Diese Arbeit wurde durch ein &#39;Grant in Aid of Research &quot;von der Crohn-und Colitis Foundation of Kanada zu LMS, die von einer kanadischen Gesellschaft für Gastroenterologie / kanadische Verband der Gesundheitsforschung / Morbus Crohn und Colitis Foundation of Kanada New Investigator Award unterstützt wird unterstützt.

1. Depleting Makrophagen mit Clodronat-haltige Liposomen <ol><li> Liposomen werden bei 4 ° C gelagert Zwei Stunden vor der Injektion, zu entfernen Clodronat-haltigen Liposomen, PBS-enthaltenden Liposomen oder sterilem PBS (Einspritzsteuerung) aus dem Kühlschrank, damit sie auf Raumtemperatur (18 ° C) zu gewöhnen. </li><li> Kehren Sie die Röhrchen mit Liposomen 8-10 mal um eine gleichmäßige Verteilung vor dem Einlegen in 200 pl einer 1 ml Spritze zu gewährleisten. Befestigen Sie eine 26-Gauge-Nadel an die Spitze der Spritze. </li><li> Mit der linken Hand, scruff die Maus unter den Ohren hält genug Haut, ihre Kopf-und Gliederschmerzen zu immobilisieren. </li><li> Kippen Sie die Maus so sein Kopf ist leicht in Richtung Boden, so innere Organe weg von der Injektionsstelle, die in der rechten unteren Quadranten des Abdomens befindet. </li><li> Rollen Sie die Spritze zwischen Ihren Handflächen und invertieren Sie 6-mal um die Liposomen-Lösung gleichmäßig vor der Injektion zu verteilen. </li> &lt;li&gt; Führen Sie die Nadel in der rechten unteren Seite der Maus Bauch zu einem Winkel von 30-40 Grad. Injizieren Sie 200 ul Liposomen-Lösung oder PBS. </li><li> Während einer Entzündung Modell, wie DSS-induzierter Kolitis, injizieren Mäuse 4 Tage vor Beginn der experimentellen Entzündung zur Depletion von Makrophagen und alle 2 Tage während des Protokolls zum neuen infiltrierenden Makrophagen führen zu gewährleisten. </li><li> Am Ende des Experiments, zusammen mit geplanten experimentellen Analysen, Gewebe zu entfernen von der Website von Interesse und fixieren mit Paraformaldehyd zu Makrophagen-Depletion durch immunhistochemische Färbung zu bestätigen. </li></ol> 2. Ableitung von Polarized Makrophagen aus Knochenmarkaspirate <ol><li> Knochenmark von Mäusen zwischen 8 und 12 Wochen alt bietet die höchste Ausbeute von Knochenmark abgeleiteten Makrophagen. Euthanize die Maus, legen Sie es auf seinem Rücken, und festzunageln den Pfoten, Stretching seine Glieder so weit wie möglich. </li><li> Die Arbeit in einem sterilen hood, zu entfernen Oberschenkel-und Unterschenkelknochen, Wegschneiden so viel Muskelmasse wie möglich. </li><li> Flush Mark aus Knochen mit IMDM mit 10% FCS in ein 5 ml-Spritze mit einer 26 Gauge-Nadel eingepasst wird. </li><li> Verdünnen Sie Knochenmarkaspirate bis 40 ml in IMDM mit 10% FCS, Platz Zellen in einem 75 cm 2 Zellkulturflasche, und inkubieren Sie bei 37 ° C, 5% CO 2 für 4 Stunden. Dieser Schritt entfernt adhärenten mesenchymalen Zellen oder Makrophagen, die von reifen hämatopoetischen Vorläuferzellen. </li><li> Übertragen Kulturüberstand, die nicht-adhärenten Vorläuferzellen in einen 50-ml-Erlenmeyerkolben Falcon-Röhrchen und für 5 min bei 1200 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Resuspendieren Zellpellet in 5 ml IMDM, 10% FCS und zählen kernhaltigen Zellen durch Verdünnung Zellsuspension von 1 zu 20 in Essigsäure. Dieses Verfahren lysiert alle Zellen, einschließlich