Development of the method presented here has been carried out with various sources of funding, including Genome Canada and Genome Quebec, Environment Canada STAGE program and internal NRC funds.

1. 16S rRNA-Gen-Bibliothek Amplicon Vorbereitung der Fusion-Methode <ol><li> Tauen die Primer (Vorwärts, F343-Iona-MIDXX: 5&#39;-CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG AC T CAG XXX XXX XXX XTA CGG RAG GCA GCA G-3 &#39;; umzukehren, R533-IonP1: 5&#39;-CCT CTC TAT GGG CAG TCG GTG AUF EINEN TTA CCG CGG CTG CTG GC-3 &#39;; fett: Ion Torrent spezifische Adapter, kursiv: Sequenztaste für die Kalibrierung von Signalintensität zu Beginn der Sequenzierung Lauf, regelmäßige Schrift: template-spezifischen Primer, X ... X: 10 bp Barcode, siehe Tabelle 1 für einige Barcode-Sequenzen), die 2x HotStartTaq Plus-Master-Mix und die Proben. Vor Gebrauch gründlich mischen, mit Ausnahme des Master-Mix, der sanft gemischt werden sollte. </li><li> Vorbereitung einer PCR-Mischung (20 ul-Reaktionen) mit 0,5 uM des Reverse-Primers, 0,4 mg / ml Rinderserumalbumin (BSA) und 1x HotStartTaq Plus Master Mix. Fügen 18,5 ul des Master-Mix auf Each PCR-Röhrchen. </li><li> Ein Forward-Primer (0,5 ul an 20 mM) mit einem anderen Strichcode für jede der Proben, die zusammen sequenziert werden. 1 ul Probe (1-10 ng / ul) auf die PCR-Röhrchen. </li><li> Die Röhrchen in einer PCR-Maschine und führen Sie das folgende Programm: initiale Denaturierung bei 95 ° C für 5 min; 25 Zyklen von 95 ° C für 30 sec, 55 ° C für 30 sec und 72 ° C für 45 sec; Schlussverlängerung bei 72 ° C für 10 min. PCR-Produkte können bei 4 ° CO gehalten werden / N oder gefroren bis zur Verwendung. </li></ol> 2. Amplicon Reinigung, Quantifizierung und Pooling <ol><li> Bereiten Sie eine 2% Agarose-Gel mit die größten Kämme. Werden 5 ul 6x Gel-Beladungsfarbstoff zu dem Reaktions und Last auf dem Gel, die Trennung jeder Probe durch einen leeren gut. Führen Sie das Gel bei 70 V für 50 min. </li><li> Nehmen Sie ein Bild von dem Gel und schneiden die Bänder (erwarteten Größe ca. 250 bp: 190 bp-Produkt sowie 63 bp-Adapter und Barcodes) mit einem sauberen Skalpell. </li><li&gt; Wiegen Sie die ausgeschnittenen Banden und fahren Sie mit dem Gel Extraktion und Reinigung der PCR-Produkte (mit zB QIAquick Gel Extraction Kit). </li><li> Quantifizierung jedes PCR-Produkt mit PicoGreen und machen Verdünnungen um eine Stammlösung bei 5 x 10 9 Moleküle / ul (etwa 1 ng / ul) zu erhalten. Wenn einige Proben zeigen geringere Verstärkung, passen Sie die Verdünnungen auf eine niedrigere Konzentration, wenn man bedenkt, dass die niedrigste für die nachfolgende Verfahren Konzentration beträgt 1,57 x 10 7 Moleküle / ul (26 Uhr). </li><li> Pool 10 ul der verdünnten PCR-Produkt zu einer äquimolaren Pool von Proben zu erhalten. Bereiten Sie eine separaten Pool für jede der geplanten Lauf Sequenzierung. Die gepoolten PCR-Produkte können in der Tiefkühltruhe aufbewahrt werden, bis sie verwendet. </li></ol> 3. Emulsions-PCR und Sequenzierung <ol><li> Führen Emulsions-PCR: <ol><li> Verdünne die gepoolten PCR-Produkte auf 26 pM in einem Volumen von 25 ul. Tau-Reagenzien von einem Ion PGM-Vorlage-Kit. </li><li> Bereiten Sie die Emulsions-PCR-Mix (Reagenzien im Kit enthalten) in einer PCR-Haube und die gepoolten PCR-Produkte und die Kugel-Teilchen (mitgeliefert) auf der Bank hinzuzufügen. Gründlich mischen und legen Sie die Mischung in eine Filterpatrone und vorsichtig von oben mit Öl-Emulsion (mitgeliefert). </li><li> Langsam kehren die Filterpatrone und Last auf dem automatisierten Emulsion PCR-Gerät (zB Ion One Touch 2 Instrument). Wählen Sie das entsprechende Programm und starten Sie den Vorgang. </li></ol></li><li> Nach der automatisierten Emulsions-PCR abgeschlossen ist, entfernen Sie den Überstand aus den Sammelrohren und rufen Sie die Kugel Teilchen am Boden der Rohre. Resuspendieren der Kugeln in 100 ul Waschlösung (im Kit enthalten) und einen 2,0-ul-Aliquot für Bibliotheks Quantifizierung. </li><li> Führen Sie die Bibliothek Quantifizierung. <ol><li> Mischungs 100 ul SSPE-Puffer (150 mM NaCl, 10 mM NaPO 4, 1 mM Na 2 EDTA) mit 2 ul Adapter B&#39;-Fam (5&#39;-FAM -CTG AGA CTG CCA AGG CAC ACA GGG GAT AGG-3 &#39;) und Sonde 2 ul Adapter A-Cy5 (5&#39;-Cy5 -CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-3&#39;)-Sonde. Fügen 52 ul dieser Mischung mit dem 2,0-ul-Aliquot in Schritt 3.2 aufgenommen und mit 2 ul Waschlösung (von der Vorlage Kit) mit den restlichen 52 ul als Rohling für die Quantifizierung. </li><li> Inkubieren bei 95 ° C für 2 min, dann bei 37 ° C für 2 min. Übertragen Sie die Mischungen in 1,5-ml-Röhrchen. </li><li> 1,0 ml TEX-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,01% Triton X-100, pH 8,0), Mischen und Zentrifugieren bei 15.500 × g für 3 min bei RT. Entfernen Sie den Überstand und lassen Sie 20 ul in jedes Röhrchen. