Finanzielle Unterstützung für diese Arbeiten wurden von der Europäischen Gemeinschaft (ERC-STG INTRACELLTB Grant n° 260901, MM4TB Grant n° 260872), der Agence Nationale de Recherche, der Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed BioMed) und der Region Nord Pas de Calais gewährt. Wir danken der technischen Unterstützung von Gaspard Deloison, Elizabeth Werkmeister, Antonino Bongiovanni und Frank Lafont von der Plattform BICeL.

1. High-Throughput Genom-wide siRNA Screening
Screening durchgeführt in einem menschlichen Typ-II-Pneumozyten Modell A549 Zelllinie nach einer Infektion mit Mtb H37Rv, die grünes fluoreszierendes Protein (GFP) exzessiert. Dieses Verfahren ist in Abbildung 1Abeschrieben.
<ol><li>Setzen Sie die getrocknete siRNA-Bibliothek, die in Mutterplatten (96-Well-Platten) mit 1x siRNA-Puffer gelagert wird, auf eine Konzentration von 4 m auf, und übertragen Sie dann 10 l des Gemischs in eine 384-Well-Tochterplatte (Tochterplatte 1).</li>
	<li>Fügen Sie 10 l 1x 1x siRNA Puffer in Tochterplatte 1 hinzu, um siRNA um das 2-fache zu verdünnen. Nach der siRNA-Resuspension werden platten mit abziehbarer Aluminiumdichtung versiegelt und können bei -20 °C mindestens 6 Monate und bis zu 2-3 Jahren gelagert werden, aber die Lagerzeit kann je nach den Empfehlungen des Herstellers der siRNA-Bibliothek variieren.</li>
	<li>SiRNAs in Tochterplatte 1 in Tochterplatte 2 verdünnen, um eine Konzentration von 500 nM zu erreichen. Nach der siRNA-Resuspension werden platten mit abziehbarer Aluminiumdichtung versiegelt und können bei -20 °C mindestens 6 Monate und bis zu 2-3 Jahren gelagert werden, aber die Lagerzeit kann je nach den Empfehlungen des Herstellers der siRNA-Bibliothek variieren.</li>
	<li>Vor Gebrauch auftauen Tochterplatte 2 bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Nehmen Sie 2,5 l siRNA von Tochterplatte 2 und legen Sie sie in eine 384-Well-Assay-Platte.</li>
	<li>In der gleichen 384-Well-Assay-Platte in Schritt 1.5 fügen Sie ihren jeweiligen Brunnen 2,5 l negative und positive KontrollsiRNA hinzu.</li>
	<li>Verdünnen Sie das Transfektionsreagenz in 1x D-PBS, um genügend Lösung zu liefern, um 0,1 l Transfektionsreagenz in jedem Brunnen bereitzustellen, und die verdünnte Transfektionslösung bei Raumtemperatur für 5 min vorinkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie jedem Brunnen in der Assayplatte 7,5 l des Transfektionsreagenz/PBS-Lösungsgemisches hinzu und brüten Sie 30 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Fügen Sie 40 l A549-Zellen (1.500 Zellen/well) hinzu, die in RPMI 1640 Medium suspendiert sind, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS). Halten Sie Zellen für eine 3-tägige Inkubationszeit bei 37 °C in einer Atmosphäre, die 5%CO2enthält. Diese Zellen teilen sich alle 24 Stunden, so dass sich etwa 12.000 Zellen drei Tage nach der Transfektion in den Brunnen befinden.</li>
	<li>Waschen Sie eine zwei Wochen alte GFP-ausdruckende Mtb H37Rv Kultur mit D-PBS (frei von MgCl2 und CaCl2) durch Zentrifugation bei 4.000 x g für 5 min und entsorgen Sie die Wäsche. Wiederholen Sie diesen Schritt 3x. (Für GFP-Mtb H37Rv Kulturbedingungen siehe Protokoll 3).</li>
	<li>Setzen Sie das bakterielle Pellet in 10 ml RPMI 1640 Medium, ergänzt mit 10% FBS und Dekanat für 1 Stunde bei Raumtemperatur, um bakterielle Aggregate sedimentieren zu lassen.</li>
	<li>Sammeln Sie den bakteriellen Überstand und messen Sie OD600 (OD600 sollte zwischen 0,6-0,8 liegen) und GFP-Fluoreszenz (RFU-Wert) mit einem Mikroplattenleser, um die bakterielle Konzentration zu bestimmen. Berechnen Sie den Titer der Suspension mit einer Referenzregressionslinie, die den RFU-Wert = f (CFU-Wert) anzeigt, der vor dem Experiment an einer anderen Kultur generiert wurde, die unter den gleichen Bedingungen vorbereitet worden war. Bereiten Sie bakterielle Suspension mit 2,4 x 106 Bakterien/ml vor, was einer Infektionsvielzahl (MOI) von 5 entspricht.</li>
	<li>Entfernen Sie das Medium in der 384-Well-Assay-Platte und fügen Sie 25 l frisch zubereitete bakterielle Suspension hinzu.</li>
	<li>Inkubieren Sie die 384-Well-Assayplatte bei 37 °C für 5 Stunden in einer Atmosphäre mit 5%CO2.</li>
	<li>Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit RPMI Medium ergänzt mit 10% FBS 3x.</li>
	<li>Um die verbleibenden extrazellulären Bakterien abzutöten, behandeln Sie die Zellen mit 50 l frischem RPMI-FBS-Medium, das 50 g/ml Amikacin bei 37 °C für 1 Stunde in einer Atmosphäre mit 5%CO2enthält.</li>
	<li>Entfernen Sie das mittelhaltige Amikacin und fügen Sie 50 l frisches RPMI-Medium hinzu, das mit 10% FBS ergänzt wird. Inkubieren Sie die 384-Well-Assayplatte bei 37 °C 5 Tage lang in einer Atmosphäre, die 5%CO2enthält.</li>
	<li>Vor der Bildaufnahme 10 l frisch zubereitete 30 g/ml DAPI in PBS (Endkonzentration 5 g/ml) hinzufügen und 10 min bei 37 °C inkubieren.</li>
	<li>Laden Sie die Platte in das automatische konfokale Mikroskop. <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a></li>
