Dies ist ein Protokoll zur Isolierung von primären Mausmuskelstammzellen für die Untersuchung des Stoffwechsels ex vivo. Dieses Protokoll bietet eine viel größere Population von Stammzellen im Vergleich zu anderen Protokollen, die wir in der Vergangenheit ausprobiert haben. Und wichtig ist, dass, sobald wir diese Stammzellen in Myotuben differenzieren, sie normale Physiologie aufweisen, also Dinge wie zirkadiane Rhythmen.
Wenn Sie dieses Verfahren zum ersten Mal ausprobieren, nehmen Sie detaillierte Notizen und speichern Sie mehrere Bilder, weil jede Gewebeexplantation anders aussieht und es Variationen im Auswachsen von Myoblasten geben wird. Ohne visuelle Demonstration ist es schwierig zu wissen, ob Sie die richtigen Zellen isolieren. Wir profitierten von der großzügigen Hilfe anderer, die uns diese Methode zeigten, als wir sie in unserem Labor etablierten.
Nach der Vorbereitung der Schale für die Zerlegung nach dem Manuskript, bereiten Sie eine feuchte Kammer, indem Sie zwei bis drei Blatt dickes absorbierendes Papier in eine Plastiktüte und verwenden Sie eine Pipette, um die Oberfläche des Papiers mit sterilem Wasser zu befeuchten. Legen Sie die Kammer für fünf Minuten unter UV-Licht, um zu sterilisieren. Sezieren Sie den gewünschten Muskel von einer vier bis acht Wochen alten Maus und spülen Sie sanft in PBS mit 40 Mikrogramm pro Milliliter Gentamycin zu sterilisieren.
Verwenden Sie sterile Zangen, um den Muskel auf eine sterile 10 Zentimeter unbeschichtete Petrischale zu übertragen. Fügen Sie 0,5 bis einen Milliliter Beschichtungsmedien über den Muskel, so dass das Gewebe feucht ist, aber nicht schwebend. Verwenden Sie ein steriles Skalpell oder Rasierklinge, um den Muskel sanft in kleine Fragmente zu schneiden.
Verwenden Sie Zangen oder eine Pipette, um die Muskelfragmente auf die Oberfläche einer vorbeschichteten Sechs-Zentimeter-Platte zu übertragen. Sehr sanft überlagern weitere 0,8 Milliliter Beschichtungsmedien über das Gewebe. Legen Sie die sechs Zentimeter große Schale mit den Muskelfragmenten in die feuchte Kammer und geben Sie sie 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid in einen Brutkasten zurück.
Myoblast-Medien, Trypsin und PBS-Gentamycin in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius vorbereiten und vorwärmen. Um einen T25-Kolben für jede Muskelgruppe zu beschichten, fügen Sie zwei Milliliter Beschichtungslösung auf die Oberfläche des Kolbens, schütteln Sie sanft, um eine gleichmäßige Schicht auf der Oberfläche zu schaffen, und bebrüten sie den Kolben bei vier Grad Celsius für eine Stunde. Mit einer Pipette nun die Beschichtungsmedien aus den Muskelexplanten entfernen und die Muskelexplantationen vorsichtig mit zwei Millilitern PBS-Gentamycin abspülen.
Entfernen Sie die PBS schnell und lassen Sie die Platte nicht im PBS sitzen. Dann vorsichtig einen Milliliter PBS-Gentamycin hinzufügen und die Platte für eine Minute in den 37 Grad Celsius Inkubator legen. Verwenden Sie eine P1000 Pipette, um die PBS mit Zellen in einem 15 Milliliter Zentrifugenrohr zu sammeln.
Als nächstes fügen Sie einen Milliliter Trypsin auf die Platte und geben Sie es für drei Minuten in den 37 Grad Celsius Inkubator zurück. Tippen Sie vorsichtig auf die Platten, um die Myoblasten zu vertreiben. Sammeln Sie das Trypsin mit Zellen und kombinieren Sie es mit der PBS-Auflistung.
Acht Milliliter Myoblast-Medien in das Zentrifugenrohr geben und sanft invertieren. Überlagern Sie vorsichtig zwei Milliliter Beschichtungslösung auf den Muskelplatten und bringen Sie die Platten zum 37 Grad Celsius Inkubator zurück. Drehen Sie die Zentrifugenröhren, die Zellen in einer Zentrifuge enthalten, drei Minuten lang bei 200 mal g.
Aspirieren Sie den Überstand und halten Sie etwa einen Milliliter in der Röhre. Fügen Sie vorsichtig myoblast-Medien hinzu, übertragen Sie die Zellen in den vorbeschichteten Kolben und legen Sie den Kolben in den 37-Grad-Celsius-Inkubator. Aspirieren Sie die Medien von P0 myoblast T25 Kolben.
Spülen Sie die Zellen kurz mit zwei Millilitern warmem PBS-Gentamycin und saugen Sie dann die PBS aus dem Kolben. Pipette zwei Milliliter warme PBS in jeden Kolben mit Myoblasten. Legen Sie die Kolben mit PBS für drei Minuten in den 37 Grad Celsius Inkubator.
Tippen Sie dann fest auf die Seite des Kolbens, um die Zellen zu lösen. Überprüfen Sie unter einem Lichtmikroskop frei schwebende Myoblasten. Legen Sie die Kolben aufrecht in eine Gewebekulturhaube und spülen Sie den Boden der Kolben mit 10 Millilitermyoblast-Medien zwei- bis dreimal ab, um sicherzustellen, dass alle Zellen entfernt werden.
Sammeln Sie die Zellmedienmischung in einem 15 Milliliter Zentrifugenrohr. Zentrifuge für drei Minuten bei 200 mal g. Aspirieren Sie die Medien, um etwa einen Milliliter in der Röhre zu lassen, um das Zellpellet zu vermeiden.
Fügen Sie dem Zentrifugenrohr vorsichtig ein entsprechendes Volumen myoblast-Medien hinzu und mischen Sie es vorsichtig. Verteilen Sie die Zellmischung auf neue T75-Flaschen mit jeweils sechs Millilitern. Fügen Sie 10 Milliliter myoblast-Medien zu jedem neuen T75-Kolben hinzu.
Schütteln Sie die Kolben vorsichtig horizontal, um die Zellen zu verteilen und legen Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius in den Inkubator. In diesem Protokoll wurden Primärzellen, die aus den Expflanzen hervorgingen, unter einem Standardlichtmikroskop beobachtet. Frühe Ernten von Myoblasten erschienen als kleine runde und helle Kugeln.
Die Differenzierung von Myoblasten dauerte vier bis sechs Tage, in denen sich die Morphologie der Zellen von einzelnen runden Kugeln zu langgestreckten, verschmolzenen langen, mehrnukleierten Fasern wandelte. Es wurden vollständig differenzierte Myotubes nachgegeben, die zur Messung der Sauerstoffverbrauchsraten bereit waren. Diese Zellen können für eine Reihe von nachgelagerten Anwendungen verwendet werden.
Zum Beispiel verwenden wir sie häufig, um den Substratfluss in Seepferdchen-Instrumenten zu untersuchen.
