Zu Beginn erhalten Sie aktiv wachsende menschliche Magenorganoide mit Durchmessern zwischen 200 und 700 Mikrometern. Tauen Sie das aliquot der extrazellulären Matrix (ECM) mindestens 45 Minuten lang auf Eis auf. Und wärmen Sie Zellkulturplatten bei 37 Grad Celsius in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator vor.
Nachdem Sie das Medium aus den Vertiefungen der Kulturplatte entfernt haben, pipettieren Sie eiskaltes PBS auf jedes ECM-Tröpfchen. Und kratzen Sie das Gel mit der P-1000 Pipettenspitze ein. Sammeln Sie das PBS mit den Organoiden enthaltenden EZM-Fragmenten in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen.
Zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 200 g bei vier Grad Celsius. Nach dem Aspirieren des Überstands 350 Mikroliter 0,25 %iges Trypsin-EDTA in jedes Röhrchen geben und vorsichtig mischen. Inkubieren Sie die Röhren in einem Wasserbad, das zwei bis fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius temperiert ist.
Geben Sie 600 Mikroliter eiskaltes DMEM, ergänzt mit Penicillin und Streptomycin, in jedes Röhrchen und pipettieren Sie 40 Mal kräftig auf und ab. Zentrifugieren Sie das Röhrchen wie gezeigt und suspendieren Sie die Zellpalette wieder in eiskalter flüssiger ECM. Für jede Probe werden 40 Mikroliter der flüssigen ECM, die Organoid-Fragmente enthält, in einer dünnen, horizontalen Linie entlang des Durchmessers einer 35 Millimeter großen Glasbodenschale plattiert.
Nach 15 bis 30 Minuten Inkubation geben Sie vorsichtig zwei Milliliter organoides Expansionsmedium auf die Platte am Rand der Schale, ohne das polymerisierte Gel zu stören.
