, um den mutierten Phänotyp in der M3-Generation bestätigen gescreent. </li><li> Entfernen Sie die verunreinigende Hintergrund Mutationen durch Rückkreuzung mindestens dreimal zu einem Wildtyp-Genom gegebenenfalls COntaining die gewünschte Organelle fluoreszierenden Marker. <ol><li> Von der Mutterpflanze, mit einer feinen Schere oder Zange entfernen reifen Schoten und offenen Blüten. </li><li> Entfernen Sie die Knospen, die zu klein sind aus dem Meristem. </li><li> Legen Sie die Spitze von einem Pinzette zwischen Kelch-und Blütenblätter auf eine Knospe öffnen und entfernen Sie alle Antheren. </li><li> Mit einem Zange nehmen eine offene reifen Blume aus dem Vater-Anlage und reiben Sie die Antheren auf die Narbe der Pflanze entmannt. </li></ol></li></ol> 3. Mapping Dieser Abschnitt beschreibt, wie man Wesentlichen eine rezessive Mutation unter Verwendung eines modifizierten Protokolls von Borevitz 9 schneller, wenn die traditionellen Mapping-Verfahren im Vergleich 10,11 abzubilden. Dieser Ansatz verwenden high-density Oligonukleotid-Arrays mit der Fähigkeit, zahlreiche Einzel-Merkmal-Polymorphismen (SFP) in einem einzigen Assay 12 zu erfassen. Mit dem Affymetrix GeneChip Arabidopsis ATH1 Array ist möglich,analysieren rund 24.000 Gene. Ein Pool von F 2-Individuen, welche die Mutation wird auf einen Pool von Wildtyp-F 2-Pflanzen innerhalb der gleichen Trennung Bevölkerung gesammelt verglichen. Dann wird die Mutation in dem Bereich, wo die Mutanten-Pool für mutierten Genotyp Allele angereichert zugeordnet wird, und folglich in der gleichen Region der Wildtyp-Pool wird führen angereichert für die Wildtyp-Eltern-Allele 13. <ol><li> Genomische DNA (3 ug) von der Columbia homozygoten mutanten (M3) unter Verwendung eines Qiagen DNeasy Plant Mini Kit extrahiert und für Illumina Genome Analyzer II (GA II) 14 Sequenzierung unterzogen. </li><li> Der homozygote Mutante Columbia (M3) mit Landsberg erecta gekreuzt, um eine Zuordnung Bevölkerung zu schaffen. </li><li> Die Darstellung wird auf 70 bis 100 F2 Individuen mit dem aberranten Phänotyp und die gleiche Anzahl von F 2-Pflanzen mit einem Wildtyp-Phänotyp durchgeführt. </li><li> Sammle von jeder Pflanze ein Blatt Disc (0,60 mm) mit einem Locher. DieBlattscheiben sollte aus den Blättern des gleichen Alters gesammelt werden, um sicher sein, ähnliche Mengen an DNA zu haben. Die Proben können für die genomische Extraktion einzeln oder in Gruppen bearbeitet werden. In diesem Fall ist es möglich, zu 5-10 Proben für jede Eppendorf-Röhrchen zu sammeln, um am Ende wird es weniger Eppendorf-Röhrchen aus dem genomischen DNA extrahiert werden muss haben. </li><li> MasterPure Pflanze Blatt DNA Purification Kit (Epicentre) verwendet wird, um die genomische DNA zu extrahieren. Die genomische DNA von jeder Probe erhalten wird mit einem Nano-Drop quantifiziert. </li><li> Die gleiche Menge an genomischer DNA aus jeder Probe wird dann zusammen bis zu einem Gesamtbetrag von 300 ng (~ 30 ul) von Pflanzen-DNA; mit 60 ul 2,5 X zufälliger Primer-Lösung [125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 12,5 mM MgCl2, 25 mM 2-Mercaptoethanol, 750 ug / ml Oligodesoxyribonukleotid Primer (random Octamere)] (BioPrime Kit) und 42 ul Wasser (Endvolumen 132 ul). </li><li> Denaturieren DNAs bei&gt; 95 ° C für 5 bis 10 min. </li><li> Auf Eis abgekühlt. </li><li> Zu jedem Denaturierungroten DNA hinzuzufügen 15 ul 10X dNTPs Mischung mit Biotin dCTP [1 mM Biotin-14-dCTP, 1 mM dCTP, 2 mM dATP, 2 mM dGTP, dTTP 2 mM in 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM Na2EDTA] (BioPrime Kit), und mit 3 ul Klenow-Polymerase (BioPrime Kit) abzuschließen. </li><li> Inkubieren über Nacht bei 25 ° C. </li><li> Am folgenden Tag, fügen Sie 15 ul 3 M NaOAc und 400 ul kaltem 100% EtOH und mischt. </li><li> Inkubation bei -80 ° C für 1 Stunde, dann bei 20.500 xg für 15 min zu spinnen, zu entfernen Überstand und wäscht mit 500 ul kaltem 75% EtOH. </li><li> Zentrifugieren bei 20.500 xg für 10 min. </li><li> Chemische DNA-Pellets bei 37 ° C für 10 min und Resuspension in 100 ul Wasser. </li><li> Verwenden Sie 5 ul auf Ertrag und Qualität auf einem Gel (Abbildung 2) zu überprüfen. </li><li> Senden Sie 95 ul der Kennzeichnung Reaktion für die Wildtyp und Mutante für GeneChip Arabidopsis ATH1 Genome Array-Hybridisierung. </li><li> Die Arrays werden gescannt und die. CEL-Dateien erhalten werden mittels R-Software ( <a href="http://www.r-project.org/">http://www.r-project.o</a>rg /). </li><li> Installieren Sie R-Software, dann öffnen Sie das Programm und fügen Sie die folgende Zeichenfolge ein: Quelle (&quot; <a href="http://bioconductor.org/biocLite.R">http://bioconductor.org/biocLite.R</a> &quot;) biocLite () Drücken Sie dann die Return-Taste-das wird die Standard-Pakete Bioconductor (installieren <a href="http://www.bioconductor.org">http://www.bioconductor.org</a> ). </li><li> In einem neuen Ordner auf Ihrem Desktop, von der folgenden Website (Download <a href="http://www.naturalvariation.org/methods">http://www.naturalvariation.org/methods</a> ) die Dateien: readcel.R SFP.R Map.R ath1V5.RData ColLerCEL.zip Die Datei ColLerCEL.zip sollten ausgepackt und die resultierenden Dateien in Ihrem neuen Ordner eingefügt. </li><li> Benennen Sie die Daten aus Ihrer GeneChip Experiment in wildtype.CEL und mutant.CEL erhalten. </li><li> Kopieren Sie nun Ihre Daten GeneChip (wildtype.CEL undmutant.CEL) in Ihrem Ordner. </li><li> Open-R, a) für Mac: Klicken Sie auf &quot;Misc&quot;, und klicken Sie dann auf &quot;Change Arbeitsverzeichnis.&quot; b) für PC: Klicken Sie auf &quot;Datei&quot; dann &quot;Verzeichnis wechseln&quot; </li><li> a) für Mac: Wählen Sie den Ordner mit den Dateien. Klicken Sie auf &quot;Workspace&quot;, &quot;Load Workspace-Datei&quot; und wählen Sie ath1V5.RData, b) für PC: Wählen Sie den Ordner mit den Dateien, die oben, klicken Sie auf &quot;Datei&quot;, dann &quot;Load Workspace&quot; und wählen Sie ath1V5.RData. </li><li> Offene readCEL.R mit dem Editor und kopiere den gesamten Text zu R. </li><li> Offene SFP.R mit dem Editor und kopiere den gesamten Text zu R. </li><li> Offene Map.R mit dem Editor und kopiere den gesamten Text zu R. </li><li> In der Console-Fenster sehen Sie die folgende Meldung: Chromosom X begrenzt Mb yz Suche