This work was funded by The National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (G1000121 ID no.94513) and the Oracle Cancer Trust. SE is supported by The Institute of Cancer Research and Cancer Research UK (grant number C309/A8274). We acknowledge NHS funding to the NIHR Biomedical Research Centre.

1. Erzeugung reproduzierbar Sized Tumorsphäroide <ol><li> Waschtumorzellmonoschichten mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS; 5 ml für einen 25 cm 2 oder 8 bis 10 ml für einen 75 cm 2 Kolben), fügen Zelldissoziation Enzym (1 ml für einen 25 cm 2 bzw. 2 ml für einen 75 cm 2 Kolben) und inkubieren Zellen bei 37 ° C für 2-5 min. </li><li> Überprüfen Zellablösung unter dem Mikroskop und neutralisieren Zelldissoziation Enzym mit kompletten Wachstumsmedium (5 ml für eine 25 cm 2 oder 8 ml für eine 75 cm 2-Kolben). </li><li> Zentrifuge Zellsuspension bei 500 × g für 5 min. </li><li> Überstand entfernen, tippen Sie auf das Rohr und resuspendieren Zellpellet in 1 ml vollständigem Wachstumsmedium mit einem P1000 Pipette. Dies sollte eine Einzelzellsuspension ohne Zellclustern ergeben. </li><li> Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und verdünnt das Zellsuspension zu erhalten, 0,5 bis 2 x 10 4 Zellen / ml (für jede Zelllinie in o bestimmt werden optimale Zelldichte braucht500 &amp; mgr; m Durchmesser 4 Tage nach der Zellaussaat 12,13) ​​- rder zu Tumorsphäroide von 300 zu erhalten. </li><li> Übertragen Sie die Zellsuspension in einen sterilen Behälter und, mit einer Mehrkanalpipette 200 ul / Vertiefung in Ultra-Low-Befestigung (ULA) 96-well Rundbodenplatten 12. </li><li> Übertragen die Platten in einen Inkubator (37 ° C, 5% CO 2, 95% Luftfeuchtigkeit). Vier Tage später visuell Tumor Sphäroidbildung bestätigen und mit dem 3D-Invasion Assay. </li></ol> 2. 3D-Tumor Spheroid Invasion Assay <ol><li> Auftauen BMM auf Eis. </li><li> Halten Sie einen Satz von Sterilfilter-Tipps für P10, P200 und P1000 Pipetten und sterile Röhrchen (1,5 ml Volumen oder größer, je nach erforderlichen Gesamtvolumen) bei -20 ° C. </li><li> Legen Sie die ULA 96-Well-Platten, die 4 Tage alten Sphäroiden auf Eis. </li><li> Mit Hilfe einer Mehrkanalpipette, entfernen Sie vorsichtig 100 ul / Vertiefung von Wachstumsmedium aus den Sphäroiden Platten. Für diesen Schritt Winkel die Spitzen in Richtung der inside Wand der U-Boden-Vertiefungen, die Vermeidung von Kontakt mit dem Boden des Bohrlochs und die Position der Sphäroide; minimiert Störungen der Sphäroide. </li><li> Verwendung eiskalten Tipps, übertragen BMM zu eiskalten Röhren. Für Zytokin-induzierte Invasion oder für die Arzneimittelevaluationsstudien, fügen Reagenzien (mit 2x die endgültige Konzentration) auf die BMM mit eiskaltem Tipps. Verwenden Sie beispielsweise den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), um die Invasion von CAL CAL S und R-Plattenepithel-Karzinom-Zellen zu stimulieren. Gut mischen durch vorsichtiges Schwenken, die Vermeidung der Bildung von Blasen. </li><li> Gently verzichten 100 ul BMM in die U-Boden gut, mit dem Ziel die Spitze in Richtung der Innenwand des gut. Dieser Schritt ist der kritischste als für eine optimale Bildanalyse muss Sphäroide in der Mitte der Vertiefung 12 verharren. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.6 für alle erforderlichen Brunnen, so dass 5-6 Wiederholungen / Zustand. Falls erforderlich, ein frisch-gekühlten Spitze. HINWEIS: Wenn mehr Erfahrung, dispense BMM mit einer Mehrkanalpipette. </li><li> Mit einer sterilen Nadel, entfernen Sie Luftblasen, falls vorhanden. <ol><li> Mit einem Mikroskop, visuell zu überprüfen, dass Sphäroide sind in einer zentralen Lage. Wenn nicht, Zentrifugieren Sie die Platte bei 300 × g für 3 min bei 4 ° C. Dadurch wird sichergestellt, dass Sphäroide sind zentral gelegen in jeder gut. </li></ol></li><li> Übertragen die Platte in einen Inkubator bei 37 ° C und damit der BMM zu verfestigen. </li><li> 1 Stunde später, mit einer Mehrkanalpipette, sanft fügen 100 ul / Vertiefung der vollständigen Wachstumsmedium. Für zytokininduzierte Invasion oder Drogenbewertungsstudien umfassen Zytokine oder Inhibitoren in dem Medium (1x Endkonzentration). Alternativ, wenn Reagenzien wurden nicht auf die BMM in Schritt 2.5 hinzugefügt, fügen Sie sie in das Medium an dieser Stelle (3x die gewünschte Endkonzentration). </li></ol> 3. Automatische Bildaufnahme <ol><li> Scan-Platten auf dem Zytometer (für Spezifikationen siehe Tabelle von Ausrüstung und Materialien) in Abständen starting vom Zeitpunkt Null (t0 = Tag der Invasion Assay einzurichten, unmittelbar nach Schritt 2.10 bis zu 72 Stunden oder 96 Stunden für langsamere eindringenden Tumorzelllinien. </li><li> Wählen Sie den &quot;Confluence&quot; Anwendung. </li><li> Überprüfen Sie, ob das Sphäroid im Fokus ist und, falls erforderlich, manuell einstellen und fixieren Sie den &quot;Fokus versetzt. </li><li> Unter &quot;Sampling-Einstellungen&quot; die Option auf eine zentrale Sichtfeld (FOV) zu scannen. Folgende BMM hinaus sollte Tumorsphäroide in einer zentralen Position geblieben sind, so gibt es keine Notwendigkeit, das gesamte Wohl scannen. </li><li> In der Software definieren, die Vertiefungen auf, indem Sie sie auf der Platte Karte gescannt werden. Klicken Sie auf &quot;Suchlauf starten&quot;. HINWEIS: Der Scan wird automatisch gespeichert und können später offline überprüft werden. </li></ol> 4. Automatisierte Bildanalyse <ol><li> Wählen Sie &quot;Confluence&quot; Anwendung. </li><li> In der Registerkarte &quot;Analyse&quot;, passen application-Einstellungen (zB &quot;Genauigkeit&quot;: niedrig, normal, hoch, &quot;Intensitätsschwelle&quot;: 1 - 15), um eine genaue Segmentierung auf der Sphäroid, einschließlich Zellprozesse und invadopodia sich in den BMM (siehe Abbildung 1) zu erzeugen. Passen Sie die Einstellungen für die einzelnen Tumorzelllinie und / oder zu verschiedenen Zeitpunkten. Die &quot;Confluence&quot; Anwendungsmaßnahmen der% der Muldenbereich durch die eindringenden Zellen bedeckt, in der ausgewählten FOV. </li><li> Überprüfen Sie, dass die Analyseeinstellungen sind angemessen (dh genaue Segmentierung) für andere Sphäroiden in der Platte, indem Sie auf ein paar verschiedenen Brunnen. Wenn die Segmentierung nicht genau umreißen ein Sphäroid, weiter einzustellen die Anwendungseinstellungen. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Start Analyse&quot;. </li><li> Auf der Registerkarte &quot;Ergebnisse&quot;, überprüfen Sie mehrere Brunnen Analysequalität zu überprüfen. Export &quot;Nun Pegeldaten&quot; in ein Tabellenkalkulationsprogramm. </li><li> Repeat-Analyse für alle Zeitpunkte. Berechnen Sie den Mittelwert% Konfluenz für replizieren Brunnen und Grundstücks Invasion (% Konfluenz) gegen die Zeit in einem Balkendiagramm, mit Wissenschaftliche Visualisierungs- und Statistiksoftware der Wahl. </li></ol> 5. Manuelle Image Acquisition <ol><li> Aufnehmen eines Bildes für jeden Tumor Sphäroid in Abständen ausgehend von t = 0 bis zu 72 bis 96 h, je nach Geschwindigkeit der Invasion der Zelllinie in Frage, unter Verwendung eines umgekehrten Mikroskops (bei einer 96-Well-Platte dies dauert ca. 20 - 30 min). Verwenden Sie einen 10X-Objektiv. Verwenden Sie einen 4X Ziel, wenn ein fallenen Bereich zu groß ist, um innerhalb des 10X Sichtfeld vollständig erfasst werden. </li><li> Speichern Sie jede erworbene Einzelbild. </li><li> Zur Kalibrierung nehmen Bilder einer Bühne Raster (1 mm) mit beiden 10X und 4X Ziele (und Speichern von Bildern). </li></ol> 6. Manuelle Bildanalyse <ol><li> Öffnen Sie die Bühne Rasterbilder in die Bildanalyse-Software der Wahl. </li><li> Geben Sie den graticule Messungen, die Einheiten (um), die Ziele verwendet (10X oder 4X) und führen Sie die Kalibrierung. Dieser Schritt wird nur einmal benötigt. Für die anschließende Bildanalyse, laden Sie einfach die gewünschten Kalibrierungseinstellungen. </li><li> Öffnen Sie die Invasion Assay Bild, und wählen Sie die Kalibrierungseinstellungen je nach Mikroskopobjektiv (10x oder 4X) verwendet, um die Bilder zu erhalten. <ol><li> Alternativ Import von Bildern auf einem Zytometers (Schritt 3) erhalten und manuell zu analysieren, wie Bilder mit Hilfe eines Umkehrmikroskops erhalten beschrieben (siehe in Abbildung 3 und Abbildung 4 dargestellten Ergebnissen). </li></ol></li><li> Man misst die Fläche von den Sphäroiden bedeckt. <ol><li> In dem hier verwendeten für die Repräsentative Ergebnisse (siehe Tabelle für Spezifikationen von Ausrüstung und Materialien) Software, um &quot;Measure&quot; und wählen &quot;Count / Größe&quot;. Wählen Sie &quot;Datei&quot; und dann &quot;Einstellungen laden&quot; und wählen vorgegebenen assay-Einstellungen. Dann wählen Sie &quot;Count&quot;. Das Sphäroid ist dann genau segmentiert werden. </li><li> Alternativ zu &quot;Bearbeiten&quot; gehen dann &quot;Zeichnen / Merge-Objekte&quot;, um das Fenster &quot;Magic Wand / Trace&quot; zu öffnen. Verwenden Sie den Zauberstab Cursor auf dem Sphäroid Bild klicken und erhalten Segmentierung. Wählen Sie &quot;Trace&quot; (im Fenster &quot;Magic Wand&quot;) von Hand skizzieren die Sphäroid mit einer Maus. </li></ol></li><li> Export Messungen verschiedener Parameter (Fläche, Durchmesser, Umfang, etc.) in eine Tabellenkalkulation. Nehmen Sie in der Kalkulationstabelle die relevanten Bildinformationen (zB auch Anzahl, relative Zeitpunkt). </li><li> Zeichnen Sie die mittlere Fläche der Replikation Sphäroiden (Invasion) gegen die Zeit unter Verwendung Wissenschaftliche Visualisierungs- und Statistiksoftware. Alternativ berechnet die Veränderung der Sphäroid Bereich zu jedem Zeitpunkt in Bezug auf den Bereich zum Zeitpunkt t = 0. Dann Stück Invasion (% t0) über die Zeit als eine lineare graph. </li></ol>

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Alle Autoren erklären, keine konkurrierenden Interessenkonflikt.