roter Blutzellen und die verbleibenden Kerne auf einem Hämocytometer gezählt werden können. </li><li> Die Zellen in einer Konzentration von 0,5 × 10 6 Zellen / ml in vollständigem Medium, IMDM, 10% FCS, 150 uM Monothioglycerin (MTG), und 10 ng / ml entweder MCSF, GM-CSF oder IL-3. MCSF abgeleiteten Makrophagen sind klassisch Makrophagen aktiviert, während GM-CSF oder IL-3-Makrophagen alternativ aktiviert werden. </li><li> Ersetzen Medium an Tag 4, zum Stillstand kommen, nicht adhärente Zellen und sie dann wieder in den Kolben, und am Tag 7, Verwerfen nicht-haftenden Zellen. </li><li> Darüber hinaus kann IFN (10 ng / ml) oder mit IL-4 (10 ng / ml), um Flaschen zu MCSF abgeleiteten Zellen am Tag 7 zu neigen Makrophagen aufgenommen werden klassisch aktiviert oder alternativ aktivierten Phänotyp, jeweils. Inkubieren Sie die Zellen für 3 Tage. </li><li> Am Tag 10, zu entfernen Medien und heben Zellen aus der Zellkulturflasche mit Zelldissoziation Buffer (Gibco-BRL). Platz 5 ml Puffer auf die Zellen für 5 min bei Raumtemperatur (18 ° C) und dann hauen die Seite der Kolben mit dem Handballen mehrmals kräftig. Sicherstellen, dass die Zellen aus der Flasche durch Prüfung der Kolben unter angehobenMikroskop. Pipettieren resuspendiert Zellen in einem 15 ml konischen Falcon-Röhrchen und wobei man den Kolben mit einem zusätzlichen 10 ml IMDM, 10% FBS. Pool und Spin-down die Zellen für 5 min bei 300 × g. </li><li> Anzahl lebensfähiger Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und resuspendieren in einer Konzentration von 10 7 Zellen / ml in steriler PBS pH 7,4. Makrophagen sind bereit für die Injektion in Mäuse. </li><li> Reserve 1,0 × 10 6 Makrophagen für die Bewertung der Makrophagen-Phänotyp. Klassisch aktivierten Makrophagen sezernieren mit Lipopolysaccharid hohe Stickoxid und IL-12p70 und niedrige Spiegel von IL-10 stimuliert, um alternativ aktivierten Makrophagen verglichen. Alternativ aktivierten Makrophagen konstitutiv YM1 und Arginase I (Argi), die durch Western-Immunoblotting nachgewiesen werden kann. </li></ol> 3. Uberweisung Makrophagen in Mäuse <ol><li> Resuspendieren Makrophagen in sterilem PBS bei einer Konzentration von 10 7 Zellen / ml. Dies ermöglicht eine inintravenös Injektion von 10 6 Makrophagen in einem Gesamtvolumen von 100 ul, die ein Volumen, das sicher und komfortabel in Mäuse können durch die Schwanzvene injiziert ist. </li><li> Warm-Mäuse mit einem Heizkissen oder Hitze Runde für 5-10 min, um die Schwanzvene erweitern. Überwachen Sie die Maus jederzeit auf Anzeichen von Hyperthermie. </li><li> Übertragen Sie die Maus auf eine Haltevorrichtung, die Zugriff auf den Schwanzvenen erlaubt. </li><li> Drehen Sie den Schweif 90 °, so dass die Vene nach oben zeigt. Venen laufen seitlich nach unten beiderseits des Schwanzes und entweder Vene eingesetzt werden kann. </li><li> Reinigen Sie die Injektionsstelle mit einem Alkoholtupfer und langsam injizieren 100 ul (10 6 Makrophagen) mit einer 1 ml Spritze mit einer 26 oder 28 Gauge-Nadel. Führen Sie die Nadel mit der Schräge nach oben und in einem leichten Winkel, fast parallel zur Ader. </li><li> Wenn die Nadel richtig eingesetzt wird, sollte kein Widerstand zu spüren und die Vene sollte sich nach der Injektion deutlich. Wenn die Nadel nicht in