Wir danken Dr. Evan Jellison und Frau Li Zhu im Durchflusszytometrie-Kern von UConn Health für ihre Unterstützung bei der Durchflusszytometrie, Dr. Lynn Puddington in der Abteilung für Immunologie an der UConn Health für ihre Unterstützung der Instrumente, Frau Slawa Gajewska und Dr. Paul Appleton im klinischen Forschungskern von UConn Health für ihre Hilfe bei der Gewinnung von Blutproben. Wir danken Dr. Christopher "Kit" Bonin und Dr. Geneva Hargis von der UConn School of Medicine für ihre Hilfe beim wissenschaftlichen Schreiben und Lektorat dieses Manuskripts. Diese Forschung wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health, des National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL145454), des National Institute of General Medical Sciences (P20GM121176), USA, eines Career Development Award der American Heart Association (18CDA34110426) und eines Startkapitalfonds von UConn Health unterstützt. Abbildung 1 wurde mit BioRender.com erstellt.

Heparinisierte Vollblutproben wurden von anonymisierten gesunden menschlichen Spendern nach Einholung der Einverständniserklärung gemäß den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki gewonnen, wie vom Institutional Review Board der UConn Health genehmigt. Von allen Spendern wurde eine Einverständniserklärung eingeholt. Die Ein-/Ausschlusskriterien für diese Studie wurden sorgfältig entwickelt, um die Eignung der Teilnehmer sicherzustellen und potenzielle Risiken zu minimieren. Die teilnahmeberechtigten Teilnehmer waren zwischen 18 und 65 Jahre alt, hatten eine beliebige ethnische Zugehörigkeit, sprachen fließend Englisch und waren in der Lage, eine informierte Einwilligung zu geben. Zu den ausgeschlossenen Teilnehmern gehörten diejenigen, die nicht in der Lage waren, eine Einwilligung nach Aufklärung für sich selbst zu geben, wie z. B. diejenigen, die einen gesetzlichen Vertreter benötigen, Personen unter 18 oder über 65 Jahren, inhaftierte Personen und schwangere Frauen. Darüber hinaus mussten die Teilnehmer frei von entzündungshemmenden Medikamenten und entzündlichen Zuständen sein. Aktuelle Infektionen oder anhaltende chronische oder akute Entzündungszustände waren ebenfalls Ausschlusskriterien. Schließlich waren Personen mit einer aktuellen oder kürzlichen COVID-19-Infektion in der Vorgeschichte nicht für die Studie geeignet. Diese Kriterien wurden entwickelt, um die Sicherheit und Eignung der Teilnehmer zu gewährleisten und gleichzeitig potenzielle Störfaktoren zu minimieren, die sich auf die Studienergebnisse auswirken könnten.
1. Herstellung der Reagenzien
<ol><li>Neutrophiles Medium: Bereiten Sie das neutrophile Medium vor, indem Sie RPMI-1640 2 % humanes Serumalbumin ohne Phenolrot hinzufügen (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>fMLP-Lösung: Bereiten Sie die fMLP-Lösung vor, indem Sie sie 100-fach aus der 10-mM fMLP-Speicherlösung für Dimethylsulfoxid (DMSO) (siehe Materialtabelle) mit RPMI 1640 ohne Phenolrot verdünnen, was zu einer 100 μM fMLP-Lösung führt.</li>
	<li>Antikörperlösung: Verdünnen Sie 120 μl des mit Allophycocyanin (APC) konjugierten monoklonalen Antikörpers mAb24 (mAb24-APC) (siehe Materialtabelle), der die hochaffine Konformation von β2-Integrin angibt, in 10 ml neutrophilem Medium, wodurch eine 1,2 μg/ml mAb24-APC-Lösung entsteht.</li>
	<li>Compound-Bibliothek: Verdünnen Sie die anfängliche Compound-Bibliothek mit einer Konzentration von 10 mM bis 1 mM, indem Sie 5 μl der 10-mM-Bibliothek (siehe Materialtabelle) zu 45 μl DMSO in 384-Well-Platten mit dem Liquid Handler hinzufügen. Anschließend werden 5 μl pro Well der 1-mM-Compound-Bibliothek mit dem Liquid Handler auf eine leere 384-Well-Platte übertragen.</li>
	<li>Wie in Abbildung 1 dargestellt, enthielten vier Spalten ( 1, 2, 23, 24) nur DMSO, aber keine Verbindungen, die als Positiv- und Negativkontrollen im Screening dienten. Jede Vertiefung wird weiter verdünnt, indem 45 μl RPMI-1640 ohne Phenolrot hinzugefügt werden, was zu einer Endkonzentration von 100 μM für alle Verbindungen führt.</li>
</ol>2. Isolierung von Neutrophilen aus menschlichem Blut
<ol><li>Mit einer serologischen Pipette vorsichtig 4 ml Blut über 8 ml eines handelsüblichen Dichtegradientenmediums (siehe Materialtabelle) in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen schichten (Abbildung 2A).</li>