Die beiden hier beschriebenen Tumormodellen (Glioblastom und SCCHN) wurden speziell ausgewählt, um unsere 3D-Test veranschaulichen, wie sie sind klinisch relevante lokal invasiven Karzinomen mit einem ungedeckten Bedarf an wirksamen Therapien 12. Nach medikamentöse Behandlung, die Beurteilung der in vitro pharmakodynamische (PD) Biomarker Veränderungen können leicht durch Western-Blot oder Immuntests von Lysaten nach der Anwendung von bestimmten im Handel erhältlichen Reagenzien zur Zellgewinnung von BMM und / oder Immunfluoreszenz-Analyse der Invasion Tumorsphäroide durch ganze Periode durchgeführt werden Mount-Färbung. Diese Invasionsassay ist eine nützliche Technik für die schnelle und reproduzierbare Beurteilung des Tumorzellinvasion in einem halbfesten Medium, und somit für zukünftige besonders geeignete in vitro Wirkstoff-Screening. Krebszellen dringen in die Matrix in einem 3D-Weise, wie sie aus einer &quot;Mikro-Tumor&quot;, durch den Tumor Sphäroid dargestellt verteilt, und erstrecken sich in einer extracellular-Matrix-ähnlichen Umgebung. Der wahre Dreidimensionalität des Assays ist im Zellmorphologie, die sich von dem flachen, adhärenten Zellen Morphologie anzunehmen, wenn das sich auf einem festen Substrat ist offensichtlich. Der Grad der Invasion wird leicht unter Verwendung entweder eines Zytometers, wodurch ein automatisiertes Auslesen oder durch Verwendung eines Standard-Mikroskop in Kombination mit bildgebenden Software quantifiziert. Darüber hinaus ist dieses Verfahren geeignet für Fluoreszenzabbildung 13 (beispielsweise mit Zelllinien, die fluoreszierende Proteine ​​oder vormarkierten mit Fluoreszenzfarbstoffen). Das Verfahren ist einfach, mit dem nur kritische Schritt der Zugabe des BMM, dargestellt durch, wenn die Gefahr besteht, der die zentrale Position des Sphäroids im stören auch U-förmig. Dies kann zu einer suboptimalen Bildanalyse ergeben, mit Kügelchen in unterschiedlichen Fokusebenen. Es ist daher wichtig, die BMM vorsichtig und langsam in jede Vertiefung hinzufügen. Nach BMM Außerdem ist es ratsam, um die Platte zu überprüfenunter einem Mikroskop, und wenn die Lokalisierung als unannehmbar betrachtet, kann dies durch sanfte Zentrifugation beseitigt. Mit der Erfahrung, das ist selten notwendig. Während diese Methode ist robust und sehr gut reproduzierbar, konnte zwischen experimentelle Variation mit verschiedenen Chargen von BMM auftreten. Um dies zu vermeiden, ist es ratsam, eine ausreichende BMM erhältlich aus einer einzigen Charge, um eine Reihe von Untersuchungen zu beenden. Eine Beschränkung des Verfahrens (wie für solche Assays) ist die Schwierigkeit beim Unterscheiden zwischen Invasion und Proliferation, die die Tumorzellen, wahrscheinlich während des Testzeitrahmen zu unterziehen. Obwohl die Verdopplungszeit der Zellen berücksichtigt werden oder Zellzyklus-Inhibitoren, wie Cytochalasin D eingeführt wird, ist es nicht leicht zu steuern oder eine eindeutige Unterscheidung zwischen diesen beiden