Dieses Protokoll ermöglicht eine Visualisierung dreidimensionaler Strukturen in der vollen Niere, was durch eine makroskopische Perspektive zu innovativen Entdeckungen in der Nierenforschung führen kann. Die Färbung ganzer Organe ist aufgrund der Schwierigkeit der Antikörperpenetration eine Herausforderung. Dieses Protokoll hat die qualitativ hochwertige, vollständige Färbung der Nieren durch die Antikörper nachgewiesen.
Um zu beginnen, führen Sie die Immersionsfixierung unmittelbar nach der Perfusionsfixierung und Nierenprobenahme durch, indem Sie die Niere 16 Stunden lang in 4% Paraformaldehyd bei vier Grad Celsius tauchen. Geben Sie drei Wäschen mit PBS für jeweils zwei Stunden. Führen Sie den Entfärbungs- und Delipidierungsprozess durch, indem Sie die festsitzende Niere in sieben Millimeter 50% CUBIC-L in einem 14-Milliliter-Rundbodenrohr mit leichtem Schütteln bei Raumtemperatur eintauchen.
Nach sechs Stunden tauchen Sie die Niere in sieben Milliliter CUBIC-L in einem 14 Millimeter Rundbodenrohr mit leichtem Schütteln bei 37 Grad Celsius für fünf Tage. Aktualisieren Sie CUBIC-L jeden Tag. Sobald die Entfärbung und Delipidierung abgeschlossen sind, verwenden Sie einen Dosierlöffel für die Probenhandhabung und waschen Sie die Niere dreimal mit PBS bei Raumtemperatur für zwei Stunden.
Immunfärbung der delipidierten Niere in primären Antikörpern, verdünnt in Färbepufferlösung, mit leichtem Schütteln in einem Inkubatorschüttler bei 37 Grad Celsius für sieben Tage. Dann waschen Sie die Niere mit 0,5% Triton X-100 in PBS, auch bekannt als PBST, bei Raumtemperatur für einen Tag. Für die sekundäre Antikörperfärbung behandeln Sie die Niere mit sekundären Antikörpern im Färbepuffer, im Dunkeln, mit leichtem Schütteln bei 37 Grad Celsius für sieben Tage.
Fixieren Sie die Flecken mit einer PBST-Wäsche bei Raumtemperatur für einen Tag. Nach der Fixierung tauchen Sie die Niere drei Stunden lang in 1% Formaldehyd in PB ein und waschen Sie sie sechs Stunden lang mit PBS bei Raumtemperatur. Führen Sie die Brechungsindexanpassung durch, indem Sie die Niere in sieben Milliliter 50% CUBIC-R+ in ein 14-Milliliter-Rundbodenrohr mit Schütteln für einen Tag tauchen, gefolgt von einer Behandlung mit sieben Milliliter CUBIC-R+ mit Schütteln bei Raumtemperatur für zwei Tage.
Mit Hilfe der Immunfärbemethode wurden sympathische Nerven und Arterien in einer ganzen Niere in der 3D-Nierenbildgebung sichtbar gemacht. Darüber hinaus wurden abnormale Nierensympathikusnerven nach Ischämie-Reperfusionsverletzung visualisiert. Dieses Protokoll erleichterte auch die Visualisierung sympathischer Nerven in der gesamten Milz.
Hier wird der Datenquantifizierungsprozess für die dreidimensionale Immunfluoreszenzfärbung dargestellt. Darüber hinaus wurden Sammelkanäle, das S1-Segment der proximalen Tubuli und die Glomeruli erfolgreich in einer ganzen Niere sichtbar gemacht. Die unterdrückte Glomerulomegalie, die aus der Medikamentenverabreichung in den frühen Stadien der diabetischen Nierenerkrankung resultiert, wurde auch in der 3D-Bildgebung visualisiert.
Dieses Protokoll kann das spezifische Molekül in einer ganzen Niere markieren. So können Forscher Strukturveränderungen im Gefäßsystem analysieren oder seltene Ereignisse im Nierengewebe finden.