	<li>Legen Sie die Belichtungsparameter fest. Aufnahme der DAPI-Fluoreszenz mit Anregungslaser 405 nm mit Emissionsfilter 450 nm und GFP-Fluoreszenz mit Anregungslaser 488 nm mit Emissionsfilter 520 nm. <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a> <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a></li>
	<li>Wählen Sie die Brunnen und die Felder in jedem zu erwerbenden Brunnen aus, der dann als Layout- und Unterlayoutparameter bezeichnet wird. <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a> <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a></li>
	<li>Generieren Sie die Experimentierdatei mit den Parametern aus den Schritten 1.20 und 1.21, und führen Sie die automatische Erfassung aus. <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a> <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a></li>
	<li>Übertragen Sie Bilder auf den Remote-Server. <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_5.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_5highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a></li>
	<li>Bewerten Sie Bilder mit Bildanalysesoftware. Erkennen Sie Zellkerne aus dem DAPI-Kanal mithilfe des Kernerkennungsalgorithmus und des Bakterienbereichs aus dem GFP-Kanal mithilfe des Algorithmus für die Eigenschaften der Pixelintensität (Abbildung 4A).</li>
</ol>Hinweis: Dieses Protokoll wurde optimiert, um die Wirkung von Gen-Silencing auf das intrazelluläre Mtb-Wachstum zu untersuchen. Mtb ist ein langsam wachsendes Bakterium, das sich alle 20 Stunden unter optimalen Bedingungen teilt. Nach 5 Tagen nach der Infektion ist die Menge an extrazellulärem Mtb ohne Zelllyse immer noch gering und hatte keinen Einfluss auf die Qualität der Analyse. Dieses Protokoll muss hinsichtlich der Länge der Antibiotikabehandlung und der Inkubationszeit optimiert werden, um für siRNA-Bildschirme mit schnell wachsende Bakterien wie Mykobakterien smegmatis und Escherichia coli angepasst zu werden, die extensiv freigesetzt werden und neue Zellen infizieren können.
2. Hochdurchsatz Compound Screening
Screening an Mtb H37Rv infizierten Wirtszellen durchgeführt. Dieses Verfahren ist in Abbildung 1Bbeschrieben.
<ol><li>Die 384-Well-Mutterplatten, die die in DMSO zu 100% lösliche zusammengesetzte Bibliothek enthalten, auftauen. Übertragen Sie 0,5 l der Verbindungen in 384-Well-Tochterplatten, die 10 l RPMI 1640 Medium enthalten, ergänzt mit 10% FBS.</li>
	<li>Waschen Sie eine zwei Wochen alte GFP-ausdruckende Mtb H37Rv Kultur mit D-PBS (frei von MgCl2 und CaCl2) durch Zentrifugation bei 4.000 x g für 5 min und entsorgen Sie die Wäsche. Wiederholen Sie diesen Schritt 3x (Für GFP-Mtb H37Rv Kulturbedingungen siehe Protokoll 3).</li>
	<li>Setzen Sie das bakterielle Pellet in 10 ml RPMI 1640 Medium, ergänzt mit 10% FBS und Dekanat für 1 Stunde bei Raumtemperatur, um bakterielle Aggregate sedimentieren zu lassen.</li>
	<li>Sammeln Sie den bakteriellen Überstand und messen Sie OD600 (OD600 sollte zwischen 0,6-0,8 liegen) und GFP-Fluoreszenz (RFU-Wert) mit einem Mikroplattenleser. Berechnen Sie den Titer der Suspension mit einer Referenzregressionslinie, die den RFU-Wert = f (CFU-Wert) anzeigt, der vor dem Experiment generiert wurde. Typische Konzentration beträgt 1 x 108 Bakterien/ml.</li>
	<li>Ernte 6 Tage alte primäre menschliche Makrophagen bei 4 x 105 Zellen/ml in RPMI 1640 Medium ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 50 ng/ml rekombinantem menschlichen M-CSF (Für menschliche periphere Blutmonozytenzellen Reinigung und Makrophagen Differenzierung siehe Protokoll 4).</li>
	<li>Inkubieren Sie die verdünnten Primärzellen mit Bazillen bei verschiedenen MOI, von 1-5, in Suspension mit leichtem Schütteln bei 90 Rprossen für 2 Stunden bei 37 °C.</li>
	<li>Waschen Sie die infizierten Zellen durch Zentrifugation bei 350 x g, um die extrazellulären Bakterien zu entfernen. Nach jedem Zentrifugationsschritt das Pellet in RPMI 1640 medium, ergänzt mit 10% FBS, wieder aufsetzen. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x.</li>
	<li>Setzen Sie die infizierten Zellen in RPMI 1640 Medium, ergänzt mit 10% FBS und Amikacin, bei 50 g/ml aus und inkubieren Sie die Suspension mit leichtem Schütteln für 1 Stunde bei 37 °C.</li>
	<li>Entfernen Sie das amikacinhaltige Zellkulturmedium durch Zentrifugation bei 350 x g und waschen Sie die infizierten Zellen mit dem vollständigen RPMI 1640 Medium, ergänzt mit 10% FBS und 50 ng/ml rekombinantem humanem M-CSF. Wiederholen Sie dies einmal.</li>
	<li>Fügen Sie in Schritt 2.1 40 l der infizierten Makrophagensuspension in die gleiche Assayplatte ein, die bereits 10 l der zusammengesetzten Verdünnungen enthält. Die endgültige Konzentration von DMSO in jedem Brunnen hat nun 1% erreicht.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Assayplatten 5 Tage lang bei 37 °C in einer Atmosphäre, die 5%CO2enthält.</li>
	<li>Färben Sie die lebenden Zellen mit zelldurchlässigen, weitroten Fluoreszenzfarbstoffen.</li>
	<li>Laden Sie die Platte in das automatische konfokale Mikroskop. <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a></li>