Gene bei TAIR in diesem Link fügen 3 <a href="http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&amp;chr=x&amp;start=y&amp;end=z">http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&amp;chr=x&amp;start=y</a>&amp; End = z </li><li> Kopieren und fügen Sie den Link in Ihren Internet-Browser. Ein Fenster erscheint und fragen Sie zu öffnen oder speichern Sie die Datei, und Sie sollten wählen Sie Speichern. Wählen Sie einen Dateinamen ein und befestigen Sie die Erweiterung &quot;. Xls&quot;, klicken Sie auf Speichern. </li><li> Öffnen Sie die Datei &quot;. Xls&quot;, wo Sie die Koordinaten für Ihr Mutante (das Ergebnis wird grafisch in Abbildung 3 dargestellt) finden können. </li><li> Innerhalb des kartierten Gebietes im zusammengebauten Illumina liest der Mutantengenom identifizieren spezifische EMS Übergänge zwischen den vier Einzel-Nukleotid-Polymorphismen. Ergänzen das Mutantenphänotyps durch Transformation mit Wildtyp-Gen (e) unter Verwendung von Standardverfahren 15. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse 1 zeigt den Ansatz zur Identifizierung einer Mutante von den sekretorischen Weg mittels konfokaler Mikroskopie Screening verwendet. 2 zeigt eine typische Herstellung der markierten genomischen DNA für Array-Hybridisierung. In Abbildung 3 ist ein typisches Ergebnis nach Analyse der Daten aus dem GeneChip Arabidopsis Genome Array erhalten ATH1 präsentiert wird erwartet. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3809/3809fig1.jpg" /> Abbildung 1. Arabidopsis transgene Pflanzen, die ssGFPHDEL (ER-Marker) (1) wurden gezüchtet, um genügend Saatgut für die EMS-Behandlung (2) zu produzieren. Samen mit EMS behandelt wurden dann gesät, um M1 Pflanzen (3) zu generieren. Jeder M1 Pflanze stellt eine andere Linie, und Samen wurden getrennt von jeder von ihnen gesammelt. M2-Samen wurden auf S MS Substrat (4) plattiert wird und dann für Mängel ER Morphologie durch konfokale Mikroskopie (5) abgeschirmt ist. Während der Screening fanden wir, dass Pflanzen konserviert die Wildtyp-ER Morphologie (6) und Pflanzen, die defekte ER Phänotypen (7) zu zeigen. Diese Pflanzen wurden gezüchtet, um den M3-Generation zu erhalten und den Phänotyp (8) zu bestätigen. Genomische DNA von M3-Anlage wurde für Solexa Illumina Sequenzierung (a) verwendet wird. Die gleiche Pflanzewurde auch für Kreuzungen mit Ler-wt verwendet, um den F2-Mapping Bevölkerung (b) zu erhalten. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3809/3809fig2.jpg" /> Abbildung 2. BioPrime zufällig Markierungsreaktionen (5 ul 100 ul) wurden auf Agarosegel 1% geladen. Spur a ist aus einem Pool von Wildtyp-F2-Pflanzen, und die Spur b aus einem Pool von Mutante F2-Pflanzen. (Markierung ist 1 kb DNA-Leiter-N3232, von NEB). <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3809/3809fig3.jpg" /> Abbildung 3. Die Abbildung stellt ein Beispiel der Abbildung von Col-0-Mutation mit GeneChip Arabidopsis ATH1 Genome Array-Hybridisierung. Die Mutation in diesem Beispiel befindet sich auf Chromosom 1, durch vertikale Balken befindet. Die horizontalen Balken stellen die Schwellenwerte für die Erkennung.

