The authors would like to thank the following funding sources: RO1 DA 12104, RO1 DA 022935, RO1 DA031202, K05DA033881, P50 DA 011806, 1R01DA034582 (to S.R) and F31 DA026264-01A1, T32 DA07097 (to J.N.).

HINWEIS: Dieses Protokoll kann für mehrere Anwendungen, wie die Quantifizierung der Phagozytose und Aktin-Polymerisation verwendet werden, wie in unserer früher veröffentlichten Arbeit 12 verwendet. Das Protokoll eignet sich für eine Vielzahl von Modifikationen und Tabelle 1 listet Zelltypen und Teilchen erfolgreich in früheren Studien verwendet. Standard Verwendung dieses Protokolls für die Quantifizierung der Phagozytose oder der Aktin-Polymerisation ist in Abbildung 1 dargestellt. <img alt="Diagramm 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52195/52195diagram1.jpg" width="600" /> Diagramm. 1: Schema der fluorometrischen Assay zur Quantifizierung der Phagozytose und die Aktin-Polymerisation Nachdem die Zellen plattiert, behandelt, und man ließ sie haften Teilchen mit grüner Fluoreszenz (FITC) markiert sind, zu den Zellen für die Phagozytose aufgenommen. Die Reaktion wird durch Trypanblau oder antibi gestopptOhrwäsche (auf nicht internalisierten Partikel zu beseitigen) und Fixierung mit 4% Paraformaldehyd durchgeführt. Die Zellen werden anschließend mit rot fluoreszierende Aktin-Etikett (Rhodamin-Phalloidin) und blau fluoreszierende Markierung (DAPI) gefärbt. Indizes der Phagozytose und Aktin-Polymerisation werden als Verhältnis der relativen Fluoreszenzeinheiten von grün / blau (FITC / DAPI) oder rot / blau (Rhodamin / DAPI) Fluoreszenz quantifiziert. 1. Auflage und Behandlung von Zellen HINWEIS: Bevor Sie beginnen, Erwägung ziehen, die Behandlungen mit mindestens 4 technische Replikate und umfassen die folgenden Steuerelemente in der Platte Layout: Zellen, die nur (ungefärbt, mit DAPI allein oder Rhodamin allein) und Partikel nur. <ol><li> Führen die gesamten Zugabe der Reagenzien in den Schritten in einem sterilen Zellkulturhaube, um die Proben vor Verunreinigung zu schützen 1-4. </li><li> Platte Makrophagen (J774 murine Zelllinie) in einer 96-Well-Platte bei 1-5 × 10 4 Zellen in 50 &amp; mgr; l (pro Vertiefung)<html> der vorgeheizten Medien ergänzt. Ideal Platten für diese Methode sind schwarz 96-well Platten mit klarem oder schwarz Böden in Abhängigkeit von Lesefähigkeiten. <ol><li> Für ergänzten Medium verwenden 10% hitzeinaktiviertem FBS, um Störungen der Komplementkaskade zu vermeiden, und 1% Penicillin / Streptomycin (wenn nicht mit lebenden Bakterien zur Phagozytose). Bei der Verwendung von adhärenten Zellen ermöglichen 1-2 h für die Haftung und für die nicht-adhärenten Zellen, drehen Sie die Platte mit den Zellen für 10 Minuten bei 500 x g. </li></ol></li><li> Hinzufügen gewünschten Agonisten / Antagonisten oder Fahrzeugsteuerung in 2facher Konzentration (in PBS resuspendiert oder bevorzugter in ergänztem Medium) in 50 &amp; mgr; l für ein Endvolumen von 100 ul (1x) und Inkubation für eine gewünschte Zeitdauer. Mehrkanalpipette und Reagenziengefäßen wird schnellsten Verarbeitung zu erleichtern. </li></ol> 2. Opsonisierung von fluoreszierenden Partikeln ftp_upload / 52.195 / 52195table1.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Tabelle 1: Getestete Zelltypen und Leuchtstoffpartikeln in fluorometrischen Analyse Phagozytose und die Aktin-Polymerisation Tabelle 1 zeigt Kombinationen von Zelltypen (Zelllinien und Primärzellen), hat unsere Gruppe über das fluorometrische Verfahren verwendet.. Andere als Blick auf die Phagozytose und Aktin-Polymerisation von Wildtyp-Zellen, haben wir auch einige dieser Partikel verwendet zur Untersuchung der Phagozytose von transfizierten Zellen ein GFP (green fluorescent protein) abzugeben. . Fluoreszenz der Zellen mit Plasmiden, die fluoreszierende Reporter transfiziert kann auch als zellulärer Marker neben DAPI Tabelle Beschriftung verwendet: A - Aktin-Polymerisation; P - Phagozytose; PT - Phagozytose von GFP-markierten transfizierten Zellen; OPDex - opsonisierten Dextran Wulst; HKOP - Wärme getötet opsonisierten. <ol><li> Stellen Sie sicher, dass die Leuchtstoffpartikel und Etiketten sind aus Licht zu jeder Zeit geschützt, during Verarbeitung, Waschen, als auch während der Inkubation, um die Photobleichung zu verhindern <ol><li> Für trockene Partikel, abwiegen fluoreszierende Hitze getötet opsonisierten (HKOP) Bakterien (E2861: E. coli K-12-Stamm), mit Herstellerangaben. Achten Sie