	<li>Legen Sie die Belichtungsparameter fest. Zeichnen Sie die weitrote Fluoreszenz mit Anregungslaser 640 nm mit Emissionsfilter 690 nm und GFP-Fluoreszenz mit Anregungslaser 488 nm mit Emissionsfilter 520 nm auf. <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a> <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a></li>
	<li>Wählen Sie die Brunnen und die Felder in jedem zu erwerbenden Brunnen aus, der dann als Layout- und Unterlayoutparameter bezeichnet wird. <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a> <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a></li>
	<li>Generieren Sie die Experimentierdatei mit den Parametern aus den Schritten 2.14 und 2.15, und führen Sie die automatische Erfassung aus. <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a> <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a></li>
	<li>Übertragen Sie Bilder auf den Remote-Server. <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_5.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_5highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a></li>
	<li>Bewerten Sie Bilder mit Bildanalysesoftware. Erkennen Sie den Zellbereich aus dem rot-roten Kanal mithilfe des Algorithmus für die Pixelintensitätseigenschaften und des Bakterienbereichs aus dem GFP-Kanal mithilfe des Algorithmus für die Pixelintensitätseigenschaften (Abbildung 4B).</li>
</ol>Hinweis: Dieses Protokoll kann für mtb mutierte Bibliothek Screening angepasst werden, indem Verbindungen durch Mutanten, die ein fluoreszierendes Protein (One well/One mutant)(Abbildung 1C, siehe auch Brodin et al. 4). Fluoreszierende Mutanten werden zuerst in Brunnen ausgesät (20 l bakterielle Suspension pro Brunnen). Die Bakterien werden dann durch 30 l Zellsuspension zurückgewonnen. Nach zentrifugieren bei 350 x g für 1 min wird die Platte bei 37 °C in einer Atmosphäre mit 5%CO2inkubiert. Inkubationszeit und MOI hängen vom Test ab. Zum Beispiel für die Visualisierung von frühen zellulären Ereignissen wie Phagosomenversauerung, können die Zellen für 2 Stunden mit MOI im Bereich von 1-20 infiziert werden. Lysosomen werden in einer Atmosphäre mit 5 %CO2-Gehalt mit Lysotracker-Farbstoff mit 2 m bei 1,5 stunden bei 37 °C gefärbt und anschließend entweder mit 10 % Formalin oder 4 % Paraformaldehyd (PFA) fixiert. Konfokale Bilder werden erfasst und schließlich mit Bildanalyseskripten mit geeigneten Algorithmen für die Lysosomenerkennung und subzelluläre Lokalisierung analysiert4.
3. Grünes fluoreszierendes Protein, das Mycobacterium tuberculosis H37Rv (GFP-H37Rv) Kulturbedingungen ausdrückt
Zur Langzeitlagerung wurden GFP-H37Rv in D-PBS eingefroren (ca. 1 x 108 Mykobakterien pro Durchstechflasche).
<ol><li>Eine gefrorene Durchstechflasche GFP-H37Rv in einem Erlenmeyerkolben mit 50 ml 7H9-Brühenmedium, ergänzt mit Middlebrook OADC-Anreicherung 10%, Glycerin 0,5%, Tween-80 0,05% und Hygromycin B (50 g/ml) wieder aufsetzen.</li>
	<li>8 Tage bei 37 °C inkubieren.</li>
	<li>Messen Sie OD600 der GFP-H37Rv-Kultur.</li>
	<li>Verdünnen Sie die GFP-H37Rv-Kultur, um OD600 = 0,1 in frischem 7H9-Brühenmedium zu erhalten, ergänzt mit Middlebrook OADC-Anreicherung 10%, Glycerin 0,5%, Tween-80 0,05% und Hygromycin B (50 g/ml).</li>
	<li>Inkubieren Sie den GFP-H37Rv bei 37 °C für 8 Tage mehr vor der Anwendung für den Test.</li>
</ol>4. Humane periphere Blutmonozytenzellen Reinigung aus Vollblut oder Buffy-Coat-Präparation
<ol><li>Verdünnen Sie den Blutbeutel 2x in 1x D-PBS (frei von MgCl2 und CaCl2) mit 1% FBS.</li>
	<li>Isolieren Sie die Monozyten durch Ficoll DichteGradientzentrifugation bei 400 x g für 20 min.</li>
	<li>Sammeln Sie die isolierten Monozyten.</li>
	<li>Waschen Sie die Monozyten 3x mit 1x D-PBS (frei von MgCl2 und CaCl2) mit 1% FBS durch Zentrifugation bei 400 x g für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Konzentrieren Sie die Zellen auf 1 x 107 Zellen/ml.</li>
	<li>Reinigen Sie Monozyten mit CD14-Magnetperlen gemäß dem Herstellerprotokoll (siehe Materialien).</li>
	<li>Nach der Reinigung von CD14-Monozyten werden die Zellen bei 1,5 x 106 Zellen/ml in RPMI 1640 mit 10% FBS und 40 ng/ml humanem Makrophagen-Koloniestimulierenden Faktor (hM-CSF) ergänzt und 4 Tage lang bei 37 °C in einer Atmosphäre mit 5%CO2inkubiert.</li>
	<li>Nach 4 Tagen das Medium durch frisches RPMI 1640 ersetzen, ergänzt durch 10% FBS und 40 ng/ml hM-CSF und 2 Tage bei 37 °C in einer Atmosphäre mit 5%CO2inkubiert.</li>
	<li>Nach 6 Tagen können die Zellen für den Test verwendet werden.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gandhi, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug-resistant+and+extensively+drug-resistant+tuberculosis:+a+threat+to+global+control+of+tuberculosis.">Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis: a threat to global control of tuberculosis.</a> Lancet. 375, 1830-1843 (2010).</li><li>Barry, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spectrum+of+latent+tuberculosis:+rethinking+the+biology+and+intervention+strategies.">The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies.</a> Nat. Rev. Microbiol. 7, 845-855 (2009).</li><li>Christophe, T., Ewann, F., Jeon, H. 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Es wurden keine Interessenkonflikte angemeldet.