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang zwei Mal. </li><li> Fügen Sie 180 ul von TEX-Puffer resuspendieren Die pelletierten Partikel und übertragen in 500 ul Qubit Röhren. </li><li> Messen Fluoreszenz für FAM und Cy5 mit einem Qubit Gerät und berechnen das Verhältnis von positiven Kugeln mit Hilfe der auf der Website zur Verfügung Ion Gemeinschaft Rechner. </li></ol></li><li> Bereichern den Rest der Form kugelförmiger Partikel für positive Kugeln (enthaltend amplifizierte DNA) unter Verwendung eines automatisierten Anreicherungssystem (zB Ionen One Touch Anreicherungssystem). <ol><li> Pipette Reagenzien in den Vertiefungen der vorgesehenen 8-Well-Streifen: Nun 1: Kugel Partikel aus Schritt 3.2; Nun 2: vorgewaschen MyOne Streptavidin C1-Perlen (13 ul); Gut 3, 4 und 5: Waschlösung (in der Vorlage Kit enthalten); Gut 6: leer; Gut 7: Schmelz-off-Lösung (125 mM NaOH, 0,1% Tween 20); Gut 8: leer. </li><li> Installieren Sie eine Spitze auf dem Pipettieren Arm und ein 0,2-ml-Röhrchen für die Probenentnahme. Starten Sie das Gerät. Am Ende der Anreicherung werden 10 ul der Neutralisierungslösung (enthalten). Die angereicherten Kügelchen können eine 4 ° C für bis zu 15 Tage aufbewahrt werden. </li></ol></li><li> Initialisieren der Sequenzierung Instruments: <ol><li> Eine Verbindung zum Instrument Sequenzierung und bereiten eine Sequenzierung Laufplan, der die Details der Sequenzierung Lauf. </li><li> Installierenl der Waschlösung # 2 (in der Ionen-PGM-Sequenzierungs-Kit vorgesehen), die Waschlösung # 1 (350 ul 100 mM NaOH) und die Auto-pH-Pufferlösung (vorgesehen). </li><li> Starten Sie die Initialisierung und wenn Sie dazu aufgefordert in ihren jeweiligen 50-ml-Röhrchen fügen Sie die dATP, dGTP dCTP und dTTP Nukleotide (mitgeliefert). Schrauben Sie die Rohre auf die Sequenzierung Maschine und setzen Sie die Initialisierung. Wenn die Initialisierung abgeschlossen ist, starten Sie den Vorgang sofort laufen. </li></ol></li><li> Vorbereitung der Proben für die Sequenzierung und laden Sie die Chip: <ol><li> Sammle die angereicherten Bereiche aus Schritt 3.4 an der Unterseite des Rohres durch Zentrifugation bei 15.500 × g für 1,5 min. Entfernen Sie den Überstand verlassen genau 3 ul. </li><li> Hinzufügen 3 ul Sequenzierprimer (in der Sequenzierungs-Kit zur Verfügung gestellt), gut mischen durch Pipettieren von oben und unten, um die Partikel zu suspendieren. Inkubieren bei 95 ° C für 2 min, dann bei 37 ° C für 2 min. </li><li> 1 ul-Polymerase (im Lieferumfang enthalten), gut mischen und Incubaß bei RT für 5 min. Fahren Sie mit den Enzym-Kugelgemisch auf der Sequenzierung Chip innerhalb von 30 min zu laden. </li><li> Während der Inkubation laden die Sequenzierung Chip auf dem Sequenzer und einen Chip Qualitätsprüfung durchzuführen. Entfernen Sie die Flüssigkeit aus dem Chip durch Zentrifugation und laden Sie die Probe in der Chip durch langsames Pipettieren Sie die Enzym-Mix Kugel (7 ul) und der Vermeidung der Einführung von Blasen in den Chip. </li><li> Zentrifugieren Sie die Chip dreimal für 1 min in einer Mikro. Ändern Sie die Ausrichtung des Chips an jeder Zentrifugation und mischen durch Pipettieren von oben und unten zwischen jedem Lauf. </li><li> Laden Sie den Chip in dem Gerät und den Lauf starten. </li></ol></li></ol> 4. Grundsequenzdatenanalyse <ol><li> Eine Verbindung zum Server Sequenzierungsdaten und laden Sie die Datei fastq. Erstellen Sie eine durch Tabulatoren getrennte Datei &quot;Oligos&quot; der Grundierung und Barcode-Informationen (siehe Beispiel in Tabelle 1), die. Laden Sie die Greengenes Referenzdateien aus der Mothur Website ( <a href="http://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline">http://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline</a> ). </li><li> Starten Mothur und Durchführung von Analysen: <ol><li> Konvertieren Sie die Datei in ein fastq fasta und ein Qualitäts Datei mit dem folgenden Befehl: fastq.info (fastq = test.fastq) </li><li> Bestimmen Sie die Gruppenzugehörigkeit jeder Sequenz und trimmen die Sequenzen mit dem folgenden Befehl: trim.seqs (fasta = test.fasta, Oligos = barcode.txt, QFile = test.qual, qwindowaverage = 20, qwindowsize = 50, minlength = 150, keepforward = T) </li><li> Die verschiedenen Optionen können entsprechend der gewünschten Stringenz modifiziert werden </li><li> Klassifizieren Sie die Sequenzen in der Greengenes Taxonomie mit dem folgenden Befehl: classify.seqs (fasta = test.trim.fasta, method = wang, Gruppe = test.groups, template = gg_99_otus.fasta, Taxonomie = gg_99_otus.tax, Cutoff = 50) </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Sipos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+PCR+biases+in+environmental+microbiology+studies.">Addressing PCR biases in environmental microbiology studies.</a> Methods Mol. Biol. 599, 37-58 (2010).</li><li>Schloss, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+effects+of+PCR+amplification+and+sequencing+artifacts+on+16S+rRNA-based+studies.">Reducing the effects of PCR amplification and sequencing artifacts on 16S rRNA-based studies.</a> PLoS ONE. 6, e27310 (2011).</li><li>Tringe, S. G., Hugenholtz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+renaissance+for+the+pioneering+16S+rRNA+gene.">A renaissance for the pioneering 16S rRNA gene.</a> Curr. Opin. Microbiol. 11, 442-446 (2008).</li><li>Margulies, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequencing+in+microfabricated+high-density+picolitre+reactors.">Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors.</a> Nature. 437, 376-380 (2005).</li><li>Kuczynski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+community+resemblance+methods+differ+in+their+ability+to+detect+biologically+relevant+patterns.">Microbial community resemblance methods differ in their ability to detect biologically relevant patterns.</a> Nat. Methods. 7, 813-819 (2010).</li><li>Bondici, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+communities+in+low-permeability,+high+pH+uranium+mine+tailings:+characterization+and+potential+effects.">Microbial communities in low-permeability, high pH uranium mine tailings: characterization and potential effects.</a> J. Appl. Microbiol. 113, 1671-1686 (2013).</li><li>Auffret, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+water+quality+on+the+bacterial+populations+and+off-flavours+in+recirculating+aquaculture+systems.">Impact of water quality on the bacterial populations and off-flavours in recirculating aquaculture systems.</a> FEMS Microbiology Ecology. 84, 235-247 (2013).