Geben Sie zunächst die lentiviralen Komponenten in ein 15-Milliliter-Röhrchen und erhöhen Sie das Volumen mit EC-Puffer auf 600 Mikroliter. Fügen Sie 36 Mikroliter Enhancer-Lösung hinzu und mischen Sie mit einer Ein-Milliliter-Pipette wiederholt, wobei Sie einen Teil der Flüssigkeit aufziehen und wieder in die Lösung abgeben. Nach fünf Minuten fügen Sie 120 Mikroliter Transfektionsreagenz hinzu und mischen Sie etwa 20 Mal, wie zuvor gezeigt.
Lassen Sie die Tube 10 Minuten bei Raumtemperatur. Geben Sie dann 5,2 Milliliter cDMEM in das Röhrchen. Geben Sie mit einer Einweg-Transferpipette die Transfektionsmischung tropfenweise auf die Monoschicht der HEK293T Zellen, die in einem T175-Kolben kultiviert wurde.
Das Plasmid wird durch eine sanfte Schaukelbewegung des Kolbens gleichmäßig verteilt. Inkubieren Sie die Kultur 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Nach der Inkubation unter einem Fluoreszenzmikroskop bestätigen Sie die effektive Transfektion HEK293T Zellen durch Beobachtung der GFP-Fluoreszenz.
Kippen Sie nun den Kolben und sammeln Sie das Medium mit einem 25-Milliliter-Serologiestreifen, ohne die Zellmonoschicht zu stören. Füllen Sie das Medium in ein vorbeschriftetes 50-Milliliter-Röhrchen und schließen Sie den Deckel. 25 Milliliter warmes cDMEM werden entlang der Wände des Kolbens gegeben, ohne die Monoschicht zu stören, und der Kolben wird wieder in den Inkubator gestellt.
Nach 24 Stunden wird das Medium aufgefangen, die Dekontaminationslösung in den Kolben gegeben und für die nächsten 24 Stunden waagerecht gestellt.