	<li>Das Blut wird bei 550 × g für 30-50 min bei 20 °C zentrifugiert. Bremsen Sie den Rotor schrittweise ab (Verzögerungsfaktor 1). HINWEIS: Die erfolgreiche Trennung von Neutrophilen (Band 2 in Abbildung 2B) von roten Blutkörperchen kann je nach Spender variieren. Für die meisten Spender ist eine 30-minütige Zentrifugation ausreichend. Bei einigen Spendern kann jedoch eine zusätzliche Zentrifugation von 10 bis 30 Minuten erforderlich sein, wenn die Trennung nicht erfolgreich ist (Abbildung 2C).</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig das Plasma (die gelbe Flüssigkeit auf der Oberseite) und die mononukleären Zellen (das obere trübe Band; PBMC-Bande in Abbildung 2B) mit einer 1-ml-Pipette.</li>
	<li>Neutrophile Granulozyten werden aus dem unteren trüben Band (Neutrophilenband in Abbildung 2B) und etwa 3-4 ml unterhalb der klaren Flüssigkeit in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gesammelt. Mischen Sie die Neutrophilensuspension vorsichtig, indem Sie sie 2-3 Mal invertieren.</li>
	<li>Die Suspension wird bei 400 × g für 10 min bei 20 °C zentrifugiert und anschließend der Überstand vorsichtig durch Dekantieren entfernt.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit 5 ml PBS und zentrifugieren Sie es bei 300 × g für 5 Minuten bei 20 °C.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand durch Dekantieren und entfernen Sie vorsichtig alle Restüberstände um die Röhrchenmündung und an der Röhrchenwand durch Vakuumabsaugung. Resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml neutrophilem Medium.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellzahlen mit einem Hämozytometer. Typischerweise wurden 1 bis 4 × 107 Neutrophile aus 8 ml menschlichem Blut gewonnen. HINWEIS: Es kann zu einer Kontamination der roten Blutkörperchen in der Neutrophilensuspension kommen. Rote Blutkörperchen haben keinen signifikanten Einfluss auf die meisten Assays und können die Aktivierung/das Priming von Neutrophilen verhindern27. Rote Blutkörperchen müssen vor der Zählung lysiert werden, um eine genaue Neutrophilenkonzentration zu erhalten. Geben Sie 10 μl der Zellsuspension für 10-30 s zu 891 μl deionisiertem Wasser, um die roten Blutkörperchen zu lysieren, und fügen Sie dann 99 μl 10× PBS hinzu, um den osmotischen Druck auszugleichen und die Lyse der Neutrophilen zu verhindern.</li>
	<li>Stellen Sie die Zelldichte auf 6,25 × 105 Zellen/ml ein, indem Sie neutrophiles Medium hinzufügen.</li>
</ol>3. Vorbereitung der 384-Well-Platte
<ol><li>In einem 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen wird 1 ml der Antikörperlösung (1,2 μg/ml mAb24-APC) mit 0,2 ml neutrophilem Medium vermischt, um eine 1 μg/ml mAb24-APC-Lösung herzustellen. Geben Sie dann 25 μl dieser Mischung in die Negativkontrollvertiefungen in einer 384-Well-Platte (die blauen Wells in Abbildung 1).</li>
	<li>In einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen werden 9 ml der Antikörperlösung mit 21,6 μl der fMLP-Lösung (100 μM) und 1,7784 ml neutrophilem Medium gemischt, um eine Lösung zu erhalten, die 1 μg/ml mAb24-APC und 200 nM fMLP enthält. Als Nächstes werden 25 μl dieser Mischung in die Positivkontroll- und Testvertiefungen in einer 384-Well-Platte gegeben (die roten und blauen Wells in Abbildung 1).</li>
	<li>Übertragen Sie 5 μl der 100-μM-Verbindungslösungen mit einer Mehrkanalpipette von der Verbindungsbibliotheksplatte auf die 384-Well-Platte.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Flüssigkeit 1 Minute lang bei 500 × g bei Raumtemperatur. HINWEIS: Zum Zentrifugieren von Platten sind ein Ausschwingrotor und Plattenbecher erforderlich.</li>
</ol>4. Behandlung von Zellen
<ol><li>Geben Sie 20 μl der neutrophilen Suspension mit einer 16-Kanal-Pipette (5-50 μl-Bereich für jede Säule der 384-Well-Platte) in jede Vertiefung. Mischen Sie vorsichtig 5-10 Mal mit der Pipette und halten Sie dabei ein gleichbleibendes Zeitintervall zwischen den einzelnen Pipettiervorgängen ein. ANMERKUNG: Die endgültigen Konzentrationen in den Wells sind wie folgt: Neutrophile 2,5 × 105 Zellen/ml (alle Wells); mAb24-APC 0,5 μg/ml (alle Vertiefungen); fMLP 100 nM (Positivkontroll- und Testbohrungen); Verbindungen 10 μM (Testbrunnen).</li>
	<li>Die Platte auf einem Schüttler bei 300 U/min bei Raumtemperatur (RT) 10 Minuten lang inkubieren.</li>
	<li>Fixieren Sie die Zellen, indem Sie mit einer 16-Kanal-Pipette 3 μl 16 % Paraformaldehyd (PFA) in jede Vertiefung geben (endgültige PFA-Konzentration ~0,91 %). Dann 10 Minuten auf Eis inkubieren. HINWEIS: Es wird empfohlen, beim Hinzufügen von Neutrophilen und PFA ein konsistentes Zeitintervall zwischen den verschiedenen Spalten einzuhalten. Dadurch wird sichergestellt, dass die Neutrophilen in jedem Well die gleiche Inkubationszeit mit fMLP und mAb24-APC haben.</li>
</ol>5. Durchflusszytometrie