darauf, dass die Masse macht 10 zu machen: 1 - 20: 1-Bakterien: Zellverhältnis (oder zumindest eine 10: 1-Verhältnis - häufig in Quantifizierung der Phagozytose genutzt) 13,14. Zahl der Partikel kann durch den Hersteller oder vorgesehen, über couting seriellen Verdünnungen von 1 mg / ml Stammlösung bestimmt werden. </li><li> Resuspendieren in 50 ul PBS und Vortex für 1 Minute bei höchster Stufe. Sorgen Sie für sorgfältige Vortex (hier und in der Protocol), wie die Partikel zur Aggregation neigen, die Wirksamkeit von Opsonisierung auswirken können. </li><li> Für Partikel in Suspension, wie fluoreszenzmarkierte Dextranperlen (DEX Kügelchen), Wirbel die Vorratslösung für 1 min, zu 50 ul der Suspension oder in Abhängigkeit von der Perlenkonzentration im Volumen determine Berg der Perlen zu erleichtern 10: 1 Perle: Zellverhältnis. </li></ol></li><li> Gleiches Volumen des opsonierende Reagenz auf die Partikel und kräftig vortexen für eine weitere Minute. </li><li> Die Teilchen Inkubieren mit Opsonisieren Reagenz bei 37 ° C für 1 Stunde. </li><li> Nach der Inkubation zentrifugiert werden die Partikel für 5 Minuten bei 500 · g, und entfernen Sie den Überstand mit überschüssigem opsonierende Reagenz. Waschen der Teilchen durch Zugabe von 100 ul PBS, um Wirbel des Pellets und Zentrifugat für 5 min bei 500 x g zu resuspendieren. <ol><li> Wiederholen Sie diese Schritte zweimal, um die ordnungsgemäße Opsonisierung und Entfernung der nicht gebundenen Antikörper zu gewährleisten. </li></ol></li><li> Herstellung der Arbeitslösung von opsonisierten Partikeln durch Resuspendieren in 5 ml Medium (ausreichend für eine Platte mit 96 Vertiefungen) und weg von Licht zu speichern, bis hinaus zu den Zellen. </li></ol> 3. Phagozytose <ol><li> Legen Sie die Arbeitslösung von Partikeln in einem sterilen Reagenzreservoir. Von hier aus werden 5056; l opsonisierten Partikeln zu den Zellen aus Schritt 1 (bei ​​einer Endkonzentration von 50 ng / ml) hergestellt und ermöglichen es die Phagozytose an Standard-Zellkulturbedingungen auftreten. Die nachstehende Abbildung zeigt zwei Methoden der Phagozytose, die mit dieser Methode (Bild 2) bewertet werden können. </li></ol><img alt="Diagramm 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52195/52195diagram2.jpg" width="600" /> Diagramm. 2: Vergleich der kontinuierlichen Vergleich synchronisieren Phagozytose Continuous Phagozytose zeigt permanenten Internalisierung von Teilchen mit der Zeit, da sie bei sich langsam die Zellen auf dem Boden der Vertiefung. Ein kontrasSynchronisationsSchritt (Zentrifugation) zwingt die Teilchen auf den Boden sinken, die Verbesserung der Partikel Kontakt mit der Zelle und führt zu sofortiger Internalisierung durch die Zellen. Synchronisierte Phagozytose ist ein schneller Prozess, der schneller verinnerlicht Teilicles aufgrund der erhöhten Zell: Partikelkontakt. <ol><li><ol><li> Für die kontinuierliche Phagozytose Verfahren (Bild 2), die Zellen kontinuierlich zu phagozytieren opsonisierten Bakterien, wie sie langsam zu Boden sinken und in Kontakt mit Zellen, nutzen mehr Zeitrahmen, damit für die Bakterien, um die Unterseite des Brunnens zu erreichen und in erlauben Berühren Sie mit den Zellen. Wenn die Durchführung einer Zeitverlaufsexperiment, fügen Bakterien in unterschiedlichen Zeitintervallen und stoppen die gesamte Platte aus Reaktionen bei der gleichen Zeit, um die Verarbeitungsgeschwindigkeit zu erhöhen. </li><li> Für die synchronisierte Phagozytose Verfahren (Bild 2), die Partikel verbessert: Zell-Kontakt durch Zentrifugation, drehen Sie die gesamte Platte, die Zellen und Partikel (5 min bei 500 xg), sobald die Partikel aufgenommen, um die Synchronisation von allen Zeitpunkten zu erleichtern und Zell-Interaktion: das Teilchen zu beschleunigen. <ol><li> Messung des zeitlichen Verlaufs beginnend unmittelbar nach Beendigung der centrifugation Schritt. Wenn die Durchführung einer Zeitverlauf Experiment zu stoppen jeder Stelle unabhängig in unterschiedlichen Zeitabständen, wie unten beschrieben. </li></ol></li></ol></li></ol> HINWEIS: Die synchronisierte Phagozytose Methode ist etwas aufwendiger von dem vorherigen, aber eine höhere phagozytischen Index in einer kürzeren Zeit. 4. Stoppen Phagozytose <ol><li> Für adhärente Zellen, entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 50 ul Trypanblau verdünnt mit PBS (1: 2 Verdünnung), um die Fluoreszenz von nicht internalisierte Bakterien