derVene, wird der Schwanz Ausbuchtung. Wenn dies geschieht, entfernen Sie die Nadel und versuchen Sie es erneut proximal der letzte Versuch oder in der anderen Vene. Eine neue Nadel muss für jede Injektion verwendet werden, da der Schwanz ist hart und die Nadeln werden stumpf schnell bei Injektion in die Schwanzvene. </li><li> Nach der Injektion die Nadel entfernen, sanften Druck auf die Injektionsstelle, bis die Blutung stoppt, und überwachen Sie die Maus für eine weitere 5min um sicherzustellen, dass Blutung aufgehört hat. </li><li> Wiederholen Sie die Makrophagen-Injektionen alle 4 Tage, um eine kontinuierliche Lieferung von polarisiertem Makrophagen während der Versuchsdurchführung zu gewährleisten. </li><li> Am Ende des Experiments, mit experimentellen Analysen zu entfernen Gewebe von der Stelle von Interesse setzen und mit Paraformaldehyd oder Formalin eine effektive Bereitstellung von polarisiertem Makrophagen durch immunhistochemische Färbung zu bestätigen. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Die Anzahl und Phänotyp der Bewohner macropHages in einem bestimmten Gewebe ist abhängig von dem Gewebe, das geprüft und wird während der Infektion oder Entzündung zu ändern. In ähnlicher Weise wird die Fähigkeit von Clodronat-haltigen Liposomen zu Makrophagen aus einem Gewebe führen auf der Route der Verabreichung und effektive Abgabe an das Zielgewebe abhängen. Die intraperitoneale Injektion von Clodronat-haltigen Liposomen führt zu einer Abnahme der F4/80 + Makrophagen in der Maus Kolons bei DSS-induzierter Colitis deutlich durch immunhistochemische Färbung für die Makrophagen-Marker, F4/80 (1A). Histologische Färbung kann ebenfalls verwendet werden, um quantitative Unterschiede in Anzahl und Makrophagen-Phänotyp in Gewebeschnitten zu bestimmen. 1B zeigt, dass ein Durchschnitt von 55% von Makrophagen durch Clodronat-Liposomen im Vergleich zu ohne Verarmungserhöhungs in Maus Doppelpunkte erkannt verarmt ist, wenn Mäuse mit eingespritzt PBS allein als Einspritz-Steuerung. Jeder Wert wird durch Auszählen F4/80 und Argi Fleck bestimmtED-positiven Zellen in Gewebeschnitten von seriellen 6 Mäusen an 3 Punkten, in 3 Abschnitte pro Maus mit dem Zählen von zwei Personen geblendet zu experimentellen Bedingungen durchgeführt. Diese Ergebnisse zeigen, dass intraperitoneale Injektionen von Clodronat-Liposomen Kolon-Makrophagen in Mäusen führen. Ableitung von Makrophagen aus dem Knochenmark in Gegenwart von verschiedenen Wachstumsfaktoren Ausbeuten Makrophagen, die klassisch aktiviert werden (MCSF gewonnenen oder MCSF abgeleiteten und mit IFN) oder alternativ aktiviert (GM-CSF oder IL-3-abgeleiteten oder MCSF-abgeleitet und Behandlung mit IL-4). Flushing Knochenmark aus zwei Oberschenkel-und Unterschenkelknochen 2 aus einem 8 Wochen alten Maus liefert typischerweise 6 × 10 7 kernhaltige Zellen pro Maus und Renditen 8 × 10 6 MCSF abgeleiteten Makrophagen, 10 × 10 6 GM-CSF-abgeleiteten Makrophagen, oder 12 × 10 6 IL-3-Makrophagen. 