Bereiten Sie zunächst 30 Mikroliter Färbepuffer mit 2x Arbeitskonzentrationen für Einzelfarben- und FMO-Kontrollen vor. Übertragen Sie den einfarbigen Färbepuffer und den Färbepuffer für die FMO-Kontrolle in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Füllen Sie das Volumen mit 20 Mikrolitern FACS-Puffer auf.
Um die Probe zu färben, bereiten Sie 0,5 Milliliter 2x FACS-Färbepuffer in 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen vor. Pipettieren Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension in einfarbige und FMO-Kontrollvertiefungen. Geben Sie dann 2x FACS-Färbepuffer zum Rest der Zellsuspension und inkubieren Sie.
Geben Sie anschließend 100 Mikroliter FACS-Puffer in die Vertiefungen und zwei Milliliter des Puffers in die Probenröhrchen. Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 500 g bei vier Grad Celsius. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie dann das Zellpellet in Viabilitätspuffer.
Geben Sie 300 Mikroliter Proliferationsmedium in 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Diese dienen als Sammelröhrchen für die Zellsortierung. Nach dem Sortieren der Zellen mit FACS zentrifugieren Sie die gesammelten Zellen 10 Minuten lang bei 800 g bei vier Grad Celsius.
Verwenden Sie eine P1000-Pipette, um den Überstand vorsichtig zu entfernen, ohne das Pellet zu stören. Resuspendieren Sie das Pellet in Proliferationsmedien bis zu einer Enddichte von 100 Zellen pro Mikroliter. Die Zellsuspension in die Vertiefungen einer 48-Well-Gewebekulturplatte aussäen.
Zum Schluss wird die Platte unter entsprechender Gaszugabe in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius überführt, bis die Zellen zusammenfließen. Konfluente Zellen mit typischer Fibroblastenmorphologie wurden innerhalb von fünf Tagen nach der Kultivierung erhalten.