auszulöschen. </li><li> Für nicht-adhärenten Zellen, drehen Sie die Platte und entfernen Überstand. In 50 ul verdünnt Trypanblau. Zu gewährleisten, um die Platte um (5-10 min bei 500 xg), die zwischen jedem Waschen, um die Zellenverlust zu minimieren und ermöglichen ein ausreichendes Waschen Zentrifuge. </li><li> Nach Trypan Inkubation waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, um restliche Trypan zu entfernen (bis die PBS entfernt vom Bohrloch dreht sich frei). Trypan wurde gezeigt, dass Fluoreszenz 15,16 der nicht internalisierte fluoreszierend markierten, durch Hitze abgetöteten Bakterienpartikel quenchen, aber nicht für lebende Bakterien oder OPDex Perlen. Für lebende Bakterien, zählen ein Waschgang mit Antibiotika wie Penicillin, Streptomycin, Gentamicin oder anstelle des Trypan waschen, um verwirrende Auswirkungen der Fluoreszenz von nicht internalisierte Partikel zu vermeiden. </li><li> Fix Zellen mit 100 ul 4% Paraformaldehyd, und Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur, dann Waschen mit PBS (100 &amp; mgr; l pro Vertiefung für jeden Waschgang). Bei diesem Schritt speichern Sie die Zellen bei 4 ° C bis zu einer Woche, oder gehen Sie direkt zum Färben und Quantifizierung. HINWEIS: Alle nachfolgenden Schritte bilden diesen Punkt Vorwort außerhalb des Zellkulturhaube durchgeführt werden. </li><li> Entfernen Sie alle flüssigen und fügen Sie 50 ul der DAPI bei 5 ng / ml in PBS rekonstituiert. Lassen Sie 5 Minuten für die Färbung und dann zweimal mit PBS waschen. Nach dem Waschschritt werden 50 ul PBS in jede Vertiefung und Aufzeichnungs Phagozytose. </li&gt; </ol> 5. Aktinfärbung HINWEIS: Neben Phagozytose wird fluorometrischen Verfahren die Quantifizierung von Aktin-Polymerisation durch Messung der Intensität von Aktin, die während Hemmung Lamellipodien pseudopodiae verringert wird, und die Membran Kräuseln infolge der Behandlung mit einem Inhibitor (1A) zu ermöglichen. Dies ist ein optionaler Schritt, wenn in Quantifizierung Actinpolymerisation interessiert neben der Phagozytose. Wenn Actinpolymerisation das Endziel ist, unter Verwendung von fluoreszierenden Teilchen zur Phagozytose ist optional. <ol><li> Nach Para Fixierung (Schritt 4.3), waschen Sie die Platte zweimal mit PBS auf 100 ul pro Vertiefung für jeden Wasch. Dann werden 50 ul 0,1% Triton X-100 in PBS zur Permeabilisierung inkubieren -5 min bei RT. </li><li> Mit PBS auswaschen 0,1% Triton X-100 2-mal (wie oben), und der Block mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) für 20 min nicht-spezifische Bindung von Elbe zu vermeidenl. </li><li> Nach der Blockierung entfernen Sie die BSA-Lösung und sofort hinzufügen Rhodamin-Phalloidin. Um die Arbeitslösung von Rhodamin-Färbung vorzubereiten, verwenden Sie 100 ul der Methanlösung (des Herstellers) in 5 ml PBS (ausreichend für eine Platte). Von der Arbeitslösung werden 50 ul pro Vertiefung und Inkubation für 20 min bei Raumtemperatur. HINWEIS: Im Anschluss an die Waschschritte und DAPI-Färbung, wie in Schritt 4.4 Zellen bereit für die Quantifizierung können. </li></ol> 6. Quantifizierung <ol><li> Um die Phagozytose unter Verwendung eines Fluoreszenz-Plattenlesegerät, Platten grüne Fluoreszenz mit Anregungsfilter bei λ = 488 nm und Emissionsfilter bei λ = 518 nm und blaue Fluoreszenz quantifiziert mit Anregungsfilter bei λ = 355 nm und Emissionsfilter bei λ = 460 nm. </li><li> Um die Aktin-Polymerisation unter Verwendung eines Fluoreszenz-Plattenlesegerät, Platten blaue Fluoreszenz über λ = 355 nm und λ = 460 nm (wie oben), und rot-Grippe zu quantifizierenFluoreszenz durch Anregungsfilter bei λ = 584 nm und Emissionsfilter λ = 620 nm. HINWEIS: Orbital oder Zentralerkennung ist für die Aufnahme akzeptabel. Einige Zelltypen zu sammeln mehr an den Rand des Brunnens als in der Mitte, in welchem ​​Fall Orbital Aufnahme kann von Vorteil sein. Insbesondere könnte durchschnittlich drei Punkten um die Umlaufbahn auch verwendet werden, um genauere Ergebnisse zu erhalten. </li><li> Teilen Sie die Gesamt RFU der grünen oder roten Fluoreszenz durch blaue Fluoreszenz Anzeige (von DAPI), abhängig von der Partikel Etikett oder phagozytischen gegen Aktin Quantifizierung (Diagramm 1). Aufgrund der hohen Platte-zu-Platte Varianz verwenden relativen Indizes (wie beispielsweise in Bezug auf t = 0 Steuerung), um zu veranschaulichen am besten beobachteten Trends und zuverlässiger statistischer Analyse zu erleichtern. </li></ol>