</li><li>Bell, T. H., Yergeau, E., Juck, D., Whyte, L. G., Greer, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+microbial+community+structure+affects+diesel+biodegradation+in+an+Arctic+soil.">Alteration of microbial community structure affects diesel biodegradation in an Arctic soil.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 85, 51-61 (2013).</li><li>Bell, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictable+bacterial+composition+and+hydrocarbon+degradation+in+Arctic+soils+following+diesel+and+nutrient+disturbance.">Predictable bacterial composition and hydrocarbon degradation in Arctic soils following diesel and nutrient disturbance.</a> ISME J. 7, 1200-1210 (2013).</li><li>Yergeau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+of+microbial+communities+in+the+Athabasca+River+and+its+tributaries+in+relation+to+oil+sands+mining+activities.">Next-generation sequencing of microbial communities in the Athabasca River and its tributaries in relation to oil sands mining activities.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78, 7626-7637 (2012).</li><li>Yergeau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerobic+biofilms+grown+from+Athabasca+watershed+sediments+are+inhibited+by+increasing+bituminous+compounds+concentrations.">Aerobic biofilms grown from Athabasca watershed sediments are inhibited by increasing bituminous compounds concentrations.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79, 7398-7412 (2013).</li><li>Yergeau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+expression+profiles+in+the+rhizosphere+of+willows+depend+on+soil+contamination.">Microbial expression profiles in the rhizosphere of willows depend on soil contamination.</a> ISME J. 8, 344-358 (2013).</li><li>Deagle, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+sequence+proportions+in+a+DNA-based+diet+study+using+Ion+Torrent+amplicon+sequencing:+which+counts+count.">Quantifying sequence proportions in a DNA-based diet study using Ion Torrent amplicon sequencing: which counts count.</a> Mol. Ecol. Resour. 13, 620-633 (2013).</li><li>Milani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+fecal+microbiota:+an+optimized+Ion+Torrent+16S+rRNA+gene-based+analysis+protocol.">Assessing the fecal microbiota: an optimized Ion Torrent 16S rRNA gene-based analysis protocol.</a> PLoS ONE. 8, e68739 (2013).</li><li>J&#252;nemann, S., Prior, P., Szczepanowski, R., Harks, I., Ehmke, B., Goesmann, A., Stoye, J., Dag Harmsen, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+community+shift+in+treated+periodontitis+patients+revealed+by+Ion+Torrent+16S+rRNA+gene+amplicon+sequencing.">Bacterial community shift in treated periodontitis patients revealed by Ion Torrent 16S rRNA gene amplicon sequencing.</a> PLoS ONE. 7, e41606 (2012).</li><li>Petrof, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stool+substitute+transplant+therapy+for+the+eradication+of+Clostridium+difficile+infection:+'RePOOPulating'+the+gut.">Stool substitute transplant therapy for the eradication of Clostridium difficile infection: 'RePOOPulating' the gut.</a> Microbiome. 1, 3 (2013).</li><li>Whiteley, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+16S+rRNA+Ion+Tag+and+community+metagenome+sequencing+using+the+Ion+Torrent+(PGM)+Platform.">Microbial 16S rRNA Ion Tag and community metagenome sequencing using the Ion Torrent (PGM) Platform.</a> J. Microbiol. Meth. 91, 80-88 (2012).</li><li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms.">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> ISME J. 6, 1621-1624 (2012).</li><li>Kozich, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+dual-index+sequencing+strategy+and+curation+pipeline+for+analyzing+amplicon+sequence+data+on+the+MiSeq+Illumina+sequencing+platform.">Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq Illumina sequencing platform.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79, 5112-5120 (2013).</li><li>Hamady, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+UniFrac:+facilitating+high-throughput+phylogenetic+analyses+of+microbial+communities+including+analysis+of+pyrosequencing+and+PhyloChip+data.">Fast UniFrac: facilitating high-throughput phylogenetic analyses of microbial communities including analysis of pyrosequencing and PhyloChip data.</a> ISME J. 4, 17-27 (2010).</li><li>Quince, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removing+noise+from+pyrosequenced+amplicons.">Removing noise from pyrosequenced amplicons.</a> BMC Bioinformatics. 12, 38 (2011).</li><li>Huse, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ironing+out+the+wrinkles+in+the+rare+biosphere+through+improved+OTU+clustering.">Ironing out the wrinkles in the rare biosphere through improved OTU clustering.</a> Environ. Microbiol. 12, 1889-1898 (2010).</li><li>Edwards, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+dynamics+of+initial+bacterial+colonization+of+nonconserved+forage+in+the+bovine+rumen.">Characterization of the dynamics of initial bacterial colonization of nonconserved forage in the bovine rumen.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 62, 323-335 (2007).</li><li>Rastogi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR-based+toolbox+for+the+culture-independent+quantification+of+total+bacterial+abundances+in+plant+environments.">A PCR-based toolbox for the culture-independent quantification of total bacterial abundances in plant environments.</a> J. Microbiol. Methods. 83, 127-132 (2010).</li><li>Baker, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+and+re-analysis+of+domain-specific+16S+primers.">Review and re-analysis of domain-specific 16S primers.</a> J. Microbiol. Methods. 55, 541-555 (2003).