<ol><li>Schalten Sie das Durchflusszytometer ein (siehe Materialtabelle) und stellen Sie sicher, dass der an das Gerät angeschlossene Computer ebenfalls eingeschaltet ist.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass der Behälter für die Mantelflüssigkeit gefüllt ist und der Abfallbehälter leer und ordnungsgemäß an das Gerät angeschlossen ist.</li>
	<li>Laden Sie die 384-Well-Platte auf den Probenlader des Durchflusszytometers. Stellen Sie sicher, dass die A1-Vertiefung der Platte mit der A1-Markierung auf dem Lader übereinstimmt.</li>
	<li>Öffnen Sie die Software und erstellen Sie ein neues Experiment. Wählen Sie 384 Well und wählen Sie die gewünschten Fluorophore. Klicken Sie anschließend auf Plate setup, ziehen Sie, um alle Wells auszuwählen, und klicken Sie dann auf Sample. Aktivieren Sie den Schalter "Hoher Durchsatz" und wählen Sie im Bereich "Rate" die Option "Hoch" aus.<ol><li>Geben Sie im Feld Volume den Wert 50 ein. Wählen Sie Proben in ungeraden Spalten aus und aktivieren Sie dann den Schalter "Rühren". Benennen Sie abschließend die Beispiele im rechten Bereich.</li>
	</ol></li>
	<li>Klicken Sie auf Plot and gate. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche "Anwenden" (zwei Pfeile auf einem grün gefüllten Kreis) und anschließend auf die Schaltfläche "Wiedergabe" (Dreiecksform). Warten Sie einige Sekunden, um einige Zellen aus der ersten Vertiefung zu beobachten, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Pause.<ol><li>Passen Sie die FSC- und SSC-Spannungen an, um eine korrekte Visualisierung der Zellen im Diagramm zu gewährleisten. Klicken Sie auf Akquisition und dann auf die Wiedergabeschaltfläche (Dreiecksform), um den Assay zu starten.</li>
	</ol></li>
	<li>Das Durchflusszytometer entnimmt sequentiell ~50 μl von 1000-3000 Neutrophilen aus jeder Vertiefung. Es wird etwa 3 Stunden dauern, bis die gesamte 384-Well-Platte fertiggestellt ist.</li>
	<li>Nachdem Sie alle Beispiele abgeschlossen haben, exportieren Sie die FCS-Dateien für den nächsten Schritt.</li>
</ol>6. Datenanalyse
<ol><li>Öffnen Sie die Datenanalyse-Software für die Durchflusszytometrie (siehe Materialtabelle). Wählen Sie den Ordner mit allen .fcs-Dateien aus, ziehen Sie ihn in das Softwarefenster und lassen Sie ihn los, um die Daten in die Software zu importieren.</li>
	<li>Doppelklicken Sie auf eine Probe, um einzelne Neutrophile basierend auf FSC und SSC28,29,30 im Pop-up-Fenster zu gruppieren, wie in Abbildung 3 gezeigt. Wählen Sie die abgegrenzten Zeilen aus, ziehen Sie sie in den Ordner und lassen Sie sie dann los, um das Gating auf alle Beispiele in diesem Ordner anzuwenden.</li>
	<li>Berechnen und exportieren Sie die mittlere APC-Fluoreszenzintensität (MFI) von Neutrophilen aus jedem Well mit der Tabelleneditor-Funktion der Software. Klicken Sie auf Spalte hinzufügen auf der Registerkarte Bearbeiten. Wählen Sie auf der Registerkarte Statistik die Option Median aus, wählen Sie die Neutrophilen der eingeschränkten Population aus, und wählen Sie APC als Parameter aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche OK.</li>
	<li>Kehren Sie zur Registerkarte "Tabelleneditor" zurück, wählen Sie auf der Registerkarte "Gruppe" die Option Alle Beispiele aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Tabelle erstellen . Es erscheint ein neues Fenster, in dem die erstellte Tabelle angezeigt wird. Speichern Sie es als Text-, CSV- oder Excel-Datei.</li>
	<li>Öffnen Sie die exportierte Tabelle, berechnen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung des APC-MFI für die positiven und negativen Kontrollproben (Abbildung 4).</li>
	<li>Berechnen Sie den Z'-Faktor (Z') der Platte mit der Gleichung: Z' = 1 - 3(σ p + σ n)/(μp - μn), wobei σ p und σ n die Standardabweichungen der Positiv- bzw. Negativkontrollen sind und μp und μn die Mittelwerte der Positiv- bzw. Negativkontrollen sind31. ANMERKUNG: Der Faktor Z' gibt die Trennung der positiven und negativen Kontrollverteilung an. Ein Z' von 0 bedeutet keine Trennung, während ein Z' von 0,5 eine gleichmäßige Trennung angibt. Wie bereits in einer früheren Studieerwähnt 31, weist Z' > 0,5 auf einen ausgezeichneten Assay für das Screening von Verbindungen hin. Ein Z' im Bereich von 0,5 bis 0 ist akzeptabel, aber es kann nur starke Treffer im Assay identifizieren, was eine weitere Validierung in sekundären Assays erfordert.</li>
	<li>Betrachten Sie Verbindungen als "Treffer" für das Screening, wenn der APC-MFI von mit Substanzen behandelten Neutrophilen niedriger ist als das Dreifache der Standardabweichung des MFI der Positivkontrolle, subtrahiert vom MFI der Positivkontrolle (P = 0,0013, dargestellt durch die gestrichelte Linie in Abbildung 4).</li>
</ol>