verschiedenen Aspekten der Tumorprogression, speziell für schnell wachsende Tumorzellen und für diejenigen, haben eine &quot;expansive&quot;, eher als infiltrative, Invasion Muster. Aus diesem Grundes wird vorgeschlagen, dass eine parallele 3D-Wachstumstest durchgeführt, um spezifische Wirkungen irgend inhibitorisch oder stimulatorisch Mittel zu bewerten. Wenn sorgfältiger Dosis-Wirkungs-Studien durchgeführt werden, kann es möglich sein, Konzentrationen, die Auswirkungen auf die Proliferation zu minimieren auszuwählen. Zum Beispiel haben wir gezeigt, dass die HSP90 Inhibitor 17-AAG hemmt U-87 MG 3D Tumor Sphäroid Invasion schon bei 24 Stunden und bei Konzentrationen unterhalb der Konzentration Hemmung 3D Wachstum um 50% (GI 50) 12. Andererseits ist die Bedeutung dieser Assay, verglichen mit anderen Standard-Invasionsassays (zB Filter basierten Assays oder Eindringen einzelner Zellen in 3D-Matrices 1) ist, dass die Tumorzellen eindringen in die umgebende Matrix aus dem Sphäroid, das eine ähnlich &quot; Mikro-Tumor &quot;oder eine&quot; Mikrometastasen &quot;und deshalb berücksichtigt wichtige Aspekte der Pathophysiologie einer Tumormasse. Die Methode, die wir präsentieren liefert Informationen über diekollektive Verhalten von Tumorzellen, wenn sie anfangs so dass die Kügelchen, und auch einzeln, als Einzelzellen zu erreichen entfernteren Regionen der BMM. Zusätzlich können Zellen innerhalb Tumorsphäroide Hypoxie und Nährstoffmangel erleben, die durch Veränderungen in der Genexpression, kann Migration und Invasion zu fördern; solche Merkmale sind in 2D-Assays nicht vorhanden. Außerdem sind alle diese ist in einem Hochdurchsatzformat durch den Einsatz von speziellen Platten mit 96 Vertiefungen und die neuesten Bildverarbeitungstechnologie, wodurch eine weitere komplexe 3D-Assay, um leicht in die Zielvalidierung und Arzneimittelforschung verwendet werden. Die Methode, die wir präsentieren können weitere Anwendungen aufnehmen, um weitere Aspekte der Tumorzellinvasion anzugehen. Insbesondere können zusätzliche Komplexität durch die Zugabe von Wirtszellen, wie Fibroblasten und / oder Endothelzellen in Betracht gezogen werden, in das Sphäroid selbst oder der umgebenden Matrix. Sie kann auch geändert werden, nicht nur in Bezug auf Steifigkeit (durch die Verwendung von verschiedenen concentrations von BMM), sondern auch in Bezug auf die Zusammensetzung (durch die Zugabe von anderen Komponenten abhängig von der spezifischen Gewebe / Organ des angenommenen Tumormodell: zB Tenascin für Hirntumoren 16 und Kollagen für Mammakarzinom 17). Eine ähnliche Einrichtung (Erzeugung von Sphäroiden und Imaging) kann auch angepasst, um Gewebeinvasion in 3D, wo Tumorsphäroide sind co-kultiviert mit Embryoidkörpern ähnlich einem komplexen Gewebe 12 oder mit anderen zellspezifische Organoide (zB Astrozyten zu beurteilen Gliom 18 oder Krypta Kulturen für Magen-Darm-Krebsarten), aber weitere Arbeiten erforderlich, um automatisierte Bildanalyse zu ermöglichen.