</li><li>Schloss, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+alignment+quality,+distance+calculation+method,+sequence+filtering,+and+region+on+the+analysis+of+16S+rRNA+gene-based+studies.">The effects of alignment quality, distance calculation method, sequence filtering, and region on the analysis of 16S rRNA gene-based studies.</a> PLoS Comput. Biol. 6, e1000844 (2010).</li><li>Links, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chaperonin-60+universal+target+Is+a+barcode+for+bacteria+that+enables+de+novo+assembly+of+metagenomic+sequence+data.">The chaperonin-60 universal target Is a barcode for bacteria that enables de novo assembly of metagenomic sequence data.</a> PLoS ONE. 7, e49755 (2012).</li><li>Vos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+rpoB+and+16S+rRNA+as+markers+in+pyrosequencing+studies+of+bacterial+diversity.">Comparison of rpoB and 16S rRNA as markers in pyrosequencing studies of bacterial diversity.</a> PLoS ONE. 7, e30600 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> Die hier vorgestellte Methode ist unkompliziert und preiswert, und sollte es vielen Labors, die Macht der metagenomische Sequenzierung zugreifen. Obwohl sie in Abhängigkeit von der Sequenzierung Plattform abhängig, wenn die Bibliotheken konstruiert wenig praktische Zeit erforderlich, wobei die meisten der Verfahren ist automatisierbar. Für die Sequenzierungsplattform verwendet hier (Ion Torrent PGM) kann das komplette Verfahren innerhalb von zwei Tagen Arbeit durchgeführt werden. Im Moment des Schreibens (September 2013), waren wie folgt die Reagenzienkosten auf das Beispiel oben beschrieben bezogen werden: PCR-Amplifikation von 36 Proben: $ 25, Gel-Reinigung und PicoGreen DNA-Quantifizierung von 36 Proben: $ 125, Emulsions-PCR für eine gepoolte Amplikon Probe : $ 150 und Sequenzierungsreagenzien: $ 250, für einen Gesamtbetrag von $ 550 oder $ 15 pro Probe oder $ 0,0015 pro-Qualität gefiltert Lese. Dieser Preis umfasst nicht Instrument Servicevertrag Instrument Abschreibungen, Techniker Gehalt und Laborraumnutzung. Zelt &quot;&gt; Eine der wichtigsten Schritte ist es, alle Produkte in einem äquimolaren Verhältnis zu bündeln, um eine ähnliche Anzahl von Abrufen liest für jede der Proben. PicoGreen Quantifizierung wurde hier verwendet, aber andere Verfahren geeignet sein könnten, wenn auch weniger genau (zB UV-Quantifizierung, Gel-basierte Quantifizierung). Selbst, indem Sie die genaue Quantifizierung und Pooling, gibt es eine gewisse Variabilität in der Anzahl der Lesevorgänge pro Probe und in der typischen Lauf in Tabelle 2 aufgeführt, von 4.380 bis 32.750 reicht es liest, mit einem Durchschnitt von 10.338 liest. Wenn der Verarbeitung große Anzahl von Proben (mehr als 40-50), Einzel Spalte Gel Reinigung kann durch Gel-Reinigung in Platte oder Reinigung mit Perlen mit einer strengen Grenzgröße ersetzt werden (zB AMPure Perlen) . Bis heute ist die am häufigsten verwendete nächsten Generation Sequenzierungstechnologie für die 16S rRNA-Gen 454. Das Ion Torrent-Sequenzierungstechnologie in diesem Protokoll verwendet wird, ist konzeptionell sehr ähnlich454 und beide Technologien sind anfällig für die gleiche Art von Sequenzierungsfehlern. Nicht überraschend, wurde gezeigt, dass Ion Torrent-Sequenzierung ergab Sequenzierungsergebnisse sehr ähnlich 454-Sequenzierung 10. Kürzlich haben viele Forscher die Verwendung von Illumina Technologie für 16S-rRNA-Gen-Amplikons Sequenzierung 18,19 sucht. In jedem Fall wäre es einfach, den aktuellen Protokoll für andere Tisch Sequenzer wie die Illumina MiSeq oder 454 GS Junior durch eine Änderung der Fusions Primer-Sequenzen, um die Adapter und Barcodes für diese Sequenzierungstechnologien benötigt einstimmt, wie in der kürzlich beschriebenen Verfahren anzupassen für die Illumina MiSeq 19. Alternativ könnten die Forscher Schritte 1 und 2 des Protokolls detailliert hier und senden Sie die gepoolten Amplikons zu einer Sequenzierungszentrum, wo die Emulsion PCR und Sequenzierung durchgeführt werden würde. Das 16S-rRNA-Gen liest wurden beschnitten und klassifiziert mit Mothur, aber viele andere Analysen können durchgeführt werden, auf16S rRNA-Gen-Amplikons. Beispielsweise können beta-Diversität durch Berechnen der Abstände zwischen jedem Unifrac Probenpaare unter Verwendung des Verfahrens beschrieben in ausgewertet <a href="http://unifrac.colorado.edu/">http://unifrac.colorado.edu/</a> 20. Alpha-Diversität-Indizes und der Anzahl der Betriebs taxonomische Einheiten von jeder Probe können mit Tools wie innerhalb QIIME AmpliconNoise 21 oder nach dem Verfahren von Huse et al. 22 und innerhalb Mothur skizziert berechnet werden. Die hier verwendeten Primer der variablen Regionen 3 und 4 von der 16S-rRNA-Gen, aber viele andere Regionen ausgerichtet werden konnte. In dieser Studie wurden die 16S-rRNA-Gene von Pflanzenmaterial verstärkt und die Wahl der Primer wurde hergestellt, um eine Amplifikation der Chloroplast 16S rRNA-Gen 23,24 vermeiden. Es gibt eine Vielzahl von anderen Primern, die in Laufzeit der Produktlänge, Leistung und Nützlichkeit taxonomischen 25,26 variieren. Jedoch in allen Fällen 200-400 bp liest der 16S rRNA-Gen nicht zuverlässig auf Artenebene eingestuft werden, und Analysen, die zur Gattung und höhere taxonomische Ebenen beschränkt. Andere Gene könnte besser geeignet sein, wenn Spezies-Ebene Informationen benötigt werden, wie die cpn60 und rpoB Gene 27,28. Zukunft drastische Tropfen in die Kosten der Sequenzierung und steigt in die Macht der Analyseinstrumente könnte es möglich, 16S rRNA-Gen-Sequenzierung durch Schrotflinte Metagenomik ersetzen, aber bis dahin 16S-rRNA-Gen-Sequenzierung bleibt der Goldstandard der Umweltmikrobiologie.

