Drug Screening Using Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) and Cell Lysate Preparation for mRNA Sequencing

Zu Beginn tauen Sie das Kryo-Fläschchen des PBMC in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius zwei bis drei Minuten lang auf, während Sie es vorsichtig umdrehen. Anschließend werden die aufgetauten Zellen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen überführt. Spülen Sie das Kryo-Fläschchen mit einem Milliliter warmem, vollständigem Wachstumsmedium und geben Sie die Lösung tropfenweise zu den Zellen im konischen Röhrchen, um den ersten Verdünnungsschritt durchzuführen.

Zentrifugieren Sie nun die Zellsuspension fünf Minuten lang und kippen Sie das konische Röhrchen fließend, um den Überstand zu entfernen. Resuspendieren Sie die Zellen in drei Milliliter warmem, vollständigem Wachstumsmedium. Für die Zellzählung mischen Sie 10 Mikroliter Zellsuspension mit Trypanblau.

Zählen Sie die Zellen mit 10 Mikrolitern gefärbter Zelllösung, entweder mit einem automatischen Zellzähler oder einer Zellkammer. Verwenden Sie warmes, vollständiges Wachstumsmedium, um die Zellen zu verdünnen, um eine Endkonzentration von eins mal 10 bis zur sechsten Zelle pro Milliliter zu erreichen. Säen Sie dann 100 Mikroliter Zellsuspension in jede Vertiefung einer 96-Well-Zellkulturplatte.

Geben Sie 100 Mikroliter der zweifachen Verdünnung des Arzneimittels in jede Vertiefung. Um die Zellen zu ernten, zentrifugieren Sie die Zellkulturplatte 10 Minuten lang. Verwenden Sie eine Vakuumpumpe, um den Überstand zu entfernen, während Sie die Pumpenspitze an der unteren Ecke des Wells platzieren, um die Zellen zu halten.

Geben Sie nun 200 Mikroliter eiskaltes PBS in jede Vertiefung. Nachdem Sie die Platte fünf Minuten lang zentrifugiert haben, entfernen Sie den Überstand. Geben Sie dann 15 Mikroliter Lysepuffer in jede Vertiefung.

Versiegeln Sie die Platte mit einer selbstklebenden Dichtungsfolie, um sie vor Verunreinigungen zu schützen. Die Platte vortexen und eine Minute lang zentrifugieren. Zum Schluss werden sechs Mikroliter der lysierten Zelllösung in einer PCR-Platte gesammelt.