Diese Methode bietet eine Plattform mit hohem Durchsatz für das Screening von Salmonellen und Shigella. Der Hauptvorteil dieser Technik ist Wiederholung, spezifisch, empfindlich und hoher Durchsatz. Diese Technik kombiniert NAAT schnelle Methode und Kultur, in der Echtzeit-PCR-Screening wurde zuerst angewendet, und dann positive wurde für Bakterienkultur und Identifizierung gesendet.
Obwohl sich diese Methode auf Salmonellen- und Shigella-Screening konzentriert, kann sie auch auf andere Krankheitserreger wie Vibrios, Staphylococcus, E.Coli und et cetera angewendet werden. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Auswahl der richtigen Kolonie aufgrund der Hintergrundflora in Proben schwierig ist. Zunächst drei Milliliter Nährstoffbrühe zu jeder Probe hinzufügen.
Dann inkubieren Sie die Proben bei 36 Grad Celsius für sechs Stunden. Danach zentrifugieren Sie die Voranreicherungskultur bei 800 g für zwei Minuten. Dann übertragen Sie den Überstand auf ein neues Rohr und zentrifugieren Sie ihn wieder für fünf Minuten bei 12.000 g.
Nach dem Wegwerfen des Überstandes 100 Mikroliter DNA-Extraktionslösung in das Pellet geben. Dann wirbeln Sie die Röhre für eine Minute. Als nächstes erhitzen Sie die Probe bei 1.000 Grad Celsius im Trockenbad.
Nach der Wiederholung der Zentrifugation, sammeln Sie den Überstand in einem neuen Rohr. Erstellen Sie zunächst die Reaktionsmischung und stellen Sie das Radfahrprogramm entsprechend dem Textprotokoll ein. Führen Sie dann Echtzeit-PCR auf einer fluoreszierenden Echtzeit-PCR-Maschine durch.
Fügen Sie zunächst 100 Mikroliter der Voranreicherungskultur zu fünf Milliliterselenit-Kristallmedium hinzu. Dann bebrüten die Kultur bei 36 Grad Celsius für 18 bis 24 Stunden. Als nächstes sammeln Sie eine Schleife der Kultur und verteilen Sie sie auf eine Platte.
Dann bebrüten Sie die Platte bei 36 Grad Celsius für 18 bis 24 Stunden. Nach der Inkubation wählen Sie verdächtige Kolonien aus und übertragen Sie sie auf eine Platte. Inkubieren Sie die Platte bei 36 Grad Celsius für 18 bis 24 Stunden.
Identifizieren Sie dann die verdächtige Kolonie mithilfe eines automatisierten mikrobiellen Identifizierungssystems. Um mit der O-Antigen-Charakterisierung zu beginnen, fügen Sie einen Tropfen der polyvalenten Sera O-Antigen zu einem sauberen Dia hinzu. Übertragen Sie eine Schleife der Kolonie auf die Rutsche und schleifen Sie sie in der Sera.
Wenn die Bakterien wie fließender Sand aussehen, wiederholen Sie die vorherige Behandlung mit Monovalenten Seren o-Antigen, bis das Antigen charakterisiert ist. Um mit der H-Antigen-Charakterisierung zu beginnen, fügen Sie einen Tropfen Polyvalente Seren von H-Antigen zu einem sauberen Dia hinzu. Dann sammeln Sie eine Schleife der Kolonie und Grid es in der sera.
Verwenden Sie H-Antigen monovalente Seren, um die Behandlung zu wiederholen, bis das spezifische H-Antigen charakterisiert ist. Um die Kultur zu trennen, sammeln Sie eine Schleife der Voranreicherungskultur und verteilen Sie sie auf eine Platte. Dann bebrüten Den Platz bei 36 Grad Celsius für 18 bis 24 Stunden.
Nach der Inkubation, sammeln Sie eine verdächtig aussehende Kolonie auf einem Teller. Inkubieren Sie die Platte bei 36 Grad Celsius für 17 bis 24 Stunden. Dann unterziehen Sie die Kolonie der biochemischen Identifizierung mit einem automatisierten mikrobiellen Identifizierungssystem.
Als nächstes wenden Sie einen Tropfen der Polyvalenten sera der Shigella-Art auf eine saubere Rutsche an. Verwenden Sie dann eine Mikroschleife, um einige der Bakterien zu sammeln und mahlen Sie es in die Sera. Schließlich, wenn die Seren fließenden Sand ähneln, verwenden Shigella Arten monovalente Seren, um die Bakterien weiter zu charakterisieren.
Mit diesem Protokoll wurden Stuhlproben von Patienten auf Salmonellen- und Shigella-Arten untersucht. Mit Echtzeit-PCR gab es eine erfolgreiche Verstärkung im HEX-Kanal, was darauf hindeutet, dass die Probe positiv für Salmonellenarten war. Weitere Echtzeit-PCR zeigten, dass Probe zwei positiv für Salmonellen war und für die geführte Salmonellenartenkultur ausgewählt wurde.
In der geführten Kultur der Salmonellenarten wurden die rosafarbenen und lila Kolonien getrennt plattiert und biochemisch identifiziert. Die Ergebnisse zeigten, dass die Kolonien aus Probe zwei Salmonella paratyphi B waren. Mit Echtzeit-PCR gab es eine erfolgreiche Verstärkung im FAM-Kanal, was darauf hindeutet, dass die Probe für Shigella-Arten positiv war. Weitere Echtzeit-PCR zeigten, dass Probe 10 für Shigella positiv war und für die geführte Kultur ausgewählt wurde.
In der geführten Kultur der Shigella-Arten wurden die rosaroten und farblosen Kolonien getrennt plattiert und biochemisch identifiziert. Die Ergebnisse zeigten, dass Probe 10 Shigella sonnei Phase-II-Bakterien enthielt. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich die Einschränkung der Methode aufgrund von Sequenzvariationen zu merken.
Nach diesem Verfahren können andere Methoden, wie die direkte Kultur, ausgeführt werden, um falsche negative Echtzeit-PCR-Ergebnisse zu vermeiden. Diese Technik ebnet den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Salmonellen- und Shigella-Erkennung, da das neue Protokoll die positive Rate um das Zweifache erhöhen und die Arbeitsbelastung und TAT deutlich verringern könnte. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Salmonellen und Shigella extrem gefährlich sein kann, und die persönliche Schutzausrüstung, PSA, sollte immer während der Durchführung dieses Verfahrens genommen werden.