Metagenomische Sequenzierung ist eine sehr leistungsfähige Technologie, da sie die Gesamtheit der genetischen Information in einer Umweltprobe enthaltenen Ziele. Es gibt verschiedene Geschmacksrichtungen von metagenomische Sequenzierung, einschließlich Shotgun-Sequenzierung, Großeinsatz Bibliotheken und Amplikon-Sequenzierung. Amplicon-Sequenzierung bietet den Vorteil, dass sie relativ preiswert, schnell und in der Lage zu erzeugen liest aus einer genomischen Region, die im Allgemeinen ausgerichtet werden kann. Zusätzlich wird die Datenanalyseablauf für Amplikon-Sequenzierung meist genormt. Da es auf PCR-Basis, hat jedoch alle Vorspannungen unvollständiger Spezifität unvollständige Abdeckung und Primer bezogen vorspannt 1,2, die diesen Ansatz semi-quantitative macht am besten. Mehrere genomischen Regionen für Amplikon-Sequenzierung auch funktionelle Gene gezielt werden, aber die beliebtesten Optionen sind Markergene wie das 16S rRNA-Gen verwenden, um ein Community-Profil zu erzeugen. Traditionell 16S rRNA-Gen-Amplikon sequeber bouncing wurde mit arbeitsintensive Techniken, Klonierung in E. enthalten geführt coli-Kolonie Kommissionierung und Plasmid-Extraktion, gefolgt von Sanger Sequenzierung der isolierten Plasmide, und folglich die meisten Studien analysiert weniger als 100 Klone pro Probe. Next-Generation-Sequencing brachte zwei große Fortschritte: massiven Parallelisierung der Sequenzierungsreaktionen und, am wichtigsten, klonalen Trennung der Vorlagen ohne die Notwendigkeit, Gen-Fragmente in einer Gast einfügen. Das hat enorm die Sequenzierung von 16S rRNA-Gen-Amplikons, die nun wieder als eine Routine Merkmal vieler Umweltmikrobiologie Studien ist, was zu einer &quot;Renaissance&quot; für 16S rRNA-Gen-Sequenzierung Amplikon 3 vereinfacht. Seit dem Aufkommen der Roche 454-Sequenzierung im Jahr 2005 4, haben mehrere andere Next-Generation-Sequencing-Technologien auf dem Markt erschienen (zB Illumina, Festkörper, PacBio). In jüngerer Zeit die Einführung der Tisch Sequenzrs gebracht, um kleine Labore die Sequenzierung Kapazität einmal exklusiv für große Sequenzierungszentren. Fünf Tischmaschinen sind derzeit verfügbar: die 454 GS Junior, der Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) und Proton, und die Illumina MiSeq und NextSeq 500. Während alle diese Sequenzer bieten weniger liest pro Lauf und weniger Basen pro Dollar als die meisten Voll Maßstab Sequenzer, sind sie flexibler, schneller, und ihre niedrigen Anschaffungskosten und Lauf macht sie für kleine akademische Labors erschwinglich. Tisch Sequenzer sind besonders gut für Amplikon, kleines Genom und geringer Komplexität Metagenom-Sequenzierung in der Umweltmikrobiologie Studien geeignet, weil diese Art von Studien in der Regel nicht eine extreme Tiefe der Sequenzierung erfordern. Zum Beispiel ist es allgemein anerkannt, dass die 16S-rRNA-Gen-Sequenzierung untersucht die Anzahl der Lesevorgänge pro Probe ist nicht entscheidend, wie ~ 1000 liest die gleichen Muster, wie Multi-Millionen Datensätze liest 5 zu erzeugen. Having said that, Tisch nächsten gene<html> n Sequenzer noch große Mengen an Sequenzdaten mit maximaler Renditen generieren ~ 35 MBP (454 GS Junior), ~ 2 GBP (Ion Torrent PGM), ~ 10-15 GBP (Ion Torrent Proton), ~ 10 GBP (Illumina MiSeq) und ~ 100 GBP (Illumina Weiter Seq 500), die mehr als genug für die meisten Umweltmikrobiologie Studien ist. Next-Generation-Sequenzierung des 16S-rRNA-Amplikons mit Tisch Sequenzer wurde vor kurzem in einer Vielzahl von Umgebungen angewendet. Zum Beispiel hat der Ion Torrent PGM für Gemeinschaft verwendet wurden Analysen von Uran-Mine Aufbereitungsrückstände, die besonders hohen pH-Wert und geringe Durchlässigkeit 6 hatte, der Rückführung von Aquakultursystemen 7, der Kohlenwasserstoff-kontaminierten Böden der Arktis 8,9, der Ölsandgewinnung betroffen Sedimenten und Biofilme aus dem Athabasca River 10,11, der Rhizosphäre von Weiden in kontaminierten Böden 12 gepflanzt, der menschlichen und tierischen Körpern 13-16 und von Faul 17. jove_content &quot;&gt; In diesem Beitrag haben wir ausführlich unsere Herangehensweise an sequenzieren 16S rRNA-Gen-Amplikons im Haus mit Hilfe eines Tisch nächsten Generation Sequencer (der Ion Torrent PGM). Nach der DNA-Extraktion, 16S rRNA-Gene verstärkt mit Domain-Ebene bakterielle Primer, die enthalten Sequenzierung Adapter und einzigartig, probenspezifische Sequenzen (Barcodes). Die Amplifikate werden gereinigt, quantifiziert und vereinigt in einem äquimolaren Verhältnis. Die gepoolten Proben werden dann klonal in einer Emulsions-PCR amplifiziert und sequenziert. resultierenden Sequenzen werden unter Verwendung öffentlich erhältlicher Werkzeuge der Bioinformatik (analysiert zB Mothur).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="544">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">Reagent</td>
			<td style="width:145px;">Company</td>
			<td style="width:128px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Ion 314 Chip Kit v2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:128px;">4482261</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Ion PGM Sequencing 200 Kit v2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:128px;">4482006</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Ion PGM Template OT2 200 Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:128px;">4480974</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HotStarTaq Plus Master Mix Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>203646</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primers and probes</td>
			<td style="width:145px;">IDT</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qiaquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA 20 mg/ml</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10,711,454,001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>65001</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