<ol>
	<li>Marti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+missense+mutation+in+the+vacuolar+protein+GOLD36+causes+organizational+defects+in+the+ER+and+aberrant+protein+trafficking+in+the+plant+secretory+pathway.">A missense mutation in the vacuolar protein GOLD36 causes organizational defects in the ER and aberrant protein trafficking in the plant secretory pathway.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 63, 901-913 (2010).</li><li>Stefano, G., Renna, L., Moss, T., McNew, J., Brandizzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+the+spatial+and+dynamic+organization+of+the+endoplasmic+reticulum+and+Golgi+apparatus+is+influenced+by+the+integrity+of+the+c-terminal+domain+of+RHD3,+a+non-essential+GTPase.">Arabidopsis the spatial and dynamic organization of the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus is influenced by the integrity of the c-terminal domain of RHD3, a non-essential GTPase.</a> The Plant Journal. , (2011).</li><li>Kim, Y., Schumaker, K. S., Zhu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMS+mutagenesis+of+Arabidopsis.">EMS mutagenesis of Arabidopsis.</a> Methods in molecular biology. 323, 101-103 (2006).</li><li>Maple, J., Moller, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+in+Arabidopsis.">Mutagenesis in Arabidopsis.</a> Methods in molecular biology. 362, 197-206 (2007).</li><li>Greene, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrum+of+chemically+induced+mutations+from+a+large-scale+reverse-genetic+screen+in+Arabidopsis.">Spectrum of chemically induced mutations from a large-scale reverse-genetic screen in Arabidopsis.</a> Genetics. 164, 731-740 (2003).</li><li>Krieg, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethyl+methanesulfonate-induced+reversion+of+bacteriophage+T4rII+mutants.">Ethyl methanesulfonate-induced reversion of bacteriophage T4rII mutants.</a> Genetics. 48, 561-580 (1963).</li><li>Kovalchuk, I., Kovalchuk, O., Hohn, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+variation+of+the+somatic+mutation+frequency+in+transgenic+plants.">Genome-wide variation of the somatic mutation frequency in transgenic plants.</a> The EMBO journal. 19, 4431-4438 (2000).</li><li>Boulaflous, A., Faso, C., Brandizzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+Golgi+apparatus:+from+imaging+to+genes.">Deciphering the Golgi apparatus: from imaging to genes.</a> Traffic. 9, 1613-1617 (2008).</li><li>Borevitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+and+mapping+with+high-density+oligonucleotide+arrays.">Genotyping and mapping with high-density oligonucleotide arrays.</a> Methods in molecular biology. 323, 137-145 (2006).</li><li>Konieczny, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+procedure+for+mapping+Arabidopsis+mutations+using+co-dominant+ecotype-specific+PCR-based+markers.">A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 4, 403-410 (1993).</li><li>Bell, C. J., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assignment+of+30+microsatellite+loci+to+the+linkage+map+of+Arabidopsis.">Assignment of 30 microsatellite loci to the linkage map of Arabidopsis.</a> Genomics. 19, 137-144 (1994).</li><li>Hazen, S. P., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+arrays+are+not+just+for+measuring+gene+expression.">Gene arrays are not just for measuring gene expression.</a> Trends in Plant Science. 8, 413-416 (2003).</li><li>Hazen, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+array+mapping+of+circadian+clock+and+developmental+mutations+in+Arabidopsis.">Rapid array mapping of circadian clock and developmental mutations in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 138, 990-997 (2005).</li><li>Bentley, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+whole+human+genome+sequencing+using+reversible+terminator+chemistry.">Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry.</a> Nature. 456, 53-59 (2008).</li><li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis.">Arabidopsis.</a> A Laboratory Manual. , (2002).</li><li>Voelkerding, K. V., Dames, S., Durtschi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+sequencing+for+clinical+diagnostics-principles+and+application+to+targeted+resequencing+for+hypertrophic+cardiomyopathy:+a+paper+from+the+2009+William+Beaumont+Hospital+Symposium+on+Molecular+Pathology.">Next generation sequencing for clinical diagnostics-principles and application to targeted resequencing for hypertrophic cardiomyopathy: a paper from the 2009 William Beaumont Hospital Symposium on Molecular Pathology.</a> J. Mol. Diagn. 12, 539-551 (2010).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Hier beschreibt eine konfokale Mikroskopie-Screening zur Identifizierung von Mutanten Endomembransystem. Dies kann leicht zu einer anderen Organellen der Zelle, für die spezifische fluoreszierende Protein-Marker zur Verfügung verlängert werden. Der Bildschirm wird auf die Identifizierung von Mutanten, die eine anomale Verteilung der fluoreszierenden Marker, entweder in der Zielorganelle oder Organellen, die nicht dazu bestimmt sind, um den Marker enthalten, die zeigen. Jeweils stellen diese Mutanten untersucht, bei d...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Ethylmethansulfonat </td><td> Sigma </td><td> M0880 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> JT Baker </td><td> 3722-05 </td></tr><tr><td> Murashige Skoog Basalmedium w Gamborg Vitamine </td><td> Phyto technolog laboratorie </td><td> M404 </td></tr><tr><td> Phytagel </td><td> Sigma </td><td> P8169-1 kg </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> Meister reinen Pflanzenblatt DNA Purification Kit </td><td> Epicentre </td><td> MPP92100 </td></tr><tr><td> BioPrime DNA-Kennzeichnungssystem </td><td> Invitrogen </td><td> 18094-011 </td></tr><tr><td> Alcohol 200 Proof </td><td> Dekan Laboratories Inc. </td><td> 2716 </td></tr><tr><td> NaOAc </td><td> JT Baker </td><td></td></tr><tr><td> Gen-Chip-Arabidopsis ATH1Genom Array </td><td> Affymetrix </td><td> 900385 </td></tr><tr><td> Falcon-Röhrchen 50 ml </td><td> Corning </td><td> 430290 </td></tr><tr><td> Eppendorf-Röhrchen 1,5 ml </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Filterpapier 90mm </td><td> Whatman </td><td> 1001090 </td></tr><tr><td> Analysenwaage </td><td> Mettler Toledo AB54-S </td><td> na </td></tr><tr><td> Taumelscheibe (Welle) Schüttler </td><td> Heidolph Polymax 1040 </td><td> na </td></tr><tr><td> Zentrifugieren </td><td> Eppendorf 5417-R </td><td> na </td></tr></tbody></table>

fluorescence-microscopy screening and next-generation sequencing: useful tools for the identification of genes involved in organelle integrity

Dieses Protokoll beschreibt ein Fluoreszenzmikroskop-basierte Screening von Arabidopsis-Keimlinge und beschreibt, wie rezessive Mutationen, die die subzelluläre Verteilung eines spezifischen fluoreszierenden Marker markiert in den sekretorischen Weg verändern zu kartieren. Arabidopsis ist ein leistungsfähiges biologisches Modell für genetische Studien wegen seiner Genomgröße, Generationszeit, und die Erhaltung der molekularen Mechanismen unter Königreiche. Die Array-Genotypisierung als ein Ansatz, um die Mutation in Alternative zu den traditionellen Verfahren auf der Basis molekularer Marker zugeordnet ist vorteilhaft, weil es relativ schneller ist und kann die Zuordnung von mehreren Mutanten in wirklich kurzer Zeit ermöglichen. Dieses Verfahren ermöglicht die Identifizierung von Proteinen, die die Integrität einer Organelle in Pflanzen beeinflussen können. Hier, als Beispiel, schlagen wir einen Bildschirm zur Karte Gene, die für die Integrität des endoplasmatischen Retikulum (ER). Unser Ansatz kann aber leicht auf andere Pflanzen Zellorganellen erweitert werden(Siehe zum Beispiel 1,2), und stellt daher einen wichtigen Schritt zum Verständnis der molekularen Grundlagen für die anderen subzellulären Strukturen.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity at JoVE.com

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Eine grundlegende Aufgabe in der Zellbiologie ist es, die Mechanismen, die die Identität der Organellen, die eukaryotischen Zellen machen zu Grunde liegen zu definieren. Hier schlagen wir eine Methode, um die Gene verantwortlich für die morphologische und funktionelle Integrität der Anlage Organellen mittels Fluoreszenzmikroskopie und Next-Generation-Sequencing-Tools zu identifizieren.

Fluoreszenz-Mikroskopie Screening und Next-Generation-Sequencing: Nützliche Tools für die Identifizierung von Genen in den Organellen Integrität beteiligt

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

fluorescence-microscopy-screening-next-generation-sequencing-useful

Research

JoVE Journal

Biology

12.2K Aufrufe.  Michigan State University. Eine grundlegende Aufgabe in der Zellbiologie ist es, die Mechanismen, die die Identität der Organellen, die eukaryotischen Zellen machen zu Grunde liegen zu definieren. Hier schlagen wir eine Methode, um die Gene verantwortlich für die morphologische und funktionelle Integrität der Anlage Organellen mittels Fluoreszenzmikroskopie und Next-Generation-Sequencing-Tools zu identifizieren.

Serie: Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zeitraffer-Imaging der Mitose Nach siRNA-Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Forschung

Biologie

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

Mit RNA-Interferenz Feeding Strategy to Screen for Genes in Body Größe der Rechtsetzung in der Nematode Beteiligte<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

Next-Generation-Sequenzierung der ribosomalen 16S-RNA Gene Amplikons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

Gezielte DNA Methylierungsanalyse von Next-Generation-Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplification, Next-Generation-Sequenzierung und genomischer DNA Mapping von Retrovirale Integration Seiten

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to poorly folding proteins or random open reading frames. We have developed a strategy where, by using TEM-1 &#946;-lactamase (the enzyme conferring ampicillin resistance) on a genomic scale, we can select collections of correctly folded protein domains from the coding portion of the DNA of any intronless genome. The protein fragments obtained by this approach, the so called &#34;domainome&#34;, will be well expressed and soluble, making them suitable for structural/functional studies.
By cloning and displaying the &#34;domainome&#34; directly in a phage display system, we have showed that it is possible to select specific protein domains with the desired binding properties (e.g., to other proteins or to antibodies), thus providing essential experimental information for gene annotation or antigen identification.
The identification of the most enriched clones in a selected polyclonal population can be achieved by using novel next-generation sequencing technologies (NGS). For these reasons, we introduce deep sequencing analysis of the library itself and the selection outputs to provide complete information on diversity, abundance and precise mapping of each of the selected fragment. The protocols presented here show the key steps for library construction, characterization, and validation.

The protocols described allow the construction, characterization and selection (against the target of choice) of a &#34;domainome&#34; library made from any DNA source. This is achieved by a research pipeline that combines different technologies: phage display, a folding reporter and next generation sequencing with a web tool for data analysis.

Interaktom-Seq: Ein Protokoll zur Domainome Bibliotheksbau, Validierung und Auswahl von Phagen-Display und Next Generation Sequencing

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective and widely available vaccines are lacking for a majority of these diseases, necessitating the development of novel disease mitigation strategies. To this end, a promising avenue of disease control involves targeting the vector microbiome, the community of microbes inhabiting the vector. The vector microbiome plays a pivotal role in pathogen dynamics, and manipulations of the microbiome have led to reduced vector abundance or pathogen transmission for a handful of vector-borne diseases. However, translating these findings into disease control applications requires a thorough understanding of vector microbial ecology, historically limited by insufficient technology in this field. The advent of next-generation sequencing approaches has enabled rapid, highly parallel sequencing of diverse microbial communities. Targeting the highly-conserved 16S rRNA gene has facilitated characterizations of microbes present within vectors under varying ecological and experimental conditions. This technique involves amplification of the 16S rRNA gene, sample barcoding via PCR, loading samples onto a flow cell for sequencing, and bioinformatics approaches to match sequence data with phylogenetic information. Species or genus-level identification for a high number of replicates can typically be achieved through this approach, thus circumventing challenges of low detection, resolution, and output from traditional culturing, microscopy, or histological staining techniques. Therefore, this method is well-suited for characterizing vector microbes under diverse conditions but cannot currently provide information on microbial function, location within the vector, or response to antibiotic treatment. Overall, 16S next-generation sequencing is a powerful technique for better understanding the identity and role of vector microbes in disease dynamics.

Here we present a next-generation sequencing protocol for 16S rRNA sequencing which enables identification and characterization of microbial communities within vectors. This method involves DNA extraction, amplification and barcoding of samples through PCR, sequencing on a flow-cell, and bioinformatics to match sequence data to phylogenetic information.

Tick Microbiome Charakterisierung von Next-Generation-16 s rRNA Amplikons Sequenzierung

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

Mikrobiota-Analyse mit zweistufiger PCR- und 16S-rRNA-Gensequenzierung der nächsten Generation

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high quality and quantity DNA from a well-preserved individual mosquito sufficient for downstream whole genome sequencing. However, reliance on an expensive automated DNA extraction instrument can be prohibitive for many laboratories. Here, the study provides a budget-friendly magnetic-bead-based DNA extraction protocol, which is suitable for low to medium throughput. The protocol described here was successfully tested using individual Aedes aegypti mosquito samples. The reduced costs associated with high quality DNA extraction will increase the application of high throughput sequencing to resource limited labs and studies.

Described here is a DNA extraction protocol using magnetic beads to produce high quality DNA extractions from mosquitoes. These extractions are suitable for a downstream next-generation sequencing approach.

Ein magnetperlenbasiertes Moskito-DNA-Extraktionsprotokoll für die Sequenzierung der nächsten Generation

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...