Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Lungenimmunität zu beantworten, wie die Expression von microRNAs bewertet werden kann, die voraussichtlich entzündliche Gene in der Lunge regulieren. Diese Technik bietet die einfache Möglichkeit, die Beiträge von zirkulierenden Hormonen zur Lunge microRNA Expression zu identifizieren. Um das estre Zyklusstadium zu beurteilen, halten Sie eine acht bis neun Wochen alte weibliche Maus manuell zurück und führen Sie die Spitze einer 10-Mikroliter-Kunststoffpipette ein, die mit ultrareinem Wasser gefüllt ist, in die Vagina.
Vier- bis fünfmal sanft spülen, um eine Probe zu sammeln, und die endgültige Spülung der Vaginalflüssigkeit auf eine Glasrutsche ablagern. Beobachten Sie dann die ungefärbte vaginale Spülung unter einem Lichtmikroskop bei 20-facher Vergrößerung. Für Ozon- und gefilterte Lufteinlagen maximal vier Mäuse in einen von zwei einzelnen 1,2-Liter-Glasbehältern mit Drahtgitterdeckeln geben.
Legen Sie einen Glasbehälter in eine Ozonkammer und einen in eine gefilterte Luftbelichtungskammer. Dann stellen Sie die Ozonkonzentration auf zwei Teile pro Million ein und entfernen Sie den Behälter nach drei Stunden. Vier Stunden nach der Exposition, desinfizieren Sie die exponierte Hautoberfläche der ersten experimentellen Maus mit 70% Ethanol und schneiden Sie den Rippenkäfig weg, um Herz und Lunge freizulegen.
Verwenden Sie Zangen, um ein 1,5 Milliliter RNase-freies Mikrozentrifugenrohr in den flüssigen Stickstoff zu tauchen und die geerntete Lunge im flüssigen Stickstoff einzufrieren. Verwenden Sie dann einen Edelstahl-Gewebepulverisator, um die gesamte Lunge zu maskieren, und teilen Sie das pulverisierte Gewebe zwischen zwei 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhren. Nach der Ernte und Pulverisierung der Lunge von allen Tieren auf die gleiche Weise, fügen Sie 500 Mikroliter Guanidiniumthiocyanat zu jeder Probe und sequenziell homogenisieren jedes Gewebe mit 18, 21 und 23 Gauge Nadeln.
Nach der letzten Homogenisierung 500 Mikroliter Ethanol in jede Probe geben, bevor sie 15 Sekunden lang wirbeln. Die Mischungen zur Zentrifugation in einzelne Spinsäulen in einzelne Sammelrohre laden und die Durchflusse entsorgen. Für die Behandlung mit DNase 1 400 Mikroliter RNA-Waschpuffer zu jeder Spalte für eine weitere Zentrifugation hinzufügen und fünf Mikroliter DNase 1 und 75 Mikroliter DNA-Verdauungspuffer pro Probe in RNase-freien Röhrchen mischen.
Fügen Sie die Mischung direkt zu den Säulenmatrizen für eine 15-minütige Inkubation bei Raumtemperatur hinzu, gefolgt von zwei 400 Mikroliter-RNA-Vorspüllösungsspülungen durch Zentrifugation. Um die RNA zu verbessern, fügen Sie 35 Mikroliter DNase-RNase-freies Wasser direkt zu jeder Säulenmatrix für eine endgültige Zentrifugation hinzu und messen die gesamte RNA-Konzentration und Reinheit jeder Probe auf einem Spektralphotometer. Dann lagern Sie die RNA bei minus 80 Grad Celsius.
Für die Retrotranskription der kleinen RNase, fügen Sie 200 Nanogramm der gesamten RNA in 10 Mikroliter Vorspüllösung zu einem Röhrchen Reverse Transkriptionsreaktionsmix pro Probe hinzu. Nach dem Mischen die Proben kurz zentrieren und bis zu ihrer Inkubation auf Eis legen. Als nächstes inkubieren Sie die Rohre für 60 Minuten bei 37 Grad Celsius, gefolgt von einer fünfminütigen Inkubation bei 95 Grad Celsius.
Am Ende der zweiten Inkubation die CDNA mit 200 Mikroliter RNase-freiem Wasser pro 20 Mikroliter Reverse-Transkriptionsreaktion verdünnen und 10 Mikroliter jeder Reaktionsmischungsprobe zu jedem Brunnen einer vorinstallierten Mausentzündungsreaktion und Autoimmunität microRNA PCR-Array hinzufügen. Das Proestrusstadium kann durch das Vorhandensein von runden und wohlgeformten Nukleat-Epithelzellen identifiziert werden. Wenn sich die Maus im Estrusstadium befindet, werden im Abstrich dicht gepackte Cluster von anucleierten, verhornten und Plattenepithelzellen beobachtet.
Während metestrus werden verhornte Epithelzellen und polymorphonukleare Leukozyten beobachtet. In Diestrus sind Leukozyten im Allgemeinen häufiger. Rna, die aus vier Mauslungen extrahiert wird, weisen, wie gezeigt, Nukleinsäurekonzentrationen zwischen 1198 und 2178 Nanogramm pro Mikroliter und ein durchschnittliches A260-A280-Verhältnis zwischen 2,01 und 2,02 und ein durchschnittliches A260-A230-Verhältnis zwischen 2,139 und 2,223 auf.
In dieser Tabelle werden zweifache Veränderungen der microRNA-Expression zwischen Ozon und gefilterten luftexponierten Mäusen angezeigt. Nach microRNA-Zielfilter und Kernanalyse für 14 microRNAs können diese Daten durch den microRNA-Zielfilter abgebildet werden, um das signifikante Expressionsprotokollverhältnis und die P-Werte zu erhalten. Die Kernanalyse liefert auch Informationen über kanonische Wege, Krankheiten und Funktionen, Regulierungsbehörden und Netzwerke.
Darüber hinaus kann die funktionale Analysesoftware verwendet werden, um eine Netzwerkanalyse zu erstellen, die die Beziehung zwischen den microRNAs von Interesse und anderen Molekülen zeigt. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, den Estrus-Zyklus täglich für mindestens drei aufeinander folgende Zyklen zu überprüfen, bevor ein Experiment durchgeführt wird. Nach diesem Verfahren können andere Methoden durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen über die entzündliche Genexpression der Lunge während des Estrus-Zyklus zu beantworten.
Nach der Entwicklung ebnete diese Technik anderen Forschern auf dem Gebiet der Lungenimmunität den Weg, um Mechanismen der Sexualhormonregulation mit anderen Modellen zu erforschen.