next-generation sequencing of 16s ribosomal rna gene amplicons

Eine der wichtigsten Fragen in der mikrobiellen Ökologie ist &quot;Wer ist da?&quot; Diese Frage kann mit verschiedenen Werkzeugen beantwortet werden, aber eines der lang anhaltende Gold-Standards ist es, 16S ribosomale RNA (rRNA)-Gen Amplikons von Domain-Level-PCR erzeugte Sequenz Reaktionen Verstärken von genomischer DNA. Traditionell wurde diese durch Klonierung und Sanger (Kapillarelektrophorese) Sequenzierung der PCR-Produkte durchgeführt. Das Aufkommen der nächsten Generation Sequenzierung hat sich enorm vereinfacht und erhöht die Sequenzierung Tiefe für 16S rRNA-Gen-Sequenzierung. Die Einführung von Tisch Sequenzer ermöglicht jetzt kleinen Labors, ihre 16S-rRNA-Sequenzierung im Haus in einer Angelegenheit von Tagen durchzuführen. Hier wird ein Konzept für die 16S rRNA-Gen-Sequenzierung Amplikon mit einer Tisch nächsten Generation Sequencer beschrieben. Die Umwelt-DNA wird zuerst durch PCR unter Verwendung von Primern, die Sequenzierung Adapter und Barcodes enthalten. Sie werden dann zu kugelförmigen Teilchen durch Emulsions-PCR verbunden. Die Teilchen loaded auf einem Einweg-Chip, und der Chip wird in der Maschine nach der Sequenzierung Die Sequenzierung durchgeführt wird eingefügt. Die Sequenzen sind in fastq Format abgerufen, filtriert, und die Strichcodes werden verwendet, um die Probe herzustellen Mitgliedschaft des liest. Das gefilterte und klassierte Lesevorgänge werden dann unter Verwendung öffentlich verfügbaren Tools analysiert. Ein Beispiel, wo die Analyse liest wurden mit einem Taxonomie-Suchalgorithmus innerhalb des Software-Pakets Mothur gegeben eingestuft. Die hier vorgestellte Methode ist einfach, preiswert und unkompliziert und sollte kleiner Labors helfen, die Vorteile aus dem laufenden genomische Revolution zu nehmen.