Klassische Antikrebswirkstoffentwicklung weitgehend konzentrierte sich auf die Verwendung von in vitro zellbasierten Assays zum Screening auf zytotoxische Mittel, die Proliferation von Tumorzellen hemmen und / oder zu fördern den programmierten Zelltod (Apoptose). In jüngerer Zeit wurden Anstrengungen zur zielgerichteten Therapien mit der Entwicklung von Inhibitoren der zugrunde liegenden molekularen Ursachen für maligne Zellproliferation bewegt. Trotz einiger spektakulärer Ergebnisse werden solche Mittel häufig mit der rasanten Entwicklung von Resistenzen assoziiert. Da es sich um die invasive und metastatische Potential von Tumorzellen, die für die Mehrzahl der Krebstodesfälle verantwortlich ist, und dass rezidivierender Krankheit oft ein aggressiver Phänotyp logischen auch überlegen komplementär in vitro Versuchsmodellen 1,2 neuartige identifizieren ist Agenten, die diese zusätzlichen Schlüssel &quot;Markenzeichen&quot; von Krebs hemmen. Während der malignen Progression, Tumorzellen zu erwerbendie Fähigkeit, das umliegende Gewebe eindringen und / oder zu verbreiten, in entfernte Organe (Metastasierung). Krebszellen durchdringen die Basalmembran durch Bildung invadopodia 3,4. Diese Strukturen werden mit Aktinfilamenten spezifische Adhäsionsproteine ​​und Proteinasen angereichert und sind gemeinsam für Tumorzellbeweglichkeit und Abbau der extrazellulären Matrix (ECM) 5 verantwortlich. Invadopodia in die ECM erstrecken und als wichtig für die Tumorzellinvasion zu sein und auch in das Gefäßkanäle Extravasation, die Erleichterung hämatogene (oder lymphatischen) Verbreitung und Metastasierung. Aktuelle Standardverfahren, um die Tumorzellinvasion in vitro die folgenden Angaben enthalten zu bewerten. Transwell-basierten oder Boyden-Kammer-Assays, wo 2,6 Einzelzellsuspensionen werden auf einem Filter mit einer dicken Schicht aus ECM-abgeleiteten Proteinen beschichtet ausgesät. Cells dann eindringen und zu bewegen in die untere Kammer in Reaktion auf eine chemo Lockstoff. Häufig verwendete ECMProteine ​​sind Typ I Collagen oder ein Basalmembran-ähnlichen Matrix (BMM zB Matrigel vom EHS Tumor 7 abgeleitet ist), die die natürliche Zusammensetzung der Basalmembranen nachahmt. Als eine Alternative zu den auf Filterbasis Boydenkammer Typ 8 Assays können Zellen auf der Oberseite eines ECM-Gel (auf die Fibroblasten kann hinzugefügt werden), wo sie eine Monoschicht zu bilden und dann einzeln oder zusammen in das Gel eindringen ausgesät werden. Invasion kann in Bezug auf die Zahl der eindringenden Zellen und / oder Abstand von der Geloberfläche 9 reiste gemessen werden. In der Regel zwischen zwei Schichten aus ECM Gel- ermöglicht den Zellen, aus der Tumormasse in die umgebende Matrix 2,6,10,11 eindringen platziert - Tumorzellen können auch vollständig in einer Matrix entweder als Einzelzellsuspension oder als Kügelchen eingebettet werden. Die dreidimensionale (3D) Tumor invasion Sphäroid hier beschriebenen Test liefert ein schnelles, automatisierbare Invasion System unter Verwendung eines highly reproduzierbare, standardisierte Methode 12 in einer 96-Well-Plattenformat mit einem Sphäroid pro Vertiefung. BMM direkt zu jeder Vertiefung hinzugefügt, um eine halbfeste Matrix, in die Tumorzellen eindringen vom Sphäroid Körper bereitzustellen. 96 h - das Ausmaß der Tumorzellinvasion in Intervallen über einen Zeitraum von 72 überwacht. Dieses Verfahren bietet die folgenden Vorteile gegenüber den oben erwähnten Strom in vitro Invasionsassays: Die Tumorzellen werden in einer 3D-Struktur nachahmen einen Tumor Mikro-Region oder einer Mikrometastasierung organisiert sind; die Tumorsphäroide sind hoch reproduzierbar in der Größe; die Invasion Assay wird in situ in der gleichen Platte wie Tumor Sphäroid Entwicklung durchgeführt werden, ohne die Notwendigkeit, sie zu Sekundärplatten zu bewegen; die Methode in Kombination mit den neuesten Technologien