Screening von β2-Integrin-Aktivierungsinhibitoren in humanen Neutrophilen

<ol>
	<li>Herrero-Cervera, A., Soehnlein, O., Kenne, E. Neutrophils in chronic inflammatory diseases. Cellular &#38; Molecular Immunology. 19 (2), 177-191 (2022).</li>
	<li>Sadik, C. D., Kim, N. D., Luster, A. D. Neutrophils cascading their way to inflammation. Trends in immunology. 32 (10), 452-460 (2011).</li>
	<li>Mitroulis, I. et al. Leukocyte integrins: Role in leukocyte recruitment and as therapeutic targets in inflammatory disease. Pharmacology &#38; Therapeutics. 147, 123-135 (2015).</li>
	<li>Slack, R. J., Macdonald, S. J. F., Roper, J. A., Jenkins, R. G., Hatley, R. J. D. Emerging therapeutic opportunities for integrin inhibitors. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (1), 60-78 (2022).</li>
	<li>Frampton, J. E., Plosker, G. L. Efalizumab. American Journal of Clinical Dermatology. 10 (1), 51-72 (2009).</li>
	<li>Talamonti, M. et al. Efalizumab. Expert Opinion on Drug Safety. 10 (2), 239-251 (2011).</li>
	<li>Sariba&#351;, A. S., &#214;zdemir, A., Lam, C., Safak, M. JC virus-induced progressive multifocal leukoencephalopathy. Future Virology. 5 (3), 313-323 (2010).</li>
	<li>Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 220-233 (2009).</li>
	<li>Mancuso, R. V., Casper, J., Schmidt, A. G., Kr&#228;henb&#252;hl, S., Weitz-Schmidt, G. Anti-&#945;L&#946;2 antibodies reveal novel endocytotic cross-modulatory functionality. British Journal of Pharmacology. 177 (12), 2696-2711 (2020).</li>
	<li>Anderson, J. M., Li, J., Springer, T. A. Regulation of integrin &#945;5&#946;1 conformational states and intrinsic affinities by metal ions and the ADMIDAS. Molecular Biology of the Cell. 33 (6), ar56 (2022).</li>
	<li>Jensen, R. K. et al. Complement receptor 3 forms a compact high-affinity complex with iC3b. The Journal of Immunology. 206 (12), 3032-3042 (2021).</li>
	<li>Li, J., Yan, J., Springer, T. A. Low affinity integrin states have faster ligand binding kinetics than the high affinity state. Elife. 10, e73359 (2021).</li>
	<li>Luo, B. H., Carman, C. V., Springer, T. A. Structural basis of integrin regulation and signaling. Annual Review of Immunology. 25, 619-647 (2007).</li>
	<li>Fan, Z. et al. Neutrophil recruitment limited by high-affinity bent &#946;2 integrin binding ligand in cis. Nature communications. 7 (1), 1-14 (2016).</li>
	<li>Fan, Z. et al. High-affinity bent &#946;2-integrin molecules in arresting neutrophils face each other through binding to ICAMs in cis. Cell reports. 26 (1), 119-130 (2019).</li>
	<li>Gupta, V. et al. The &#946;-tail domain (&#946;TD) regulates physiologic ligand binding to integrin CD11b/CD18. Blood. 109 (8), 3513-3520 (2006).</li>
	<li>Sen, M., Yuki, K., Springer, T. A. An internal ligand-bound, metastable state of a leukocyte integrin, &#945;X&#946;2. Journal of Cell Biology. 203 (4), 629-642 (2013).</li>
	<li>Sun, H., Hu, L., Fan, Z. &#946;2 integrin activation and signal transduction in leukocyte recruitment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 321 (2), C308-C316 (2021).</li>
	<li>Sun, H., Zhi, K., Hu, L., Fan, Z. The activation and regulation of &#946;2 integrins in phagocytes. Frontiers in Immunology. 12, 978 (2021).</li>
	<li>Kamata, T. et al. The role of the CPNKEKEC sequence in the &#946;2 subunit I domain in regulation of integrin &#945;L&#946;2 (LFA-1). The Journal of Immunology. 168 (5), 2296-2301 (2002).</li>
	<li>Lu, C., Shimaoka, M., Zang, Q., Takagi, J., Springer, T. A. Locking in alternate conformations of the integrin &#945;L&#946;2 I domain with disulfide bonds reveals functional relationships among integrin domains. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (5), 2393-2398 (2001).</li>
	<li>Yang, W., Shimaoka, M., Chen, J., Springer, T. A. Activation of integrin &#946;-subunit I-like domains by one-turn C-terminal &#945;-helix deletions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (8), 2333-2338 (2004).</li>
	<li>Dransfield, I., Hogg, N. Regulated expression of Mg2+ binding epitope on leukocyte integrin alpha subunits. The EMBO Journal. 8 (12), 3759-3765 (1989).</li>
	<li>Torres, M., Hall, F., O&#39;neill, K. Stimulation of human neutrophils with formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine induces tyrosine phosphorylation and activation of two distinct mitogen-activated protein-kinases. The Journal of Immunology. 150 (4), 1563-1577 (1993).</li>
	<li>Dorward, D. A. et al. The role of formylated peptides and formyl peptide receptor 1 in governing neutrophil function during acute inflammation. The American Journal of Pathology. 185 (5), 1172-1184 (2015).</li>
	<li>Lin, F. Y. et al. A general chemical principle for creating closure-stabilizing integrin inhibitors. Cell. 185 (19), 3533-3550 (2022).</li>
	<li>Lizcano, A. et al. Erythrocyte sialoglycoproteins engage Siglec-9 on neutrophils to suppress activation. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 129 (23), 3100-3110 (2017).</li>
	<li>Tadema, H., Abdulahad, W. H., Stegeman, C. A., Kallenberg, C. G., Heeringa, P. Increased expression of Toll-like receptors by monocytes and natural killer cells in ANCA-associated vasculitis. PloS One. 6 (9), e24315 (2011).</li>
	<li>Nagelkerke, S. Q., aan de Kerk, D. J., Jansen, M. H., van den Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Failure to detect functional neutrophil B helper cells in the human spleen. PloS one. 9 (2), e88377 (2014).</li>
	<li>Blanco-Camarillo, C., Alem&#225;n, O. R., Rosales, C. Low-density neutrophils in healthy individuals display a mature primed phenotype. Frontiers in Immunology. 12, 672520 (2021).</li>
	<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of biomolecular screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