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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+lupus+erythematosus-associated+defects+in+the+inhibitory+receptor+FcgammaRIIb+reduce+susceptibility+to+malaria.">Systemic lupus erythematosus-associated defects in the inhibitory receptor FcgammaRIIb reduce susceptibility to malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7169-7174 (2007).</li><li>Ninkovic, J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphine+decreases+bacterial+phagocytosis+by+inhibiting+actin+polymerization+through+cAMP-,+Rac-1-,+and+p38+MAPK-dependent+mechanisms.">Morphine decreases bacterial phagocytosis by inhibiting actin polymerization through cAMP-, Rac-1-, and p38 MAPK-dependent mechanisms.</a> The American Journal Of Pathology. 180 (3), 1068-1079 (2012).</li><li>Nix, R. N., Altschuler, S. E., Henson, P. M., Detweiler, C. 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Methods in Enzymology.</a> 132. , 198-204 (1986).</li><li>Scott, A. J., Woods, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+internalization+of+Histoplasma+capsulatum+by+mammalian+cell+lines+using+a+fluorometric+microplate+assay.">Monitoring internalization of Histoplasma capsulatum by mammalian cell lines using a fluorometric microplate assay.</a> Medical Mycology. 38 (1), 15-22 (2000).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

Hauptbeschränkungen der fluorometrischen Technik sind experimentelle Varianz sowie Zellverlust bei ausgiebigem Waschen und Verwendung von nicht-adhärenten Zellen assoziiert. Varianz ist weitgehend durch die Variation der Fluoreszenzpartikeln als Wäge- und Pipettieren während der Herstellung der Stammlösung beobachtet keine genaue Möglichkeit der Beibehaltung identischer Teilchenzahlen von Experiment zu Experiment. Um das Problem der Abweichungen zwischen Experimenten befassen, können ...