Wir beschreiben hier die Methoden, die für einen phänotypischen Test mit einem GFP-exezierenden Mtb H37Rv-Stamm erforderlich sind, um fluoreszierend markierte Wirtszellen zu infizieren, was ihn für Bildschirme mit hohem Gehalt/Hohem Durchsatz geeignet macht. Dieses Protokoll könnte auf eine breite Palette von Verbindungen, Fluoreszenzsonden und Mtb-Mutationen angewendet werden. Für jedes oben beschriebene Protokoll können fixierende und immunkende Schritte vor der Bildaufnahme durchgeführt werden...

Unter den in den letzten Jahren gemeldeten neu auftretenden und wieder auftauchenden infektionserösen Krankheitserregern ist Mycobacterium tuberculosis (Mtb) für 1,4 Millionen Todesfälle und 8,7 Millionen Neuinfektionen im Jahr 2011 verantwortlich (Global tuberculosis report 2012, www.who.int/topics/tuberculosis/en/). Trotz der Verfügbarkeit von Multidrug-Therapien ist die Zahl der Infizierten immer noch auf dem Vormarsch und multiresistent (MDR) sowie extensiv medikamentenresistent (XDR) Mtb breiten sich schnell auf der ganzen Welt aus1. Darüber hinaus ist es unter Berücksichtigung des Vorhandenseins von Mtb-Antigenen offensichtlich, dass ein Drittel der Weltbevölkerung als latent von Mtb infiziert angesehen wird. Statistisch gesehen gibt es in einem von zehn Fällen eine Entwicklung hin zur aktiven Form der Krankheit mit nachfolgenden klinischen Symptomen2. Daher sind neue Mittel zur Bekämpfung von Mtb dringend erforderlich. In diesem Zusammenhang entwickelten wir einen in vitro visuellen phänotypchen Assay, der sich auf die Überwachung der Mtb-Invasion und -Multiplikation in Wirtszellen durch automatisierte konfokale Fluoreszenzmikroskopie3stützt. Die Anpassung des Assays in 384-Well-Mikrotiterplatten in Kombination mit automatisierter Bildaufnahme und -analyse ermöglichte High-Content/High-Throughput Screening (HC/HTS) von mittelgroßen Bibliotheken von Verbindungen, siRNAs und bakteriellen Mutanten. Das Screening einer genomweiten RNAi-Bibliothek auf diesem phänotypischen Assay ermöglichte somit die Identifizierung der wichtigsten Wirtsfaktoren, die am Mtb-Handel und der intrazellulären Replikation beteiligt sind, aber auch die Aufklärung von Wirtspfaden, die vom Tuberkel-Bacillus ausgenutzt werden. Eine weitere Anpassung dieses speziellen phänotypischen Assays war die Identifizierung von bakteriellen Faktoren, die für die intraphagosomale Persistenz von Mtb unerlässlich sind. Zum Beispiel wird die Verhaftung der Phagosomenreifung als einer der wichtigsten Mechanismen betrachtet, die das Überleben und die Replikation von Mtb in Makrophagen erleichtern. Die Überwachung der subzellulären Lokalisation vonMtb-Knock-out-Mutanten in fluoreszierend-säuerlichen Kompartimenten ermöglichte die Identifizierung von bakteriellen Genen, die am Überlebensprozess beteiligt sind 4 . Schließlich bietet die hochklassige Bildgebung von Mtb auch eine ausgezeichnete Methode zur Quantifizierung der Arzneimitteleffizienz zur Hemmung verschiedener Phänomene wie intrazelluläres Bakterienwachstum3. Insgesamt ermöglicht diese Art von hochdurchsatz-phänotypischem Assay eine beschleunigte Arzneimittelentdeckung gegen TB und die von diesen verschiedenen Ansätzen gesammelten Daten tragen zu einem besseren Verständnis der von Mtbausgeübten Host-Manipulation bei.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1010">
	<colgroup>
		<col />
		<col /> 
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">&#181;clear-plate black, 384 well</td>
			<td style="width:160px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:175px;">781091</td>
			<td style="width:388px;">127.8/86/15 MM with Lid, TC treated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">CellCarrier 384 well plate</td>
			<td style="width:160px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:175px;">6007550</td>
			<td>Black, Clear Bottom, with Lid, TC treated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">V-bottom white , 384 well-plate</td>
			<td style="width:160px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:175px;">781280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">sealing tape, breathable, sterile</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td style="width:175px;">3345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Lipofectamine RNAiMax</td>
			<td style="width:160px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:175px;">13778150</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">34943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">RPMI 1640 + GlutaMAX-I</td>
			<td style="width:160px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:175px;">61870-010</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">D-PBS 1X [-]MgCl2/[-]CaCl2</td>
			<td style="width:160px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:175px;">14190-094</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Salin Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">D-PBS 1X [+]MgCl2/[+]CaCl2</td>
			<td style="width:160px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:175px;">14190-091</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Salin Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:160px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:175px;">2610040-79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">FICOLL PAQUE PLUS</td>
			<td style="width:160px;">DUTSCHER</td>
			<td style="width:175px;">17-1440-03</td>
			<td>Ficoll for Peripherical Blood Monocyte Cells purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">CD14 MicroBeads, human</td>
			<td style="width:160px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:175px;">130-050-201</td>
			<td>Purification of CD14+ Monocytes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Human M-CSF, premium gr. (1000 &#956;g)</td>
			<td style="width:160px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:175px;">130-096-493</td>
			<td>Macrophage Colony Stimulating Factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">LS Columns</td>
			<td style="width:160px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:175px;">130-042-401</td>
			<td>Columns for CD14+ Monocytes isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Tween 80</td>
			<td style="width:160px;">Euromedex</td>
			<td style="width:175px;">2002-A</td>
			<td>Mycobacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Glycerol high purity </td>
			<td style="width:160px;">Euromedex</td>
			<td style="width:175px;">50405-EX</td>
			<td>Mycobacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;"> Middlebrook OADC enrichment</td>
			<td style="width:160px;">Becton-Dickinson</td>
			<td style="width:175px;">211886</td>
			<td>Mycobacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">7H9</td>
			<td style="width:160px;">Becton-Dickinson</td>
			<td style="width:175px;">W1701P</td>
			<td>Mycobacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Versene 1X</td>
			<td style="width:160px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:175px;">15040033</td>
			<td>Non enzymatic cell dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">DAPI</td>
			<td style="width:160px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:175px;">D1306</td>
			<td>Nuclei dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:160px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:175px;">H3570</td>
			<td>Nuclei dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Syto60</td>
			<td style="width:160px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:175px;">S11342</td>
			<td>Nuclei/cytoplasm dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Formalin</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">HT5014</td>
			<td>Cell fixation solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">siRNA targeting Dectin-1</td>
			<td style="width:160px;">Santa-Cruz</td>
			<td style="width:175px;">sc-63276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">*siGenome* Non targeted siRNA pool </td>
			<td style="width:160px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:175px;">D-001206-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Rifampicin</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">R3501</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Isoniazid (INH)</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">I3377-50G</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Hygromycin B</td>
			<td style="width:160px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:175px;">10687-010</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Amikacin</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">A1774</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Automated Confocal Microscope OPERA</td>
			<td style="width:160px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:175px;"> </td>
			<td>Image acquisition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Columbus 2.3.1 Server Database</td>
			<td style="width:160px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:175px;"> </td>
			<td>Data transfert, storage and analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Acapella 2.6 software</td>
			<td style="width:160px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:175px;"> </td>
			<td>Image-based analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">GraphPad Prism5 software</td>
			<td style="width:160px;">GraphPad </td>
			<td style="width:175px;"> </td>
			<td>Statistical analysis</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:287px;">Excel 2010</td>
			<td style="width:160px;">Microsoft</td>
			<td style="width:175px;"> </td>
			<td>Statistical analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening

Trotz der Verfügbarkeit von Therapie und Impfstoff ist Tuberkulose (TB) nach wie vor eine der tödlichsten und am weitesten verbreiteten bakteriellen Infektionen der Welt. Seit mehreren Jahrzehnten stellt der plötzliche Ausbruch multi- und extensiv-resistenter Stämme eine ernsthafte Bedrohung für die Bekämpfung der Tuberkulose dar. Daher ist es wichtig, neue Ziele und Wege zu identifizieren, die für den Erreger der Tuberkulose, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) entscheidend sind, und nach neuartigen Chemikalien zu suchen, die zu TB-Medikamenten werden könnten. Ein Ansatz besteht darin, Methoden einzurichten, die für die genetischen und chemischen Siebs von Großbibliotheken geeignet sind und die Suche nach einer Nadel in einem Heuhaufen ermöglichen. Zu diesem Zweck entwickelten wir einen phänotypchen assay, der sich auf den Nachweis von fluoreszierend beschriftetem Mtb in fluoreszierend gekennzeichneten Wirtszellen mittels automatisierter konfokaler Mikroskopie stützt. Dieser In-vitro-Assay ermöglicht eine bildbasierte Quantifizierung des Kolonisationsprozesses von Mtb in den Wirt und wurde für das 384-Well-Mikroplattenformat optimiert, das für Siebe von siRNA-, chemischen Compound- oder Mtb-Mutationsbibliotheken passt. Die Bilder werden dann für die multiparametrische Analyse verarbeitet, die eine Auslesung der Pathogenese von Mtb in Wirtszellen liefert.