2A zeigt die Nitrit-und IL-12p70/IL-10 Verhältnis in Makrophagen supernatants mit Lipopolysaccharid für 24 Stunden behandelt 2B zeigt eine typische Western-Blot-Analyse von 0,5 × 10 6 Makrophagen aus MCSF + / -. IL-4 Ableitung Bedingungen mit Antikörpern, um alternativ aktivierten Makrophagen-Marker, Argi, YM1, oder GAPDH als Ladekontrolle. Diese Daten zeigen, dass Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen zu einer polarisierten Phänotyp während der Ableitung verdreht werden kann. Effektive Übertragung von ex vivo abgeleitet polarisierte Makrophagen an ein Gewebe ist abhängig von der Art der Verabreichung und den Zugang zu dem Gewebe. Während DSS-induzierter Colitis, injiziert Makrophagen intravenös zu reisen, um den Ort der Entzündung und alternativ aktivierten Makrophagen zu reduzieren Schwere der Erkrankung. 3A zeigt die Anzahl von Makrophagen und die Anzahl der Argi + (alternativ aktiviert) Makrophagen in histologischen Schnitten von Mäusen gezählt mit polarisiertem injiziert Knochenmark-Makrophagen. Die Auswirkungen der Übertragung von polarisierte Makrophagen auf den Dickdarm während der DSS-induzierter Kolitis wird durch Disease Activity Index, ein Additiv Punktzahl auf den Gewichtsverlust, rektale Blutungen und verminderte Stuhlkonsistenz (3B), basierend gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass ex vivo abgeleitet, adoptiv übertragen Makrophagen kann der Verkehr auf den Dickdarm und die Auswirkungen einer Entzündung geführt. M1 Makrophagen haben keine Auswirkungen auf Entzündungen, während M2 Makrophagen signifikant reduzieren Disease Activity Index. <img src="/files/ftp_upload/4105/4105fig1.jpg" alt="1"/> Abbildung 1. Clodronat-haltige Liposomen effektiv führen und F4/80 + F480 + Argi + Zellen in Maus Doppelpunkte in vivo. Ein F2-Generation von Wildtyp-Mäusen auf einem gemischten C57BL / 6 × 129Sv Hintergrund wurden 5% DSS für 7 Tage und ip injiziert gegeben mit PBS (Kontrolle) oder Clodronat-haltige Liposomen (Clodronat) 4 Tage vor der Behandlung DSSund an den Tagen 0, 2, 4 und 6 während DSS-Behandlung. (A) Doppelpunkte entfernt wurden, fixiert, und die Schnitte wurden durch Immunhistochemie für reife Makrophagen (F4/80) und der Makrophagen-Marker M2, Argi gefärbt. (B) Quantifizierung von F4/80 + und Argi + Makrophagen. Positiv gefärbte Zellen wurden durch zwei Personen blind für experimentellen Bedingungen bei 40-facher Vergrößerung in 6 Felder von 3 Teilen / Maus und 6 Mäuse / Gruppe gezählt. * P &lt;0,01. <img src="/files/ftp_upload/4105/4105fig2.jpg" alt="2"/> Abbildung 2. MCSF abgeleiteten Makrophagen exprimieren ein klassisch aktivierten Phänotyp und MCSF abgeleiteten Makrophagen mit IL-4 behandelt Ausdruck einer alternativ aktivierten Makrophagen-Phänotyp. (A) in Übereinstimmung mit einer klassisch aktiviert Phänotyp erzeugen MCSF abgeleiteten Makrophagen höheren Stickoxid in Reaktion auf Lipopolysaccharid und kann durch die Griess-Assay, die die stromabwärtigen Metabolit, Nitrit erkennt gemessen werden. Sie ALSo erzeugen einen höheren IL-12p70/IL-10 Verhältnis, das durch ELISA gemessen werden kann. * P &lt;0,01 für n = 3. (B) In Übereinstimmung mit einer alternativ aktivierten Phänotyp, MCSF abgeleiteten Makrophagen mit IL-4 konstitutiv YM1 und Argi behandelt, was durch Western Immunoblotting nachgewiesen werden. Die Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente mit ähnlichen Ergebnissen. <img src="/files/ftp_upload/4105/4105fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Intravenöse injizierten, ex vivo gewonnenen alternativ Makrophagen-Verkehr