	<li>Shimaoka, M., Salas, A., Yang, W., Weitz-Schmidt, G., Springer, T.A. Small molecule integrin antagonists that bind to the &#946;2 subunit I-like domain and activate signals in one direction and block them in the other. Immunity. 19 (3), 391-402 (2003).</li>
	<li>Liu, W. et al. Nexinhib20 Inhibits neutrophil adhesion and &#946;2 integrin activation by antagonizing Rac-1-Guanosine 5&#8242;-Triphosphate interaction. The Journal of Immunology. 209 (8), 1574-1585 (2022).</li>
	<li>Robinson, M. et al. Antibody against the Leu-CAM beta-chain (CD18) promotes both LFA-1-and CR3-dependent adhesion events. The Journal of Immunology. 148 (4), 1080-1085 (1992).</li>
	<li>Lu, C., Ferzly, M., Takagi, J., Springer, T. A. Epitope mapping of antibodies to the C-terminal region of the integrin &#946;2 subunit reveals regions that become exposed upon receptor activation. The Journal of Immunology. 166 (9), 5629-5637 (2001).</li>
	<li>Mauler, M. et al. Platelet serotonin aggravates myocardial ischemia/reperfusion injury via neutrophil degranulation. circulation. 139 (7), 918-931 (2019).</li>
	<li>Shen, X. F., Cao, K., Jiang, J., Guan, W. X., Du, J. F. Neutrophil dysregulation during sepsis: an overview and update. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (9), 1687-1697 (2017).</li>
	<li>Chiang, C. C., Cheng, W. J., Korinek, M., Lin, C. Y., Hwang, T. L. Neutrophils in Psoriasis. Frontiers in Immunology. 10, 02376 (2019).</li>
	<li>Lood, C. et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature medicine. 22 (2), 146-153 (2016).</li>
	<li>Bazzoni, G., Shih, D. T., Buck, C. A., Hemler, M. E. Monoclonal antibody 9EG7 defines a novel &#946;1 integrin epitope induced by soluble ligand and manganese, but inhibited by calcium. Journal of Biological Chemistry. 270 (43), 25570-25577 (1995).</li>
	<li>Luque, A. et al. Activated conformations of very late activation integrins detected by a group of antibodies (HUTS) specific for a novel regulatory region(355-425) of the common &#946;1 chain. Journal of Biological Chemistry. 271 (19), 11067-11075 (1996).</li>
	<li>Mould, A. P., Akiyama, S. K., Humphries, M. J. The inhibitory Anti-&#946;1 integrin monoclonal antibody 13 recognizes an epitope that is attenuated by ligand occupancy: evidence for allosteric inhibition of integrin function. Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20365-20374 (1996).</li>
	<li>Spiess, M. et al. Active and inactive &#946;1 integrins segregate into distinct nanoclusters in focal adhesions. Journal of Cell Biology. 217 (6), 1929-1940 (2018).</li>
	<li>Yang, S. et al. Relating conformation to function in integrin &#945;5&#946;1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), E3872-E3881 (2016).</li>
	<li>Shattil, S. J., Hoxie, J. A., Cunningham, M., Brass, L. F. Changes in the platelet membrane glycoprotein IIb.IIIa complex during platelet activation. Journal of Biological Chemistry. 260 (20), 11107-11114 (1985).</li>
	<li>Shattil, S. J., Motulsky, H. J , Insel, P. A., Flaherty, L., Brass, L. F. Expression of fibrinogen receptors during activation and subsequent desensitization of human platelets by epinephrine. Blood. 68 (6), 1224-1231 (1986).</li>
	<li>Carre&#241;o, R. et al. 2E8 binds to the high affinity i-domain in a metal ion-dependent manner: a second generation monoclonal antibody selectively targeting activated LFA-1. Journal of Biological Chemistry. 285 (43), 32860-32868 (2010).</li>
	<li>Keizer, G. D., Visser, W., Vliem, M., Figdor, C. G. A monoclonal antibody (NKI-L16) directed against a unique epitope on the alpha-chain of human leukocyte function-associated antigen 1 induces homotypic cell-cell interactions. The Journal of Immunology. 140 (5), 1393-1400 (1988).</li>
	<li>Lefort, C. T. et al. Distinct roles for talin-1 and kindlin-3 in LFA-1 extension and affinity regulation. Blood. 119 (18), 4275-4282 (2012).</li>
	<li>van Kooyk, Y. et al. Activation of LFA-1 through a Ca2(+)-dependent epitope stimulates lymphocyte adhesion. Journal of Cell Biology. 112 (2), 345-354 (1991).</li>
	<li>Mould, A. P. et al. Conformational changes in the integrin a domain provide a mechanism for signal transduction via hybrid domain movement. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17028-17035 (2003).</li>
	<li>Chigaev, A. et al. Real-time analysis of conformation-sensitive antibody binding provides new insights into integrin conformational regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (21), 14337-14346 (2009).</li>
	<li>Njus, B. H. et al. Conformational mAb as a tool for integrin ligand discovery. Assay and Drug Development Technologies. 7 (5), 507-515 (2009).</li>
	<li>Chigaev, A., Wu, Y., Williams, D. B., Smagley, Y., Sklar, L. A. Discovery of very late antigen-4 (VLA-4, &#945;4&#946;1 integrin) allosteric antagonists. Journal of Biological Chemistry. 286 (7), 5455-5463 (2011).</li>
	<li>Ghigo, A., De Santi, C., Hart, M., Mitash, N., Swiatecka-Urban, A. Cell signaling and regulation of CFTR expression in cystic fibrosis cells in the era of high efficiency modulator therapy. Journal of Cystic Fibrosis. 22, S12-S16 (2023).</li>
	<li>Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B.J. Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function. Journal of Cystic Fibrosis. 13 (1), 29-36 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Die Initiierung und Beendigung der Stimulation und Färbung von Neutrophilen wird durch die Zugabe von Neutrophilen und dem Fixiermittel PFA bestimmt. Daher ist es wichtig, das gleiche Zeitintervall zwischen dem Pipettieren von Neutrophilen oder PFA in jede Säule zu gewährleisten. Dadurch wird sichergestellt, dass die Stimulations- und Färbezeit der Neutrophilen aus jeder Vertiefung konstant bleibt. Aufgrund der kurzen Lebensdauer von Neutrophilen muss das gesamte Experiment, von der Blutentnahme bei den Spendern bis ...