Genom-weites SiRNA-Screening mit hohem Durchsatz
Mtb ist in der Lage, Immunzellen in vitro sowie mehrere andere Lungenepithelzellen zu kolonisieren. Zum Beispiel ist Mtbin der Lage, A549 Epithelzellen zu infizieren und zu schädigen, die häufig als Modell für menschliche Typ-II-Pneumozyten5-7verwendet werden. Dectin-1 wurde als Wirtzellrezeptor berichtet, der an der Mtb-Aufnahme, proflammatorischen Reaktion und antibakteriellen Wirkung auf intrazel...

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A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Hier beschreiben wir einen phänotypischen Assay, der auf die High-Throughput/High-Content-Screens von klein-interferierender synthetischer RNA (siRNA), chemischer Verbindung und Mycobacterium tuberculosis mutierte Bibliotheken anwendbar ist. Diese Methode beruht auf dem Nachweis von fluoreszierend gekennzeichneter Mycobacterium tuberculosis in fluoreszierend markierten Wirtszellen mittels automatisierter konfokaler Mikroskopie.

Ein mikroskopischer phänotypischer Assay zur Quantifizierung intrazellulärer Mykobakterien angepasst für High-Throughput/High-Content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

a-microscopic-phenotypic-assay-for-quantification-intracellular

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.6K Aufrufe.  Université de Lille. Hier beschreiben wir einen phänotypischen Assay, der auf die High-Throughput/High-Content-Screens von klein-interferierender synthetischer RNA (siRNA), chemischer Verbindung und Mycobacterium tuberculosis mutierte Bibliotheken anwendbar ist. Diese Methode beruht auf dem Nachweis von fluoreszierend gekennzeichneter Mycobacterium tuberculosis in fluoreszierend markierten Wirtszellen mittels automatisierter konfokaler Mikroskopie.

Serie: A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal titers. Studies of serum bactericidal titers in response to childhood vaccines have enabled us to develop and validate cut-off levels for protective immune responses and such cut-offs are in routine use. No such assays have been taken forward into the routine assessment of vaccines that induce primarily cell-mediated immunity in the form of effector T cell responses, such as TB vaccines. In the animal model, the performance of a given vaccine candidate is routinely evaluated in standardized bactericidal assays, and all current novel TB-vaccine candidates have been subjected to this step in their evaluation prior to phase 1 human trials. The assessment of immunogenicity and therefore likelihood of protective efficacy of novel anti-TB vaccines should ideally undergo a similar step-wise evaluation in the human models now, including measurements in bactericidal assays.
Bactericidal assays in the context of tuberculosis vaccine research are already well established in the animal models, where they are applied to screen potentially promising vaccine candidates. Reduction of bacterial load in various organs functions as the main read-out of immunogenicity. However, no such assays have been incorporated into clinical trials for novel anti-TB vaccines to date.
Although there is still uncertainty about the exact mechanisms that lead to killing of mycobacteria inside human macrophages, the interaction of macrophages and T cells with mycobacteria is clearly required. The assay described in this paper represents a novel generation of bactericidal assays that enables studies of such key cellular components with all other cellular and humoral factors present in whole blood without making assumptions about their relative individual contribution. The assay described by our group uses small volumes of whole blood and has already been employed in studies of adults and children in TB-endemic settings. We have shown immunogenicity of the BCG vaccine, increased growth of mycobacteria in HIV-positive patients, as well as the effect of anti-retroviral therapy and Vitamin D on mycobacterial survival in vitro. Here we summarise the methodology, and present our reproducibility data using this relatively simple, low-cost and field-friendly model.
Note: Definitions/Abbreviations
BCG lux = M. bovis BCG, Montreal strain, transformed with shuttle plasmid pSMT1 carrying the luxAB genes from Vibrio harveyi, under the control of the mycobacterial GroEL (hsp60) promoter. 
CFU = Colony Forming Unit (a measure of mycobacterial viability).

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux

We describe an alternative approach to the enumeration of mycobacteria in vitro, which uses reporter-gene tagged mycobacteria instead of colony-forming units (CFU). &#x201C;Survival&#x201D; of organisms as well as host response-markers are measured simultaneously, providing a low-cost, versatile and functional system for studies of host/pathogen interactions in the context of tuberculosis.

A Functional Whole Blood Assay zur Rentabilität von Mykobakterien Measure, mit Reporter-Gene BCG oder M. Tb (BCG Tagged Lux / M. Tb Lux)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal ...