auf den Dickdarm aktiviert und reduzieren Darmentzündungen. Ein F2-Generation von Wildtyp-Mäusen auf einem gemischten C57BL / 6 × 129Sv Hintergrund wurden 5% DSS im Trinkwasser für sechs Tage gegeben. M1 und M2 Makrophagen wurden iv an den Tagen 0 und 4 injiziert während DSS-Behandlung. (A) Doppelpunkte entfernt wurden, fixiert, und die Schnitte wurden durch Immunhistochemie für reife Makrophagen (F4/80) und einem M2 Makrophagen-Marker (Argi) gefärbt.Die Quantifizierung von Makrophagen zur Steuerung PBS-injizierten Mäusen (C) wurden die Mäuse mit M1 Makrophagen (+ M1) und Mäusen, die mit M2 Makrophagen (+ M2) eingespritzt durch Zählen positiv gefärbten Zellen bei 40-facher Vergrößerung in 6 Felder von 3 Teilen / Maus durchgeführt und von 6 Mäusen / Gruppe. Zählen wurde von zwei Personen geblendet zu experimentellen Bedingungen durchgeführt. (B) Die Krankheitsaktivität wurde überwacht und täglich während der Behandlung erzielt und ist ein Additiv Punktzahl auf den Gewichtsverlust, rektale Blutungen und verminderte Stuhlkonsistenz basiert. * P &lt;0,05 für n = 6 Mäuse in zwei unabhängigen Experimenten.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Makrophagen sind Phagozyten, die eine wichtige Rolle im Immunsystem spielen. Sie sind verantwortlich für die Initiierung der angeborenen Immunantwort und die Leitung der erworbenen Immunantwort. Typischerweise werden klassisch aktivierten Makrophagen durch IFN oder LPS aktiviert und sind für die Beseitigung von Pathogenen und zum Montieren eines Entzündungsreaktion 1. Umgekehrt werden alternativ aktivierten Makrophagen durch IL-4 oder IL-13 aktiviert und spielen eine Rolle in Schutt und Scavenging Gewebeum...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Clodronat-haltige Liposomen </td><td> <a href="http://Clodronateliposomes.org" target="_blank">Clodronateliposomes.org</a> </td><td></td></tr><tr><td> PBS-haltigen Liposomen </td><td> <a href="http://Clodronateliposomes.org" target="_blank">Clodronateliposomes.org</a> </td><td></td></tr><tr><td> Sterilem PBS pH-Wert 7,4 </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td></tr><tr><td> IMDM </td><td> Invitrogen </td><td> 12440 </td></tr><tr><td> Fötalem Kälberserum (FCS) </td><td> Invitrogen </td><td> 12483 </td></tr><tr><td> Essigsäure </td><td> BDH Aristar </td><td> BDH3092-500MLP </td></tr><tr><td> Monothioglycerol (MTG) </td><td> Sigma </td><td> 96-275 </td></tr><tr><td> Recombtionsabhängig murinen MCSF </td><td> StemCell Technologies </td><td> 02951 </td></tr><tr><td> Rekombinantes murines GM-CSF </td><td> StemCell Technologies </td><td> 02935 </td></tr><tr><td> Rekombinantes Mäuse-IL-3 </td><td> StemCell Technologies </td><td> 02903 </td></tr><tr><td> Rekombinantes murines IFN </td><td> StemCell Technologies </td><td> 02746 </td></tr><tr><td> Rekombinantes murines IL-4 </td><td> StemCell Technologies </td><td> 02714 </td></tr><tr><td> Zelldissoziation Buffer </td><td> Invitrogen </td><td> 13150-016 </td></tr><tr><td> Ratten-Antikörper anti-F4/80 </td><td> AbD Serotec </td><td> MCA497GA </td></tr><tr><td> Maus-Antikörper anti-Argi </td><td> BD Transduction Laboratories </td><td> 610708 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Spezifische Reagenzien in diesem Protokoll verwendet.