der automatisierten Bildanalyse, ermöglicht sowohl hohen Gehalt und hohem Durchsatz Analysen von Tumorzellinvasion. Die Bildanalyse unter Verwendung eines Zytometers, das eine 96-well scannt geführtPlatte innerhalb von 10 min. Durch die Verwendung der Einmündung Anwendung ist das Ausmaß und die Geschwindigkeit der Invasion erreicht entweder durch einzelne Zellen oder Zellcluster Ausbreiten von der Tumorsphäroide und Invasion in die Matrix kann in einer dynamischen Art und Weise gemessen werden. Für geringere Durch wird ein alternatives Verfahren zur Bildanalyse vorgestellt, die auf der Verwendung eines umgekehrten Mikroskops und Standardbildbearbeitungssoftware.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1218">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:297px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:135px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:227px;">Web address</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Corning Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td style="width:161px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">354234</td>
			<td>http://www.corning.com 
			Keep at&#160; 4 &#176;C to&#160; prevent solidification and dispense using cooled pipette tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Cultrex Basement Membrane Extract, PathClear</td>
			<td style="width:161px;">Trevigen</td>
			<td style="width:135px;">3432-005-01</td>
			<td>http://www.trevigen.com 
			Keep at&#160; 4 &#176;C to&#160; prevent solidification and dispense using cooled pipette tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Ultra-low attachment 96-well plate</td>
			<td style="width:161px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">7007</td>
			<td>http://www.corning.com</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:297px;">EGF</td>
			<td style="width:161px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:135px;">130-093-825</td>
			<td>http://www.miltenyibiotec.com 
			Add 100 &#181;l 1% BSA (w/v) in water to 100 &#181;g EGF. To 25 &#181;l of this, add 4,975 &#181;l RHB-A medium to give a 10 &#181;g/ml working stock. Aliquot and store at -20&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">RHB-A medium</td>
			<td style="width:161px;">Stem Cells Inc.</td>
			<td style="width:135px;">SCS-SF-NB-01</td>
			<td>http://www.stemcellsinc.com 
			For diluting EGF</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:297px;">DMEM</td>
			<td style="width:161px;">GIBCO</td>
			<td style="width:135px;">31966-021</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/ 
			Warm in 37 &#176;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:161px;">Biosera</td>
			<td style="width:135px;">1001/500</td>
			<td>http://www.biosera.com 
			Heat at 56 &#176;C to inactivate complement before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">TrypLE</td>
			<td style="width:161px;">GIBCO</td>
			<td style="width:135px;">12605</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/ 
			Cell dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:297px;">Celigo cytometer</td>
			<td style="width:161px;">Nexcelom Bioscience</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.nexcelom.com 
			Specialist equipment for image capture and analysis.&#160; Manual image capture by microscopy and independent image analysis software is an alternative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">IX70 inverted microscope</td>
			<td style="width:161px;">Olympus</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.olympus.co.uk/ 
			Used with camera for manual image capture</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:297px;">Retiga Exi Fast 1394 digital camera</td>
			<td style="width:161px;">Qimaging</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.qimaging.com/ 