Forschung

Immunologie und Infektion

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Leishmaniasis is one of the world's most neglected diseases, largely affecting the poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million people are considered at risk of contracting leishmaniasis, and approximately 2 million new cases occur yearly1. Leishmania donovani is the causative agent for visceral leishmaniasis (VL), the most fatal form of the disease. The choice of drugs available to treat leishmaniasis is limited 2;current treatments provide limited efficacy and many are toxic at therapeutic doses. In addition, most of the first line treatment drugs have already lost their utility due to increasing multiple drug resistance 3. The current pipeline of anti-leishmanial drugs is also severely depleted. Sustained efforts are needed to enrich a new anti-leishmanial drug discovery pipeline, and this endeavor relies on the availability of suitable in vitro screening models.
In vitro promastigotes 4 and axenic amastigotes assays5 are primarily used for anti-leishmanial drug screening however, may not be appropriate due to significant cellular, physiological, biochemical and molecular differences in comparison to intracellular amastigotes. Assays with macrophage-amastigotes models are considered closest to the pathophysiological conditions of leishmaniasis, and are therefore the most appropriate for in vitro screening. Differentiated, non-dividing human acute monocytic leukemia cells (THP1) (make an attractive) alternative to isolated primary macrophages and can be used for assaying anti-leishmanial activity of different compounds against intracellular amastigotes.
Here, we present a parasite-rescue and transformation assay with differentiated THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani for screening pure compounds and natural products extracts and determining the efficacy against the intracellular Leishmania amastigotes. The assay involves the following steps: (1) differentiation of THP1 cells to non-dividing macrophages, (2) infection of macrophages with L. donovani metacyclic promastigotes, (3) treatment of infected cells with test drugs, (4) controlled lysis of infected macrophages, (5) release/rescue of amastigotes and (6) transformation of live amastigotes to promastigotes. The assay was optimized using detergent treatment for controlled lysis of Leishmania-infected THP1 cells to achieve almost complete rescue of viable intracellular amastigotes with minimal effect on their ability to transform to promastigotes. Different macrophage:promastigotes ratios were tested to achieve maximum infection. Quantification of the infection was performed through transformation of live, rescued Leishmania amastigotes to promastigotes and evaluation of their growth by an alamarBlue fluorometric assay in 96-well microplates. This assay is comparable to the currently-used microscopic, transgenic reporter gene and digital-image analysis assays. This assay is robust and measures only the live intracellular amastigotes compared to reporter gene and image analysis assays, which may not differentiate between live and dead amastigotes. Also, the assay has been validated with a current panel of anti-leishmanial drugs and has been successfully applied to large-scale screening of pure compounds and a library of natural products fractions (Tekwani et al. unpublished).

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A parasite-rescue and transformation assay with THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani has been optimized for anti-leishmanial drug screening. The assay involves differentiation of THP1 cells, infection with promastigotes, treatment with test drugs, controlled lysis of the infected macrophages, rescue of amastigotes, transformation to promastigotes and monitoring promastigote growth and proliferation with a fluorometric assay.

A Parasite Rescue and Transformation Assay auf leishmanientötende Screening gegen intrazelluläre<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigoten in THP1 Menschliche Akute Monozytenleukämie Cell Line

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

Directed evolution is defined as a method to harness natural selection in order to engineer proteins to acquire particular properties that are not associated with the protein in nature. Literature has provided numerous examples regarding the implementation of directed evolution to successfully alter molecular specificity and catalysis1. The primary advantage of utilizing directed evolution instead of more rational-based approaches for molecular engineering relates to the volume and diversity of variants that can be screened2. One possible application of directed evolution involves improving structural stability of bacteriolytic enzymes, such as endolysins. Bacteriophage encode and express endolysins to hydrolyze a critical covalent bond in the peptidoglycan (i.e. cell wall) of bacteria, resulting in host cell lysis and liberation of progeny virions. Notably, these enzymes possess the ability to extrinsically induce lysis to susceptible bacteria in the absence of phage and furthermore have been validated both in vitro and in vivo for their therapeutic potential3-5. The subject of our directed evolution study involves the PlyC endolysin, which is composed of PlyCA and PlyCB subunits6. When purified and added extrinsically, the PlyC holoenzyme lyses group A streptococci (GAS) as well as other streptococcal groups in a matter of seconds and furthermore has been validated in vivo against GAS7. Significantly, monitoring residual enzyme kinetics after elevated temperature incubation provides distinct evidence that PlyC loses lytic activity abruptly at 45 &deg;C, suggesting a short therapeutic shelf life, which may limit additional development of this enzyme. Further studies reveal the lack of thermal stability is only observed for the PlyCA subunit, whereas the PlyCB subunit is stable up to ~90 &deg;C (unpublished observation). In addition to PlyC, there are several examples in literature that describe the thermolabile nature of endolysins. For example, the Staphylococcus aureus endolysin LysK and Streptococcus pneumoniae endolysins Cpl-1 and Pal lose activity spontaneously at 42 &deg;C, 43.5 &deg;C and 50.2 &deg;C, respectively8-10. According to the Arrhenius equation, which relates the rate of a chemical reaction to the temperature present in the particular system, an increase in thermostability will correlate with an increase in shelf life expectancy11. Toward this end, directed evolution has been shown to be a useful tool for altering the thermal activity of various molecules in nature, but never has this particular technology been exploited successfully for the study of bacteriolytic enzymes. Likewise, successful accounts of progressing the structural stability of this particular class of antimicrobials altogether are nonexistent. In this video, we employ a novel methodology that uses an error-prone DNA polymerase followed by an optimized screening process using a 96 well microtiter plate format to identify mutations to the PlyCA subunit of the PlyC streptococcal endolysin that correlate to an increase in enzyme kinetic stability (Figure 1). Results after just one round of random mutagenesis suggest the methodology is generating PlyC variants that retain more than twice the residual activity when compared to wild-type (WT) PlyC after elevated temperature treatment.