depletion and reconstitution of macrophages in mice

Makrophagen sind wichtige Akteure der angeborenen Immunantwort auf infektiöse Herausforderung oder Verletzungen, Initiierung der angeborenen Immunantwort und die Leitung der erworbenen Immunantwort. Macrophage Dysfunktion kann zu einer Unfähigkeit führen, um eine geeignete Immunantwort und als solche ist in vielen Krankheitsprozessen, einschließlich entzündlicher Darmerkrankungen beteiligt ist. Makrophagen zeigen polarisiert Phänotypen, die grob in zwei Kategorien unterteilt sind. Klassisch aktivierten Makrophagen, aktiviert durch Stimulation mit IFN-oder LPS, spielen eine wesentliche Rolle in Reaktion auf bakterielle Herausforderung während alternativ aktivierten Makrophagen, aktiviert durch IL-4 oder IL-13, in Schutt und Scavenging Gewebeumbildung teilnehmen und wurden in der Auflösung in Verbindung gebracht Phase der Entzündung. Während einer Entzündungsreaktion in vivo werden Makrophagen unter einem komplexen Gemisch von infiltrierenden Immunzellen und kann durch Verschärfung oder Resolvin Teilnahmeg Entzündung. Um die Rolle von Makrophagen in situ definiert in einem ganzen Tier-Modell ist es notwendig, die Wirkung der Erschöpfung Makrophagen aus dem komplexen Umgebung zu untersuchen. Um Fragen über die Rolle von Makrophagen-Phänotyp in situ fragen, können phänotypisch definierten polarisierte Makrophagen ex vivo abgeleitet werden, aus Knochenmarkaspirate und wieder hinzugefügt, um Mäuse, mit oder ohne vorherige Depletion von Makrophagen. In der hier dargestellten Protokoll Clodronat-haltigen Liposomen, gegen PBS injiziert Kontrollen wurden verwendet, um Kolon Makrophagen während Dextran Natriumsulfat (DSS)-induzierte Colitis bei Mäusen führen. Darüber hinaus wurden polarisierte Makrophagen ex vivo abgeleitet und in Mäusen durch intravenöse Injektion. Ein Vorbehalt bei diesem Ansatz ist, dass Clodronat-haltige Liposomen führen alle professionellen Phagozyten, einschließlich der beiden dendritischen Zellen und Makrophagen so zu gewährleisten, die Wirkung durch eine Verarmung zu beobachten ist Makrophagen-spezifische, Rekonstitution of Phänotyp durch adoptiven Transfer von Makrophagen erforderlich ist. Systemische Makrophagen-Depletion bei Mäusen auch durch Rückkreuzung Mäusen auf eine CD11b-DTR Hintergrund erreicht werden kann, ist das eine ausgezeichnete Ergänzung. Der Vorteil von Clodronat-haltigen Liposomen-vermittelte Abreicherung ist, dass es nicht erforderlich, die Zeit und Kosten bei Rückkreuzung Mäusen beteiligt und es kann in Mäusen verwendet, unabhängig von dem Hintergrund der Mäuse (C57BL / 6, BALB / c oder gemischte Hintergund ).

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Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Makrophagen spielen eine zentrale Rolle bei der Homöostase und Pathologie in vielen Geweben. Das Protokoll beschreibt hier vorgestellte Verfahren zur Abreicherung von Makrophagen<em&gt; In-vivo-</em&gt;, Ableiten polarisierte Makrophagen aus Knochenmarkaspirate und adoptiv Übertragung Makrophagen in Mäusen. Diese Techniken erlauben die Bestimmung der Rolle, die polarisierte Makrophagen spielen in Gesundheit und Krankheit.