Viele entzündliche Erkrankungen sind durch die Infiltration von Neutrophilen an der Schwellungs- oder Verletzungsstelle gekennzeichnet1. Um in diese Gewebe einzudringen, müssen die Neutrophilen die Rekrutierungskaskade der Neutrophilen durchlaufen, die einen Arrest im Endothel, eine Extravasation über die Gefäßwand und eine Rekrutierung in das Gewebe beinhaltet2. Zirkulierende Neutrophile benötigen eine β2-Integrin-Aktivierung, um diese Kaskade zu vervollständigen, insbesondere für die Arrestphase. Daher können Integrin-hemmende Medikamente, die die Adhäsion, Extravasation und Rekrutierung von Neutrophilen reduzieren, entzündliche Erkrankungen wirksam behandeln 3,4.
β2-Integrine wurden schon früher für entzündliche Erkrankungen ins Visier genommen. Efalizumab, ein monoklonaler Antikörper, der direkt gegen Integrin αLβ2 gerichtet ist, wurde zur Behandlung von Psoriasis5 entwickelt. Efalizumab wurde jedoch aufgrund seiner tödlichen Nebenwirkung - progressiver multifokaler Leukenzephalopathie infolge einer Reaktivierung des JC-Virus - zurückgezogen 6,7. Neue entzündungshemmende Integrin-basierte Therapien sollten die Aufrechterhaltung der antiinfektiösen Funktionen von Leukozyten berücksichtigen, um Nebenwirkungen zu minimieren. Die Nebenwirkungen von Efalizumab könnten auf die verlängerte Zirkulation monoklonaler Antikörper im Blutkreislauf zurückzuführen sein, die langfristig die Immunfunktionen hemmen könnten8. Eine aktuelle Studie zeigt, dass Efalizumab die αLβ2-Vernetzung und die unerwünschte Internalisierung von α4-Integrinen vermittelt, was eine alternative Erklärung für die Nebenwirkungen liefert9. Daher könnten kurzlebige, niedermolekulare Antagonisten dieses Problem vermeiden.
Eine Hochdurchsatzmethode zum Screening von niedermolekularen β2-Integrin-Antagonisten unter Verwendung humaner Neutrophiler wird hier vorgestellt. Die β2-Integrinaktivierung erfordert Konformationsänderungen der Integrin-Ektodomäne, um Zugang zu ihrem Liganden zu erhalten und ihre Bindungsaffinität zu diesem zu erhöhen. Im kanonischen Switchblade-Modell dehnt sich die gebogene geschlossene Integrin-Ektodomäne zunächst zu einer extended-closed Konformation aus und öffnet dann ihr Kopfstück zu einer vollständig aktivierten extended-open Konformation10,11,12,13. Es gibt auch einen alternativen Weg, der vom gebogen-geschlossenen zum gebogen-offenen und ausgestreckt-offenen Weg führt, schließlich 14,15,16,17,18,19. Der konformationsspezifische Antikörper mAb24 bindet an ein Epitop in der humanen β2-I-ähnlichen Domäne, wenn das Kopfstück der Ektodomäne geöffnet ist20,21,22,23.
Hier wird mit mAb24-APC bestimmt, ob die β2-Integrine aktiviert sind. Zur Aktivierung von Neutrophilen und Integrinen wird in diesem Protokoll N-Formylmethionyl-Leucylphenylalanin (fMLP), ein aus Bakterien gewonnenes kurzes chemotaktisches Peptid, das neutrophile β2-Integrine24 aktivieren kann, als Stimulus verwendet. Wenn fMLP an das Fpr1 auf Neutrophilen bindet, werden nachgeschaltete Signalkaskaden aktiviert, an denen G-Proteine, Phospholipase Cβ und Phosphoinositid-3-Kinase-γ beteiligt sind. Diese Signalereignisse führen letztendlich zu einer Integrinaktivierung über den Inside-Out-Signalweg18,25. Neben niedermolekularen Antagonisten, die direkt an β2-Integrine binden und Konformationsänderungen der Integrinaktivierungverhindern 26, würden mit dieser Methode auch Verbindungen nachgewiesen, die Komponenten des β2-Integrin-Inside-Out-Aktivierungssignalwegs hemmen können. Automatisierte Durchflusszytometer ermöglichen ein Hochdurchsatz-Screening. Die Identifizierung neuer Antagonisten kann nicht nur unser Verständnis der Integrin-Physiologie vertiefen, sondern auch translationale Einblicke in die Integrin-basierte Anti-Entzündungstherapie liefern.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16-channel pipettes</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>4661090N</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>784201</td>
			<td>Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>363410</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bravo&#160;Automated Liquid Handling Platform&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>16050-102</td>
			<td>384 multi-channel liquid handler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5810R</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Becton, Dickinson &#38; Company</td>
			<td>NA</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin Solution (25%)</td>
			<td>GeminiBio</td>
			<td>800-120</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lifitegrast</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>&#160;50-208-2121</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexinhib20</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>6089</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3506</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>UL155</td>
			<td>Accessory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate shaker&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>88-861-023</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolymorphPrep</td>
			<td>PROGEN</td>
			<td>1895 (previous 1114683)</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM)</td>
			<td>Prestwick Chemical Libraries</td>
			<td>Ver19_384</td>
			<td>1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-835-030</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swing-bucket rotor&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A-4-62</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZE5 Cell Analyzer</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>Model ZE5</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow cytometry-based high-throughput technique for screening integrin-inhibitory drugs

Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine Methode zur Identifizierung kleiner molekularer Antagonisten der β2-Integrinaktivierung unter Verwendung von Antikörpern zu etablieren, die über Konformationsänderungen berichtende Antikörper und Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie verwenden. Die Methode kann auch als Leitfaden für andere antikörperbasierte Hochdurchsatz-Screening-Methoden dienen. β2-Integrine sind Leukozyten-spezifische Adhäsionsmoleküle, die für die Immunantwort entscheidend sind. Neutrophile Granulozyten sind auf die Integrinaktivierung angewiesen, um den Blutkreislauf zu verlassen, nicht nur, um Infektionen zu bekämpfen, sondern auch, um an mehreren entzündlichen Erkrankungen beteiligt zu sein. Die Kontrolle der β2-Integrin-Aktivierung stellt einen praktikablen Ansatz zur Behandlung von Neutrophilen-assoziierten Entzündungserkrankungen dar. In diesem Protokoll wird ein monoklonaler Antikörper, mAb24, der spezifisch an das hochaffine Kopfstück von β2-Integrinen bindet, verwendet, um die Aktivierung von β2-Integrinen auf isolierten primären humanen Neutrophilen zu quantifizieren. N-Formylmethionyl-Leucyl-Phenylalanin (fMLP) wird als Stimulus zur Aktivierung neutrophiler β2-Integrine verwendet. In dieser Studie wurde ein Hochdurchsatz-Durchflusszytometer verwendet, das in der Lage ist, 384-Well-Plattenproben automatisch durchzuführen. Die Auswirkungen von 320 Chemikalien auf die β2-Integrin-Hemmung werden innerhalb von 3 h untersucht. Auf diese Weise können Moleküle identifiziert werden, die direkt auf β2-Integrine abzielen oder auf Moleküle im G-Protein-gekoppelten Rezeptor-initiierten Integrin-Inside-Out-Aktivierungssignalweg abzielen.

Die Daten eines repräsentativen 384-Well-Plattenscreenings (Abbildung 4) zeigten, dass die Negativkontrollen einen MFI von mAb24-APC von 3236 ± 110 aufwiesen, während die Positivkontrollen einen MFI von mAb24-APC von 7588 ± 858 aufwiesen. Der Z'-Faktor für diese Platte beträgt ungefähr 0,33, was innerhalb eines akzeptablen Bereichs31 liegt. Z' erfordert jedoch eine weitere Validierung in sekundären Assays.
Um die Daten zu normalisie...

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Method for Identifying Small Molecular Antagonists of Î²2 Integrin Activation at JoVE.com

Autor im Rampenlicht: Entwicklung einer Methode zur Identifizierung kleiner molekularer Antagonisten der β2-Integrin-Aktivierung 

Dieses Protokoll beschreibt eine auf Durchflusszytometrie basierende Hochdurchsatz-Screening-Methode zur Identifizierung niedermolekularer Medikamente, die die β2-Integrin-Aktivierung auf menschlichen Neutrophilen hemmen.

Eine auf Durchflusszytometrie basierende Hochdurchsatztechnik für das Screening von Integrin-hemmenden Medikamenten

This protocol aims to establish a method for identifying small molecular antagonists of &#946;2 integrin activation, utilizing ...

Unsere Forschung konzentriert sich auf neutrophile Integrine, und in dieser Studie wollen wir eine Methode etablieren, um kleine molekulare Antagonisten der Beta-2-Integrinaktivierung zu finden. Wir glauben, dass wir mit dieser Methode neue Antagonisten finden können, die unser Verständnis der Integrin-Physiologie vertiefen und auch translationale Einblicke in die Integrin-basierte entzündungshemmende Therapie liefern können. In Zukunft werden wir uns darauf konzentrieren, neue entzündungshemmende Medikamente zu entdecken und ihre Wirkmechanismen zu analysieren.

a-flow-cytometry-based-high-throughput-technique-for-screening

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs

1.6K Aufrufe.  UConn Health. Unsere Forschung konzentriert sich auf neutrophile Integrine, und in dieser Studie wollen wir eine Methode etablieren, um kleine molekulare Antagonisten der Beta-2-Integrinaktivierung zu finden. Wir glauben, dass wir mit dieser Methode neue Antagonisten finden können, die unser Verständnis der Integrin-Physiologie vertiefen und auch translationale Einblicke in die Integrin-basierte entzündungshemmende Therapie liefern können. In Zukunft werden wir uns darauf konzentrieren, neue entzündun...