A novel directed evolution method specific to the field of thermostability engineering was developed and consequently validated for bacteriolytic enzymes. After only one round of random mutagenesis, an evolved bacteriolytic enzyme, PlyC 29C3, displayed greater than twice the residual activity when compared to the wild-type protein after elevated temperature incubation.

Ein neues Screening-Verfahren für die gelenkte Evolution von thermostabilen Bakteriolytische Enzyme

Directed evolution is defined as a method to harness natural selection in order to engineer proteins to acquire particular properties that are not ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Generation und Multi-phänotypischen High-Content-Screening<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon-Mutanten

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the etiological agent of TB, is refractory to rapid and lasting chemotherapy due to the presence of bacilli exhibiting phenotypic drug resistance. The charcoal agar resazurin assay (CARA) was developed as a tool to characterize active molecules discovered by high-throughput screening campaigns against replicating and non-replicating M. tuberculosis. Inclusion of activated charcoal in bacteriologic agar medium helps mitigate the impact of compound carry-over, and eliminates the requirement to pre-dilute cells prior to spotting on CARA microplates. After a 7-10 day incubation period at 37 &#176;C, the reduction of resazurin by mycobacterial microcolonies growing on the surface of CARA microplate wells permits semi-quantitative assessment of bacterial numbers via fluorometry. The CARA detects approximately a 2-3 log10 difference in bacterial numbers and predicts a minimal bactericidal concentration leading to &#8805;99% bacterial kill (MBC&#8805;99). The CARA helps determine whether a molecule is active on bacilli that are replicating, non-replicating, or both. Pilot experiments using the CARA facilitate the identification of which concentration of test agent and time of compound exposure require further evaluation by colony forming unit (CFU) assays. In addition, the CARA can predict if replicating actives are bactericidal or bacteriostatic.

The charcoal agar resazurin assay (CARA) is a semi-quantitative, medium-throughput method to assess activity of test agents against mycobacteria that are replicating, non-replicating, or both. The CARA permits rapid evaluation of time- and concentration-dependent activity and identifies parameters to pursue by colony forming unit (CFU) assays.

Visualisierung des Charcoal Agar Resazurin-Assay für Semi-quantitative, Mitteldurch Auszählung von Mykobakterien

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in a range of disease processes including autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay. Blood is collected using conventional venipuncture techniques. Neutrophils are isolated using dextran sedimentation and a density gradient using conditions optimized for dog blood. After allowing time for attachment to the wells of a 96 well plate, neutrophils are treated with NET-inducing agonists such as phorbol-12-myristate-13-acetate or platelet activating factor. DNA release is measured by the fluorescence of a cell-impermeable nucleic acid dye. This assay is a simple, inexpensive method for quantifying NET release, but NET formation rather than other causes of cell death must be confirmed with alternative methods.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are networks of DNA, histones and neutrophil proteins. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay.

Eine einfache Fluoreszenztest zur Quantifizierung von Canine Neutrophil Extracellular Einklemmschutz

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

Ein Fluoreszenz-basierte Lymphocyte Assay geeignet für Hochdurchsatz-Screening von kleinen Molekülen

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

System zur Wirksamkeit und Zytotoxizität Screening von Inhibitoren Targeting intrazellulärer<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate hosts, respectively. While pathogenic symptoms of leishmaniasis can vary widely, from benign cutaneous lesions to highly fatal visceral disease forms depending on the infective species, all Leishmania species reside inside host macrophages during the vertebrate stage of their lifecycle. Leishmania infectivity is therefore directly related to its ability to invade, survive and replicate within parasitophorous vacuoles (PVs) inside macrophages. Thus, assessing the parasite&#39;s ability to replicate intracellularly serves as a dependable method for determining virulence. Studying leishmaniasis development using animal models is time-consuming, tedious and often difficult, particularly with the pathogenically important visceral forms. We describe here a methodology to follow the intracellular development of Leishmania in bone marrow-derived macrophages (BMMs). Intracellular parasite numbers are determined at 24 h intervals for 72 - 96 h following infection. This method allows for a reliable determination of the effects of various genetic factors on Leishmania virulence. As an example, we show how a single allele deletion of the Leishmania Mitochondrial Iron Transporter gene (LMIT1) impairs the ability of the Leishmania amazonensis mutant strain LMIT1/&#916;Lmit1 to grow inside BMMs, reflecting a drastic reduction in virulence compared to wild-type. This assay also allows precise control of experimental conditions, which can be individually manipulated to analyze the influence of various factors (nutrients, reactive oxygen species, etc.) on the host-pathogen interaction. Therefore, the appropriate execution and quantification of BMM infection studies provide a non-invasive, rapid, economical, safe and reliable alternative to conventional animal model studies.

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

All pathogenic Leishmania species reside and replicate inside macrophages of their vertebrate hosts. Here, we present a protocol to infect murine bone marrow-derived macrophages in culture with Leishmania, followed by precise quantification of intracellular growth kinetics. This method is useful for studying individual factors influencing host-pathogen interaction and Leishmania virulence.

Quantifizierung der intrazellulären Wachstum innen Makrophagen wird eine schnelle und zuverlässige Methode zur Beurteilung der Virulenz des Parasiten Leishmania

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

Ein High-Throughput, High-Content, Liquid-basierter C. Elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...