Depletion und Rekonstitution von Makrophagen in Mäuse

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

39.4K Aufrufe.  University of British Columbia. Makrophagen spielen eine zentrale Rolle bei der Homöostase und Pathologie in vielen Geweben. Das Protokoll beschreibt hier vorgestellte Verfahren zur Abreicherung von Makrophagen In-vivo-, Ableiten polarisierte Makrophagen aus Knochenmarkaspirate und adoptiv Übertragung Makrophagen in Mäusen. Diese Techniken erlauben die Bestimmung der Rolle, die polarisierte Makrophagen spielen in Gesundheit und Krankheit.

Serie: Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

Depletion spezifischer Zellpopulationen durch Ergänzung Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

Studium der Biogenese Phagolysosom im Live-Makrophagen

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

Verwendung von<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Zum Autophagie-Zytoskelett Interaktionen zu untersuchen

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

Killer Künstliche Antigen-präsentierenden Zellen (KaAPC) für effiziente<em&gt; In-vitro-</em&gt; Depletion von humanen Antigen-spezifischen T-Zellen

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

Proteomik von Makrophagen durch 2D-Elektrophorese

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Makrophagen-Cholesterin Depletion und Auswirkungen auf die Phagozytose<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like Shigella flexneri and Francisella novicida need to induce the rupture of the phagosome. In contrast, Salmonella typhimurium replicates in a vacuolar compartment, known as Salmonella-containing vacuole (SCV). However certain mutants of Salmonella fail to maintain SCV integrity and are thus released into the cytosol. The percentage of cytosolic vs. vacuolar bacteria on the level of single bacteria can be measured by differential permeabilization, also known as phagosome-protection assay. The approach makes use of the property of detergent digitonin to selectively bind cholesterol. Since the plasma membrane contains more cholesterol than other cellular membranes, digitonin can be used to selectively permeabilize the plasma membrane while leaving intracellular membranes intact. In brief, following infection with the pathogen expressing a fluorescent marker protein (e.g. mCherry among others), the plasma membrane of host cells is permeabilized with a short incubation in digitonin containing buffer. Cells are then washed and incubated with a primary antibody (coupled to a fluorophore of choice) directed against the bacterium of choice (e.g. anti-Salmonella-FITC) and washed again. If unmarked bacteria are used, an additional step can be done, in which all membranes are permeabilized and all bacteria stained with a corresponding antibody. Following the staining, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria can be quantified by FACS or microscopy by counting single or double-positive events. Here we provide experimental details for use of this technique with the bacterium Salmonella typhimurium. The advantage of this assay is that, in contrast to other assay, it provides a quantification on the level of single bacteria, and if analyzed by microscopy provides the exact number of cytosolic and vacuolar bacteria in a given cell.

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

Die Quantifizierung der Cytosolic vs. Vacuolar<em&gt; Salmonellen</em&gt; In Primäre Makrophagen durch Differential Permeabilisierung

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Isolierung von Salmonella Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolation und In-vitro- Kultur von murinen und menschlichen alveoläre Makrophagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Tuning Degradation to Achieve Specific and Efficient Protein Depletion

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting them for degradation. This system is exploited in many non-plant eukaryotes, such that a target protein, tagged with the AID motif, is degraded upon auxin addition. The level of TIR1 expression is critical; excessive expression leads to degradation of the AID-tagged protein even in the absence of auxin, whereas low expression leads to slow depletion. A &#946;-estradiol-inducible AID system was created, with expression of TIR1 under the control of a &#946;-estradiol inducible promoter. The level of TIR1 is tunable by changing the time of incubation with &#946;-estradiol before auxin addition. This protocol describes how to rapidly deplete a target protein using the AID system. The appropriate &#946;-estradiol incubation time depends on the abundance of the target protein. Therefore, efficient depletion depends on optimal timing that also minimizes auxin-independent depletion.

Here, we present a protocol to effectively and specifically deplete a protein of interest in the yeast Saccharomyces cerevisiae using the &#946;-est AID system.

Tuning Degradation, um eine spezifische und effiziente Proteinerschöpfung zu erreichen

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting ...