Entfernen Sie zunächst den Kolben von einer 50-Milliliter-Spritze und führen Sie ein Polyethersulfon mit geringer Proteinbindung oder einen 0,45-Mikrometer-Sterilfilter aus Polyvinylidenfluorid in das Spritzenende ein. Geben Sie mit einer serologischen Stripette von 25 Millilitern das transfizierte Lentivirus HEK293T Zellsuspension in die Spritze und führen Sie den Kolben vorsichtig zurück. Schieben Sie den Kolben langsam und sammeln Sie das Filtrat in einem neuen 50-Milliliter-Röhrchen.
Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie den Filter aus der Spritze und entsorgen Sie ihn in der Dekontaminationslösung. Geben Sie drei Milliliter einer 20%igen Saccharoselösung in den Boden des Ultrazentrifugenröhrchens. Als nächstes stellen Sie den PIPETBOY auf die niedrigste Geschwindigkeit.
Halten Sie das Ultrazentrifugenröhrchen in einem Winkel von ca. 45 Grad und geben Sie das gefilterte lentivirushaltige Medium langsam auf die Röhrchenwand. Beachten Sie die klare Trennung der Schichten vom Rohr. Wenn das Gesamtvolumen des Röhrchens weniger als 29 Milliliter beträgt, fügen Sie frisches cDMEM hinzu, um zu verhindern, dass das Röhrchen während des Schleuderns zusammenklappt.
Wischen Sie den Ultrazentrifugeneimer mit 70%igem Alkohol ab und setzen Sie den Schlauchadapter in den Boden des Eimers ein. Legen Sie dann das Ultrazentrifugenröhrchen in den Eimer. Schließen Sie den Eimer und stellen Sie ihn in den Korb.
Kühle die Ultrazentrifuge auf vier Grad Celsius vor. Setzen Sie den Eimer vorsichtig in den Rotor ein und schalten Sie das Vakuum ein. Stellen Sie die Beschleunigungs- und Verzögerungsrate auf die niedrigste Stufe ein und zentrifugieren Sie 90 Minuten lang bei 26.000 U/min bei vier Grad Celsius.
Schalten Sie nach der Zentrifugation das Vakuum aus und entfernen Sie vorsichtig den Rotor, ohne die Proben zu stören. Beobachten Sie die Ultrazentrifuge, um sicherzustellen, dass die Eimer nicht verschüttet werden und auslaufen. Gießen Sie den Inhalt eines Ultrazentrifugenröhrchens in einer gleichmäßigen Bewegung in den Abfallbehälter.
Drehen Sie die Tube 10 Minuten lang auf ein doppellagiges Seidenpapier um. Wischen Sie in der Zwischenzeit das Innere des Eimers mit 70 % Ethanol getränktem Seidenpapier ab und trocknen Sie ihn kopfüber an der Luft. Trocknen Sie die verbleibende Flüssigkeit vorsichtig mit Seidenpapier vom Rand des Ultrazentrifugenröhrchens ab.
Suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter eines geeigneten serumfreien Mediums und lassen Sie es 15 Minuten einwirken. Mischen Sie die Lentivirus-Präparate vorsichtig mit einer Ein-Milliliter-Pipette und aliquotieren Sie sie in 1,5-Milliliter-Schraubröhrchen. Lagern Sie die lentiviralen Präparate bei minus 80 Grad Celsius.
Ein erfolgreiches Lentivirus-Präparat erreichte eine Infektionsrate von über 95 % mit einer Dosis von fünf Mikrolitern. Die mittlere Fluoreszenzintensität infizierter Zellen nimmt mit höheren Dosen zu. Die intraperitoneale Injektion von 100 Mikrolitern Lentiviruspräparat ergab den höchsten Prozentsatz und die höchste Intensität des GFP-Signals in Peritonealzellen von Mäusen.
Zeitverlaufsexperimente mit 100-Mikroliter-Lentivirus-Injektionen zeigten einen signifikanten Prozentsatz an GFP-exprimierenden residenten Zellen an den Tagen drei und sieben, gefolgt vom Verschwinden der infizierten Population an Tag 14.
