Da Makrophagen auf die Detektion von Molekülen ohne Selbstherkunft spezialisiert sind, sind sie besonders schwer zu transfetieren. Wir beschreiben ein Protokoll, das eine hocheffiziente Transfektion von primären Makrophagen mit mRNA ermöglicht, die aus DNA-Vorlagen wie Plasmiden generiert werden. Der Hauptvorteil unserer Methode besteht darin, dass hohe Transfektionsraten ohne nachweisbare Zytotoxizität oder Immunogenität erreicht werden.
Demonstrieren sie das Verfahren wird Marc Herb ein Postdoc aus meinem Labor sein. Beginnen Sie mit dem Auftauen aller Komponenten des RNA-Transkriptionskits. Wirbeln Sie die Reagenzien für fünf Sekunden und drehen Sie sie für zwei Sekunden bei 2.000 mal g, dann halten Sie sie auf Eis, bis zum Gebrauch.
Bereiten Sie die In-vitro-RNA-Transkriptionsreaktion in einem 0,5-Mikroliter-Mikrozentrifugenrohr entsprechend den Manuskriptanweisungen vor. Wirbeln Sie die Röhre und drehen Sie sie nach unten. Dann inkubieren Sie es bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten, während bei 400 Rpm auf einem thermischen Mischpult mischen.
Nach der Inkubation zwei Mikroliter DNase I direkt in den Reaktionsmix geben. Wirbel und drehen Sie die Röhre nach unten, und inkubieren Sie es in den thermischen Mischer für weitere 15 Minuten. Reservieren Sie ein Zwei-Mikroliter-Aliquot des mit Dnase behandelten Produkts für das Kontrollgel und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius.
Für PolyA-Tailing fünf Mikroliter 10X PolyA-Polymerase-Reaktionspuffer und fünf Mikroliter PolyA-Polymerase zur Dnase-behandelten Reaktion hinzufügen. Wirbel und drehen Sie die Mischung. Dann inkubieren Sie es in den thermischen Mischer für 30 Minuten.
Wenn die Reaktion abgeschlossen ist, nehmen Sie ein Zwei-Mikroliter-Aliquot für das Kontrollgel und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius. Fügen Sie 5-Prime-Dephosphorylierungsreagenzien direkt in das PolyA-Tailed-Produkt gemäß den Manuskriptanweisungen. Wirbel und drehen Sie das Rohr, und inkubieren Sie es in den thermischen Mischer für weitere 30 Minuten.
Folgen Sie der Dephosphorylierungsreaktion mit einer zweiminütigen Inkubation bei 80 Grad Celsius, um die antarktische Phosphatase zu erhitzen. Reinigen Sie dann die in vitro transkribierte mRNA mit einem speziellen RNA-Reinigungskit. Messen Sie die Konzentration und Reinheit der eluierten mRNA mit einem Mikrovolumenspektrophotometer.
Führen Sie ein denaturierendes Agarose-Gel mit den zuvor gesammelten Aliquots aus, um das Vorhandensein eines einzelnen Produkts, die korrekte Transkriptlänge und die PolyA-Abschweifung zu überprüfen. Bereiten Sie sich auf die Transfektion vor, indem Sie das vorberechnete Volumen des mRNA-Transfektionspuffers abzüglich der Volumina von mRNA-Transfektionsreagenz und der mRNA zu einem Reaktionsröhrchen hinzufügen. Den mRNA-Bestand auftauen und sanft mischen, indem Sie das Rohr umdrehen.
Fügen Sie dann das vorberechnete Volumen von mRNA in das Reaktionsröhrchen. Wirbel und Spin-down der Reaktionsmischung und der mRNA-Transfektionsreagenz, dann fügen Sie das entsprechende Volumen des mRNA-Transfektionsreagenzins in das Reaktionsmixröhrchen. Wirbeln Sie die Röhre und drehen Sie sie nach unten.
Dann inkubieren Sie es bei Raumtemperatur für 15 Minuten. In der Zwischenzeit ersetzen Sie das Kulturmedium der Makrophagen durch frische swarme Kulturmedium. Sobald die Inkubation der Transfektionsmischung abgeschlossen ist, fügen Sie die Mischung in die Plattenbrunnen, die die Makrophagen tropfenweise und in einem Kreis von außen bis zur Mitte des Brunnens enthalten.
Um eine gleichmäßige Verteilung der Transfektion zu gewährleisten, schaukeln Sie die Platte sanft in vertikaler und horizontaler Richtung. Dann inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für mindestens sechs Stunden. Analysieren Sie nach der Inkubation die Transfektionseffizienz mit Fluoreszenzmikroskopie, Durchflusszytometrie oder Immunoblot.
Der wichtigste Teil dieses Verfahrens ist die Gewährleistung einer gleichmäßigen Verteilung des Transfektionsmixes, so dass alle Makrophagen mit der gleichen Menge an mRNA in Kontakt kommen. Dieses Protokoll wurde erfolgreich verwendet, um mRNA-Codierung FLAG-markierte NEMO- und IKK-Beta-Varianten für die Transfektion von primären Makrophagen zu generieren. Die korrekte Größe und PolyA-Abschwänze der mRNA wurde durch Agarose-Gel-Elektrophorese nachgewiesen.
Die Transfektionseffizienz wurde durch die Generierung von mRNA-Codierung GFP und die Durchführung von Durchflusszytometrie-Analysen bestätigt. Die Transfektionsrate erhöhte sich zusammen mit der Menge an transfizierter mRNA und erreichte 50 bis 65 % für PM und 80 bis 85 % für BMDM. Sowohl bei PM als auch bei BMDM erhöhte sich der Expressionsgrad von EGFP in transfizierten Zellen in zeitlicher und dosisabhängiger Weise.
Wichtig ist, dass die Analyse von Propidiumiodid-positivem oder Annexin-V-positiver Makrophagen bestätigte, dass das Transfektionsverfahren keinen lytischen oder apoptotischen Zelltod induzierte. Die Transfektionseffizienz von mRNAs, die mit FLAG-markierten Nemo- oder IKK-Beta-Varianten kodieren, wurde mit Immunfluoreszenzmikroskopie analysiert. Die Raten lagen bei Nemo mRNAs bei etwa 60% und bei IKK-beta mRNAs bei 55%.
Dieses Protokoll wurde auch verwendet, um mRNA-Codierung Cre Recombinase zu generieren. Die Transfektion von 400.000 BMDM mit 400 Nanogramm Cre-Rekombimeiß mRNA führte nach 48 Stunden zu einer nahezu vollständigen Erschöpfung des Nemo-Proteins, was auf eine hocheffiziente Transfektion hindeutet. Das Fehlen nachweisbarer Mengen an Interleukin 1 beta, Interleukin-6 und Tumornekrosefaktor deuten darauf hin, dass das Transfektionsverfahren keine pro-inflammatorische Signalisierung aktiviert.
Unsere relativ einfache Methode ermöglicht es schließlich, mutierte oder markierte Proteine in primären Makrophagen effizient auszudrücken. Dies würde die Analyse von Makrophagenfunktionen auf molekularer Ebene wesentlich voranbringen.