Quantifizierung der Fluoreszenzsignal wurde in großem Umfang in einer Vielzahl von wissenschaftlichen Methoden, die von PCR verwendet, Durchflusszytometrie, konfokale Mikroskopie und FRET-Analyse ELISA multiplexen. Fluoreszenz-Bildgebung und Quantifizierung hat eine breite Anwendung und kann ein großes Werkzeug für die quantitative Analyse von verschiedenen zellulären Prozessen sein. Verwendung von fluoreszierenden Markierungen mit Signal in den letzten zehn Jahren revolutioniert worden, und das Auftreten von Fluoreszenzplattenleser hat den hohen Durchsatz Quantifizierung der Fluoreszenz während zellulären Prozessen emittierten erleichtert. Fluorometrische Analyse kann als großartiges Werkzeug in die Quantifizierung der Phagozytose zu dienen. Phagozytose wurde seit der Entdeckung durch Phagozyten Metchnikoff 1800 1 untersucht. Im Laufe der Jahre eine Vielzahl von Verfahren verwendet worden, um diese wichtige Prozess prüfen wesentlich für angeborene Immunabwehr gegen eindringende bakteriellen, viralen, Pilz- und parasitären Erregern 2-5. Bisherige Verfahren zur Quantifizierung genutzt Mikroskopie und stereoTechniken, um Zellen, die phagozytierenden werden, die dann durch Zählen von internalisierten Partikeln (manuell oder unter Verwendung von Software) 6-8 quantifiziert wurden visualisieren. Einige Nachteile der Verwendung Mikroskopie allein zur quantitativen Analyse sind, dass eine manuelle Auszählung der Bakterien ist arbeitsintensiv und anfällig für ein Vorurteil des Beobachters. Ein weiteres bei der Quantifizierung der Phagozytose verwendete Methode ist die mikrobiologische Verfahren der Plattierung von Bakterien aus Zelllysaten (folgenden Phagozytose) auf Bakterienkulturplatten, aber dieses Verfahren kann nicht für bakterizide Mechanismen und Gegenwart von partiell internalisierte Bakterien stellen. Diese Methode ist noch arbeitsintensiv im Vergleich zu Mikroskopie und dauert mehrere Tage, um zu analysieren. Durchfluss-Zytometrie scheint, um die schnellste und effektivste Weg, um Phagozytose zu quantifizieren und wurde von vielen Gruppen 9-11 verwendet worden, aber die hohen Kosten allgemein mit der im zugehörigenInstrument für die Analyse erforderlich macht es die teuerste Methode im Vergleich zu den zuvor genannten Assays. Die fluorometrische Methode ist eine gute Alternative zu Zytometrie zur Analyse von Partikel Internalisierung fließen denn es bietet unvoreingenommene Quantifizierung der Fluoreszenz mit Hilfe von Geräten, die nicht so kostspielig. Andere zusätzlichen Vorteile der Fluorometrie sind hoher Wirkungsgrad und eine hohe Durchsatzvermögen zu quantifizieren Fluoreszenz von den markierten Partikeln emittierte internalisiert. Vorteile der Fluorometrie kann Quantifizierung andere als Phagozytose Prozessen extrapoliert werden. Beispielsweise kann fluorometrische Analyse angewendet werden, um jeden Prozess, der auf Veränderungen in der Expression von intrazellulären oder membrangebundene Rezeptoren, Veränderungen in der Zelldurchlässigkeit / Lebensfähigkeit Transfektionseffizienz und Modulation in einer Aktin-Polymerisation zu untersuchen. Ein Nachteil der fluorometrischen Technik ist, dass, abhängig von den verwendeten Etiketten, es kann eine hoch seinExperiment, um die Variabilität in der Regel durch den Nachweis von Daten über relative Quantifizierung, wie fache Veränderung oder Prozent aus Steuer gelöst werden können, zu experimentieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="820">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:131px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:255px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:315px;">1-&#956;m yellow-green fluorescent Fluo-Spheres;</td>
			<td style="width:131px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">F8852</td>
			<td style="width:255px;">combine 50&#956;l with 50&#956;l opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use</td>
		</tr>
		<tr height="87">
			<td height="87" style="height:87px;">Heat killed E. coli BioParticles fluorescein conjugate</td>
			<td style="width:131px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">E2861</td>
			<td style="width:255px;">reconstitute (5 mg) in 50&#956;l of PBS and combine with 50&#956;l opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Opsonizing reagent</td>
			<td style="width:131px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">E2870</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Rhodamine phalloidin</td>
			<td style="width:131px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">R415</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:131px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15250-061</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;">the items below are available in many brands but the items we used in this study are from the following manufacturers</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:315px;">RPMI Cell growth media&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;">Supplemented with 10% FBS and 1% pennicillin/Streptomycin; warm in 37oC before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Fluorescent plate reader-Fluostar Omega</td>
			<td style="width:131px;">BMG Labtech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Paraformaldehyde (16%)</td>
			<td style="width:131px;">Fischer Scientific</td>
			<td>AA433689M</td>
			<td style="width:255px;">dilute to 4% before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">96 well plates</td>
			<td style="width:131px;">Greiner</td>
			<td style="width:119px;">655097</td>
			<td style="width:255px;">clear or black or clear bottom - black plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Multichannel pipette (8-12 channels)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Reagent reservoirs</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">1x PBS</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Microfuge tubes (0.6 ml)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">&#160;Conicles (10 ml)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization

Das Ziel der fluorometrischen Analyse ist es, als eine effiziente, kosteneffektive und qualitativ Durchsatzverfahren zur Analyse von Phagozytose und andere zelluläre Prozesse dienen. Diese Technik kann auf einer Vielzahl von Zelltypen, sowohl adhärenten und nicht-adhärenten verwendet werden, um eine Vielzahl von zellulären Eigenschaften zu untersuchen. Bei der Untersuchung von Phagozytose, fluorometrische Technik nutzt phagozytischen Zelltypen, wie Makrophagen und fluoreszenzmarkierten opsonierten Partikel, deren Fluoreszenz in Gegenwart von Trypanblau ausgelöscht werden. Nach Plattierung der adhärenten Makrophagen in 96-Well-Platten, fluoreszierenden Partikeln (grün oder rot) verwaltet und Zellen werden für unterschiedliche Zeitdauern zu phagozytieren. Nach Internalisierung von fluoreszierenden Teilchen, werden die Zellen mit Trypan-Blau, das Erlöschen des Fluoreszenzsignals von den Bakterien, die nicht internalisiert werden, oder lediglich an der Zelloberfläche anhaften erleichtert gewaschen. Nach dem Trypan Waschen werden die Zellen mit PBS gewaschen, fixiert, einnd mit DAPI (blau Atomfluoreszenzmarkierung), die Kerne von Zellen zu markieren dient gefärbt. Durch eine einfache fluorometrische Quantifizierung durch die Platte Lesen von Kern (blau) oder Partikel (rot / grün) Fluoreszenz können wir das Verhältnis der relativen Fluoreszenzeinheiten von grünen untersuchen: blau und bestimmen einen phagozytischen Index, der Menge an Fluoreszenz Bakterien verinnerlicht pro Zelle. Die Dauer des Assays unter Verwendung einer 96-Well-Verfahren und ein Mehrkanal-Pipetten zum Waschen, vom Ende der Phagozytose zu Ende der Datenerfassung, weniger als 45 min. Durchflußzytometrie könnte in ähnlicher Weise verwendet werden, aber der Vorteil der Fluorometrie ist seine hohe Durchsatz, schnelles Verfahren zur Beurteilung mit minimaler Manipulation von Proben und schnelle Quantifizierung der Fluoreszenzintensität pro Zelle. Ähnliche Strategien können zu nicht anhaftenden Zellen, Live-markierten Bakterien, Aktin-Polymerisation, und praktisch jedes Verfahren, bei dem Fluoreszenz angewendet werden. Daher ist Fluorometrie eine vielversprechende Methode wegen seiner geringen Kosten, hoher throughput-Fähigkeiten bei der Untersuchung von zellulären Prozessen.

Zwei wichtige Arten von Quantifizieren Phagozytose und die anschließende Aktin-Polymerisation durch die Verwendung dieses Protokolls ist es, kontinuierlich oder synchronisiert Phagozytose beobachten. Die mikroskopische Analyse (1B) zeigt Fluoreszenzbilder vergleichbar, was das Fluorometer aufnimmt (siehe auch Abbildung 1). In 1B sind rote Fluoreszenz von Aktin, grün 268 Fluoreszenz von FITC-Etiketten HKOP E. coli, Kern DAPI-Färbu...

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High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

High Throughput Fluorometric Technik zur Bewertung der Makrophagen-Phagozytose und Aktinpolymerisation

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.5K Aufrufe.  University of Minnesota. Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

Serie: High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Forschung

Immunologie und Infektion

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

Hochdurchsatz-Screening für Breitspektrum-Chemische Inhibitoren der RNA-Viren

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Makrophagen-Cholesterin Depletion und Auswirkungen auf die Phagozytose<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Ein Hochdurchsatz-Assay unterstützte Wirksamkeit von Medikamenten gegen Makrophagen agierten zur Bewertung<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular disease (CVD). The structure and function of HDL rather than HDL-C may more accurately predict atherosclerosis. Several HDL protein and lipid compositional changes that impair HDL function occur in inflammatory states such as atherosclerosis. HDL function is usually determined by cell based assays such as cholesterol efflux assay but these assays have numerous drawbacks lack of standardization. Cell-free assays may give more robust measures of HDL function compared to cell-based assays. HDL oxidation impairs HDL function. HDL has a major role in lipid peroxide transport and high amount of lipid peroxides is related to abnormal HDL function. Lipid-probe interactions should be considered when interpreting the results of non-enzymatic fluorescence assays for measuring the lipid oxidative state. This motivated us to develop a cell-free biochemical enzymatic method to assess HDL lipid peroxide content (HDLox) that contributes to HDL dysfunction. This method is based on the enzyme horseradish peroxidase (HRP) and the fluorochrome Amplex Red that can quantify (without cholesterol oxidase) the lipid peroxide content per mg of HDL-C. Here a protocol is describedfor determination of HDL-lipid peroxidation using the fluorochrome reagent. Assay variability can be reduced by strict standardization of experimental conditions. Higher HDLox values are associated with reduced HDL antioxidant function. The readout of this assay is associated with readouts of validated cell-based assays, surrogate measures of cardiovascular disease, systemic inflammation, immune dysfunction, and associated cardiovascular and metabolic risk phenotypes. This technical approach is a robust method to assess HDL function in human disease where systemic inflammation, oxidative stress and oxidized lipids have a key role (such as atherosclerosis).

We describe here a fluorometric cell-free biochemical assay for determination of HDL-lipid peroxidation. This rapid and reproducible assay can be used to determine HDL function in large scale studies and can contribute to our understanding of HDL function in human disease.

Zellfreie biochemische fluorometrisch enzymatische Assays für Hochdurchsatz-Messung der Lipidperoxidation in High-Density Lipoprotein

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a pET-SUMO-EGFP vector (SUMO = small ubiquitin-like modifier) and expressing enhanced green fluorescence protein (EGFP) in Escherichia coli (BL21DE). EGFP-expressing E. coli is coincubated with macrophages for 1 h at 37 &#176;C; the negative control group is incubated on ice for the same amount of time. Then, the macrophages are ready for assessment. The advantages of this technique include its simple and straightforward steps, and phagocytosis can be measured by both flow cytometer and fluorescence microscope. The EGFP-expressing E. coli are stable and display a strong fluorescence signal even after the macrophages are fixed with paraformaldehyde. This method is not only suitable for the assessment of macrophage cell lines or primary macrophages in vitro but also suitable for the evaluation of granulocyte and monocyte phagocytosis in peripheral blood mononuclear cells. The results show that the phagocytic capability of peritoneal macrophages from young (eight-week-old) mice is higher than that of macrophages from aged (16-month-old) mice. In summary, this method measures macrophage phagocytosis and is suitable for studying the innate immune system function.

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Here, we present a protocol to assess mouse peritoneal macrophage phagocytosis using enhanced green fluorescence protein-expressing Escherichia coli.

Mit grünen Fluoreszenz Protein exprimierenden verbessert Escherichia Coli Maus peritonealen Makrophagen Phagozytose bewerten

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune system and is not targeted by the current antiretroviral therapy (cART). Transcription and splicing have been shown to reinforce HIV-1 latency in resting CD4+ T cells. Reversal of latency by the use of latency reversal agents (LRAs) in the &#34;shock and kill&#34; approach has been studied extensively in an attempt to purge this reservoir but has thus far not shown any success in clinical trials due to the lack of development of adequate small molecules that can efficiently perturb this reservoir. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently assessing latency reversal agents (LRAs) on HIV transcription and splicing. This approach is based on the use of an LTR-driven dual color reporter that can simultaneously measure the effect of an LRA on transcription and splicing by flow cytometry. The protocol described here is adequate for adherent cells as well as the cells in suspension. It is useful for testing a large number of drugs in a high throughput system. The method is technically simple to implement and cost-effective. In addition, the use of flow cytometry allows the assessment of cell viability and thus drug toxicity at the same time.

A high throughput protocol for functional assessment of HIV efficient reactivation and clearance of latent proviruses is described and applied by testing the impact of interventions on HIV transcription and splicing. Representative results of the effect of latency reversing agents on LTR-driven transcription and splicing are provided.

Hoher Durchsatz In Vitro Bewertung der Latenz Umkehrung Agenten auf HIV Transkription und Spleißen

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune ...

Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the removal of dead cells or foreign particles, and in the resolution of inflammatory responses and tissue remodeling, processes that are mediated by various surface receptors of the AMs. Here, we report methods for the analysis of the phagocytic function of AMs using in vitro and in vivo assays and experimental strategies to differentiate between the pattern recognition receptor-, complement receptor-, and Fc gamma receptor-mediated phagocytosis. Finally, we discuss a method to establish and characterize a P. aeruginosa pneumonia model in mice to assess bacterial clearance in vivo. These assays represent the most common methods to evaluate AM functions and can also be used to study macrophage function and bacterial clearance in other organs.

Here we report common methods to analyze the phagocytic function of murine alveolar macrophages and bacterial clearance from the lung. These methods study in vitro phagocytosis of fluorescein isothiocyanate beads and in vivo phagocytosis of Pseudomonas aeruginosa Green Fluorescent Protein. We also describe a method for clearing P. aeruginosa in mice.

Alveolären Makrophagen Phagozytose und Bakterien-Clearance bei Mäusen

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the ...

In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure

Ozone (O3) is a criteria air pollutant that exacerbates and increases the incidence of chronic pulmonary diseases. O3 exposure is known to induce pulmonary inflammation, but little is known regarding how exposure alters processes important to the resolution of inflammation. Efferocytosis is a resolution process, whereby macrophages phagocytize apoptotic cells. The purpose of this protocol is to measure alveolar macrophage efferocytosis following O3-induced lung injury and inflammation. Several methods have been described for measuring efferocytosis; however, most require ex vivo manipulations. Described in detail here is a protocol to measure in vivo alveolar macrophage efferocytosis 24 h after O3 exposure, which avoids ex vivo manipulation of macrophages and serves as a simple technique that can be used to accurately represent perturbations in this resolution process. The protocol is a technically non-intensive and relatively inexpensive method that involves whole-body O3 inhalation followed by oropharyngeal aspiration of apoptotic cells (i.e., Jurkat T cells) while under general anesthesia. Alveolar macrophage efferocytosis is then measured by light microscopy evaluation of macrophages collected from bronchoalveolar (BAL) lavage. Efferocytosis is finally measured by calculating an efferocytic index. Collectively, the outlined methods quantify efferocytic activity in the lung in vivo while also serving to analyze the negative health effects of O3 or other inhaled insults.

This manuscript describes a protocol for determining whether exposure to ozone, a criteria air pollutant, impairs alveolar macrophage efferocytosis in vivo. This protocol utilizes commonly used reagents and techniques and can be adapted to multiple models of pulmonary injury to determine effects on alveolar macrophage efferocytosis.

In Vivo Bewertung der Alveolar Makrophagen-Efferozytose nach Ozon-Exposition

Ozone (O3) is a criteria air pollutant that exacerbates and increases the incidence of chronic pulmonary diseases. O3 exposure is known to induce ...

High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many approaches used for the study of microbial interactions require specialized equipment and are expensive and time intensive. This paper presents a protocol for co-culture interaction assays that are inexpensive, scalable to large sample numbers, and easily adaptable to numerous experimental designs. Microorganisms are cultured together, with each well representing one pairwise combination of microorganisms. A test organism is cultured on one side of each well and first incubated in monoculture. Subsequently, target organisms are simultaneously inoculated onto the opposite side of each well using a 3D-printed inoculation stamp. After co-culture, the completed assays are scored for visual phenotypes, such as growth or inhibition. These assays can be used to confirm phenotypes or identify patterns among isolates of interest. Using this simple and effective method, users can analyze combinations of microorganisms rapidly and efficiently. This co-culture approach is applicable to antibiotic discovery as well as culture-based microbiome research and has already been successfully applied to both applications.

The co-culture interaction assays presented in this protocol are inexpensive, high throughput, and simple. These assays can be used to observe microbial interactions in co-culture, identify interaction patterns, and characterize the inhibitory potential of a microbial strain of interest against human and environmental pathogens.