Nach der Reinigung auf einem Gel mit 25 Zyklen der PCR-Amplifikation werden die Amplifikationsprodukte der Regel in einer Konzentration von 0,2 bis 10,0 ng in 50 ul Wasser. Dies kann in Abhängigkeit von der Ausgangs-DNA-Konzentration, der Art der Probe und der Reinigungssatz variieren. Es wird empfohlen, die Anzahl der PCR-Zyklen auf den niedrigsten möglich zu halten, um Chimärenbildung zu vermeiden und zu verringern Verstärkung Vorurteile, wenn man bedenkt, dass alle Proben mit der gleichen Anzahl von Zyklen amplifiziert werden. Um die Anzahl der polyklonalen liest und leeren Bereichen zu minimieren und die Anzahl von Lesevorgängen sollte die Qubit-Verhältnis zwischen 0,1 und 0,3 und das FAM-Fluoreszenz oberhalb von 200 verwenden eine 314-Chip auf einem Ion Torrent PGM ist, ist um den mittleren Ausgangs 0,3-0,5 M gute Qualität liest nach der Filterung der Ergebnisse in Mothur. Tabelle 2 zeigt eine typische Aufteilung der Anzahl der liest nach jedem Schritt des Verfahrens für einen Lauf mit 36 Multiplex-Umweltpsychische Proben mit Primern gezielt den V3-4 Region der 16S und unter Verwendung Mothur amplifiziert. In Mothur, die trim.seqs Verfahren erzeugen eine Datei &quot;* .trim.fasta&quot;, die die Sequenzen, die den Qualitätsfilter und ein &quot;* .scrap.fasta&quot;, die die Sequenzen enthält, die nicht den Qualitätsfilter zusammen mit dem Grund bestanden haben bestanden für die Ablehnung in der Sequenz-Header. Wenn mit Barcodes in der Datei &quot;Oligos&quot; geliefert, wird dieser Befehl auch eine Datei erzeugen &quot;* .Gruppen&quot;, die die Gruppenzugehörigkeit eines jeden Sequenz basierend auf der Barcode-Sequenz enthält. Die classify.seqs Verfahren erzeugt einen &quot;.tax.summary&quot;, die in Excel geöffnet werden kann. Diese Datei enthält die Zusammenfassung der taxonomischen Zugehörigkeit (in Zeilen) für jede der Proben (Spalten). Diese Datei kann für nachgeschaltete statistische Analysen verwendet werden und die Gemeinschafts Zusammensetzung an verschiedenen taxonomischen Ebenen zu visualisieren. Die Datei &quot;.taxonomy&quot; enthält die detaillierte taxonomischeZugehörigkeit für jede Sequenz. Die durchschnittliche Zusammensetzung der Gemeinschaft an dem Stamm / Klassenstufe in allen 36 Proben ist in Abbildung 1 dargestellt. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51709/51709fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Durchschnittliche Community Komposition an der Stamm / Klasse-Niveau in allen Proben. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="248"><colgroup><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:64px;"> vorwärts </td><td style="width:139px;"> TACGGRAGGCAGCAG </td><td style="width:47px;"></td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Strichcode </td><td> CTAAGGTAAC </td><td> Sample01 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Strichcode </td><td> TAAGGAGAAC </td><td> Sample02 </td></tr><tr height = &quot;20&quot;&gt; <td height="20" style="height:20px;"> Strichcode </td><td> AAGAGGATTC </td><td> Sample03 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Strichcode </td><td> TACCAAGATC </td><td> Sample04 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Strichcode </td><td> CAGAAGGAAC </td><td> Beispiel05 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Strichcode </td><td> CTGCAAGTTC </td><td> Beispiel06 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Strichcode </td><td> TTCGTGATTC </td><td> Sample07 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Strichcode </td><td> TTCCGATAAC </td><td> Sample08 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Strichcode </td><td> TGAGCGGAAC </td><td> Sample09 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Strichcode </td><td> CTGACCGAAC </td><td> Beispiel10 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Beispiel-Datei &quot;Oligos&quot; für den Einsatz in Mothur. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="660"><colgroup><col /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"></td><td style="width:67px;"> Anzahl liest </td><td style="width:123px;"> % Der vorherigen Schritt </td><td style="width:107px;"> Durchschnittl. pro Probe </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> Anzahl der Wells </td><td align="center"> 1262519 </td><td> - </td><td align="center"> 35.070 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> Wells mit Perlen </td><td align="center"> 1114108 </td><td align="center"> 88.20% </td><td align="center"> 30.947 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> Perlen mit Vorlagen </td><td align="center"> 1112746 </td><td align="center"> 99,90% </td><td align="center"> 30.910 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> Monoklonale Perlen </td><td align="center"> 826.805 </td><td align="center"> 74.30% </td><td align="center"> 22.967 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> Gute Qualität liest (Ausgabe vom Sequenzer) </td><td align="center"> 782.204 </td><td align="center"> 94.60% </td><td align="center"> 21.728 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> Pass Mothur Filter (min. Durchschnittl. Qualitätsfaktor von 20 über einen 50 Basispunkte-Fenster, min. Länge von 150 bp) </td><td align="center"> 372.168 </td><td align="center"> 47.60% </td><td align="center"> 10.338 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> Klassifiziert am Stamm Ebene in Greengenes (50% Konfidenz-Schwelle) </td><td align="center"> 342.171 </td><td align="center"> 91.90% </td><td align="center"> 9.505 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> Eingestuft in der Ebene der Familien in Greengenes (50% Vertrauensgrenze) </td><td align="center"> 316.512 </td><td align="center"> 92,50% </td><td align="center"> 8.792 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> Eingestuft in der Gattungsebene in Greengenes (50% Vertrauensgrenze) </td><td align="center"> 289.899 </td><td align="center"> 91.60% </td><td align="center"> 8.053 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Anzahl der Lesevorgänge von einem typischen Lauf für 36 Umweltproben auf einer Ion Torrent 314 Chip gemultiplext produziert.

Watch this Scientific Journal Video about Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons at JoVE.com

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

Next-Generation-Sequenzierung der ribosomalen 16S-RNA Gene Amplikons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

next-generation-sequencing-of-16s-ribosomal-rna-gene-amplicons

Research

JoVE Journal

Biology

83.0K Aufrufe.  National Research Council Canada. Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer. 

Serie: Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the subcellular distribution of a specific tagged fluorescent marker in the secretory pathway. Arabidopsis is a powerful biological model for genetic studies because of its genome size, generation time, and conservation of molecular mechanisms among kingdoms. The array genotyping as an approach to map the mutation in alternative to the traditional method based on molecular markers is advantageous because it is relatively faster and may allow the mapping of several mutants in a really short time frame. This method allows the identification of proteins that can influence the integrity of any organelle in plants. Here, as an example, we propose a screen to map genes important for the integrity of the endoplasmic reticulum (ER). Our approach, however, can be easily extended to other plant cell organelles (for example see1,2), and thus represents an important step toward understanding the molecular basis governing other subcellular structures.

A fundamental quest in cell biology is to define the mechanisms that underlie the identity of the organelles that make eukaryotic cells. Here we propose a method to identify the genes responsible for the morphological and functional integrity of plant organelles using fluorescence microscopy and next-generation sequencing tools.

Fluoreszenz-Mikroskopie Screening und Next-Generation-Sequencing: Nützliche Tools für die Identifizierung von Genen in den Organellen Integrität beteiligt

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Forschung

Biologie

Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity and functionality of the gut community will provide insight into the effects of gut microbiota on mosquito life traits. Metagenomic RNA-Seq has become an important tool to analyze transcriptomes from various microbes present in a microbial community. Messenger RNA usually comprises only 1-3% of total RNA, while rRNA constitutes approximately 90%. It is challenging to enrich messenger RNA from a metagenomic microbial RNA sample because most prokaryotic mRNA species lack stable poly(A) tails. This prevents oligo d(T) mediated mRNA isolation. Here, we describe a protocol that employs sample derived rRNA capture probes to remove rRNA from a metagenomic total RNA sample. To begin, both mosquito and microbial small and large subunit rRNA fragments are amplified from a metagenomic community DNA sample. Then, the community specific biotinylated antisense ribosomal RNA probes are synthesized in vitro using T7 RNA polymerase. The biotinylated rRNA probes are hybridized to the total RNA. The hybrids are captured by streptavidin-coated beads and removed from the total RNA. This subtraction-based protocol efficiently removes both mosquito and microbial rRNA from the total RNA sample. The mRNA enriched sample is further processed for RNA amplification and RNA-Seq.

A ribosomal RNA (rRNA) depletion protocol was developed to enrich messenger RNA (mRNA) for RNA-seq of the mosquito gut metatranscriptome. Sample specific rRNA probes, which were used to remove rRNA via subtraction, were created from the mosquito and its gut microbes. Performance of the protocol can result in the removal of approximately 90-99% of rRNA.

Depletion der ribosomalen RNA für Mosquito Gut metagenomische RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

Gezielte DNA Methylierungsanalyse von Next-Generation-Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplification, Next-Generation-Sequenzierung und genomischer DNA Mapping von Retrovirale Integration Seiten

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

Effiziente Nukleinsäure-Extraktion und 16S rRNA Gen-Sequenzierung für bakterielle Gemeinschaft Charakterisierung

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

RNA-Sequenzierung Assay Gezieltes Genexpression und Genomic Änderungen an Charakterisieren

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. Deviations from what is considered a healthy microbiota composition (dysbiosis) may impair vital functions leading to pathologic conditions. Recent and ongoing research efforts have been directed toward the characterization of associations between microbial composition and human health and disease.
Advances in high-throughput sequencing technologies enable characterization of the gut microbial composition. These methods include 16S rRNA-amplicon sequencing and shotgun sequencing. 16S rRNA-amplicon sequencing is used to profile taxonomical composition, while shotgun sequencing provides additional information about gene predictions and functional annotation. An advantage in using a targeted sequencing method of the 16S rRNA gene variable region is its substantially lower cost compared to shotgun sequencing. Sequence differences in the 16S rRNA gene are used as a microbial fingerprint to identify and quantify different taxa within an individual sample.
Major international efforts have enlisted standards for 16S rRNA-amplicon sequencing. However, several studies report a common source of variation caused by batch effect. To minimize this effect, uniformed protocols for sample collection, processing, and sequencing must be implemented. This protocol proposes the integration of broadly used protocols starting from fecal sample collection to data analyses. This protocol includes a column-free, direct-PCR approach that enables simultaneous handling and DNA extraction of large numbers of fecal samples, along with PCR amplification of the V4 region. In addition, the protocol describes the analysis pipeline and provides a script using the latest version of QIIME (QIIME 2 version 2017.7.0 and DADA2). This step-by-step protocol is aimed to guide those interested in initiating the use of 16S rRNA-amplicon sequencing in a robust, reproductive, easy to use, detailed way.

This manuscript describes a detailed standardized protocol of high-throughput 16S rRNA-amplicon sequencing. The protocol introduces an integrated, uniformed, feasible, and inexpensive protocol starting from fecal sample collection through data analyses. This protocol enables analysis of large numbers of samples with rigorous standards and several controls.

Geführte Protokoll für fäkale mikrobielle Charakterisierung von 16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective and widely available vaccines are lacking for a majority of these diseases, necessitating the development of novel disease mitigation strategies. To this end, a promising avenue of disease control involves targeting the vector microbiome, the community of microbes inhabiting the vector. The vector microbiome plays a pivotal role in pathogen dynamics, and manipulations of the microbiome have led to reduced vector abundance or pathogen transmission for a handful of vector-borne diseases. However, translating these findings into disease control applications requires a thorough understanding of vector microbial ecology, historically limited by insufficient technology in this field. The advent of next-generation sequencing approaches has enabled rapid, highly parallel sequencing of diverse microbial communities. Targeting the highly-conserved 16S rRNA gene has facilitated characterizations of microbes present within vectors under varying ecological and experimental conditions. This technique involves amplification of the 16S rRNA gene, sample barcoding via PCR, loading samples onto a flow cell for sequencing, and bioinformatics approaches to match sequence data with phylogenetic information. Species or genus-level identification for a high number of replicates can typically be achieved through this approach, thus circumventing challenges of low detection, resolution, and output from traditional culturing, microscopy, or histological staining techniques. Therefore, this method is well-suited for characterizing vector microbes under diverse conditions but cannot currently provide information on microbial function, location within the vector, or response to antibiotic treatment. Overall, 16S next-generation sequencing is a powerful technique for better understanding the identity and role of vector microbes in disease dynamics.

Here we present a next-generation sequencing protocol for 16S rRNA sequencing which enables identification and characterization of microbial communities within vectors. This method involves DNA extraction, amplification and barcoding of samples through PCR, sequencing on a flow-cell, and bioinformatics to match sequence data to phylogenetic information.

Tick Microbiome Charakterisierung von Next-Generation-16 s rRNA Amplikons Sequenzierung

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

Mikrobiota-Analyse mit zweistufiger PCR- und 16S-rRNA-Gensequenzierung der nächsten Generation

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high quality and quantity DNA from a well-preserved individual mosquito sufficient for downstream whole genome sequencing. However, reliance on an expensive automated DNA extraction instrument can be prohibitive for many laboratories. Here, the study provides a budget-friendly magnetic-bead-based DNA extraction protocol, which is suitable for low to medium throughput. The protocol described here was successfully tested using individual Aedes aegypti mosquito samples. The reduced costs associated with high quality DNA extraction will increase the application of high throughput sequencing to resource limited labs and studies.

Described here is a DNA extraction protocol using magnetic beads to produce high quality DNA extractions from mosquitoes. These extractions are suitable for a downstream next-generation sequencing approach.

Ein magnetperlenbasiertes Moskito-DNA-Extraktionsprotokoll für die Sequenzierung der nächsten Generation

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...