Serie: Autor im Rampenlicht: Entwicklung einer Methode zur Identifizierung kleiner molekularer Antagonisten der β2-Integrin-Aktivierung 

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Ein mikroskopischer phänotypischer Assay zur Quantifizierung intrazellulärer Mykobakterien angepasst für High-Throughput/High-Content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Forschung

Immunologie und Infektion

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

Hochdurchsatz-Screening für Breitspektrum-Chemische Inhibitoren der RNA-Viren

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular processes. This technique can be used on a variety of cell types, both adherent and non-adherent, to examine a variety of cellular properties. When studying phagocytosis, fluorometric technique utilizes phagocytic cell types such as macrophages, and fluorescently labeled opsonized particles whose fluorescence can be extinguished in the presence of trypan blue. Following plating of adherent macrophages in 96-well plates, fluorescent particles (green or red) are administered and cells are allowed to phagocytose for varied amounts of time. Following internalization of fluorescent particles, cells are washed with trypan blue, which facilitates extinction of fluorescent signal from bacteria which are not internalized, or are merely adhering to the cell surface. Following the trypan wash, cells are washed with PBS, fixed, and stained with DAPI (nuclear blue fluorescent label), which serves to label nuclei of cells. By a simple fluorometric quantification through plate reading of nuclear (blue) or particle (red/green) fluorescence we can examine the ratio of relative fluorescence units of green:blue and determine a phagocytic index indicative of amount of fluorescent bacteria internalized per cell. The duration of assay using a 96-well method and multichannel pipettes for washing, from end of phagocytosis to end of data acquisition, is less than 45 min. Flow cytometry could be used in a similar manner but the advantage of fluorometry is its high throughput, rapid method of assessment with minimal manipulation of samples and quick quantification of fluorescent intensity per cell. Similar strategies can be applied to non adherent cells, live labeled bacteria, actin polymerization, and essentially any process utilizing fluorescence. Therefore, fluorometry is a promising method for its low cost, high throughput capabilities in the study of cellular processes.

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

High Throughput Fluorometric Technik zur Bewertung der Makrophagen-Phagozytose und Aktinpolymerisation

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Einrichtung eines Setup-Hochdurchsatz-Screening für kleine Moleküle, die Modulate c-di-GMP-Signalisierung in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and virus-infected or malignantly transformed cells due to a set of germline encoded inhibitory and activating receptors. Upon virus or tumor cell recognition a variety of different NK cell functions are initiated including cytotoxicity against the target cell as well as cytokine and chemokine production leading to the activation of other immune cells. It has been demonstrated that accurate NK cell functions are crucial for the treatment outcome of different virus infections and malignant diseases. Here a simple and reliable method is described to analyze different NK cell functions using a flow cytometry-based assay. NK cell functions can be evaluated not only for the whole NK cell population, but also for different NK cell subsets. This technique enables scientists to easily study NK cell functions in healthy donors or patients in order to reveal their impact on different malignancies and to further discover new therapeutic strategies.

A simple and reliable method is described here to analyze a set of NK cell functions such as degranulation, cytokine and chemokine production within different NK cell subsets.

Durchflusszytometrie-basierte Assay zur Überwachung von NK-Zell-Funktionen

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

Die Beurteilung Retinal Microglial Phagozytische Funktion<em&gt; In Vivo</em&gt; Mit einem Durchfluss-Zytometrie basierten Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

Ein Fluoreszenz-basierte Lymphocyte Assay geeignet für Hochdurchsatz-Screening von kleinen Molekülen

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, specifically eliminating tumoral and virally infected cells. Approximately 30 known monogenic defects, together with a host of other pathological conditions, cause either functional or classic NK cell deficiency, manifesting in reduced or absent cytotoxic activity. Historically, cytotoxicity has been investigated with radioactive methods, which are cumbersome, expensive and potentially hazardous. This article describes a streamlined, clinically applicable flow cytometry-based method to quantify NK cell cytotoxic activity. In this assay, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or purified NK cell preparations are co-incubated at different ratios with a target tumor cell line known to be sensitive to NK cell-mediated cytotoxicity (NKCC). The target cells are pre-labeled with a fluorescent dye to allow their discrimination from the effector cells (NK cells). After the incubation period, killed target cells are identified by a nucleic acid stain, which specifically permeates dead cells. This method is amenable to both diagnostic and research applications and, thanks to the multi-parameter capabilities of flow cytometry, has the added advantage of potentially enabling a deeper analysis of NK cell phenotype and function.

A flow cytometry-based method to quantitatively determine the cytotoxic activity of human natural killer cells is shown here.

Ein Flow Cytometry-basierte Zytotoxizität Assay für die Beurteilung der menschlichen NK-Zell-Aktivität

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Eine High-Throughput-Plattform für das Screening von Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by naturally acquired IgG antibodies specific for VAR2CSA. VAR2CSA is the parasite antigen that mediates the selective sequestration of IEs in the placenta that can cause a severe form of malaria in pregnant women, called placental malaria (PM). Protection from PM is mediated by VAR2CSA-specific antibodies that are believed to function by inhibiting placental sequestration and/or by opsonizing IEs for phagocytosis. The assay employs late-stage-synchronized IEs that have been selected in vitro to express VAR2CSA, plasma/serum-antibodies from women with naturally acquired PM-specific immunity, and the phagocytic cell line THP-1. However, the protocol can easily be modified to assay the functionality of antibodies to any parasite antigen present on the IE surface, whether induced by natural exposure or by vaccination. The assay offers simple and high-throughput evaluation, with good reproducibility, of an important functional aspect of antibody-mediated immunity in malaria. It is, therefore, useful when evaluating clinical immunity to P. falciparum malaria, a major cause of morbidity and mortality in the tropics, particularly in sub-Saharan Africa.

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

The overall goal of this protocol is to provide instruction on how to measure the capacity of antibodies present in sera or plasma of individuals, naturally exposed to Plasmodium falciparum infection, to opsonize and induce phagocytosis of the parasite-infected erythrocytes (IEs).

Messung natürlich erworbener Phagozytose-induzierender Antikörper gegen Plasmodium falciparum Parasiten durch einen Flow Cytometry-based Assay

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...