			Attached to microscope for manual image capture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Image-Pro Plus 7.0</td>
			<td style="width:161px;">Media Cybernetics</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.mediacy.com/ 
			Software used to control camera and microscope for manual image capture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Image-Pro Analyzer 7.0</td>
			<td style="width:161px;">Media Cybernetics</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.mediacy.com/ 
			Stand-alone image analysis software for manual measurment of spheroid size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Excel 2010</td>
			<td style="width:161px;">Microsoft</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.microsoft.com/ 
			Scientific graphing and statistical software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Prism 6.0</td>
			<td style="width:161px;">GraphPad</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.graphpad.com/ 
			Scientific graphing and statistical software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional (3d) tumor spheroid invasion assay

Invasion des umgebenden normalen Gewebe wird im allgemeinen als ein wichtiger Merkmal der bösartig sein (im Gegensatz zu gutartigen) Tumoren. Bei einigen Krebsarten in bestimmten (zB Hirntumoren, wie Glioblastoma multiforme und Plattenepithelkarzinomen des Kopfes und des Halses -. SCCHN) ist es eine Ursache für schwere Morbidität und kann lebensbedrohlich auch in Abwesenheit von Fernmetastasen können. Außerdem Krebsarten, die einen Rückfall erlitten haben, nach der Behandlung leider häufig vorhanden mit einem aggressiveren Phänotyp. Daher gibt es die Möglichkeit, den Prozess der Invasion Ziel, neue Therapien, die komplementär zu Standard antiproliferative Mittel sein könnten. Bisher wurde diese Strategie durch das Fehlen von robusten und reproduzierbaren Assays für eine detaillierte Analyse der Invasion und zur Wirkstoffdurchmusterung behindert. Hier bieten wir Ihnen eine einfache Mikroplattenverfahren (basierend auf einheitlichen, selbstorganisierende 3D Tumorsphäroide), die ein großes Potenzial für eine solche stu hatstirbt. Wir veranschaulichen die Testplattform unter Verwendung einer menschlichen Glioblastomzelllinie sowie eine SCCHN-Modell, wo die Entwicklung einer Resistenz gegen gezielte epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) Inhibitoren mit verbesserten Matrix invasive Potential verbunden. Wir bieten auch zwei alternative Methoden der halbautomatische Quantifizierung: eines mit einem Zytometers und ein zweites, das einfach erfordert Standard-Mikroskopie und Bildaufnahme mit digitaler Bildanalyse.

3D Tumorinvasion Sphäroid wird mit einem einfachen, reproduzierbaren, automatisierten Verfahren in Figur 1 schematisch dargestellt, beurteilt: reproduzierbar großen Tumorsphäroide durch Plattieren Zellen in ULA 96-well Rundboden Platten erhalten. 4 Tage nach der Einweihung Sphäroiden in BMM eingebettet. Dies stellt eine halbfeste Struktur, in die Tumorzellen eindringen und aus dem Sphäroid verbreiten. 96 Stunden unter Verwendung eines Zytometers - Sphäroide zentral an der Basis der Vertiefungen und Invasion in die BMM liegt leicht in Abständen ausgehend von t = 0 bis 72 überwacht. Dies kann voll automatisiert Bildanalyse bereitzustellen. Beispiele für verschiedene Arten von Krebszellinvasion in den 2 -. 4 ist die hoch-malignen menschlichen Glioblastoma multiforme (GBM) Zellinie U-87 MG, bildet eine dichte, sphärische 3D-Struktur und wird hier beispielhaft Hirntumoren, bei dem lokale Invasion ist ein wichtiger lebensbedrohlicheFunktion. Einmal in BMM eingebettet, Zellen aus U-87 MG Sphäroiden mit einem typischen &quot;Starburst&quot; Invasion Muster 12 verteilt. Tumorzellen erstrecken sich radial in die Matrix, in der sie eine 3-dimensionale Form beizubehalten. Das Verfahren wird über einen Zeitraum von 72 Stunden, gefolgt wie in Figur 2 für U-87-MG-Sphäroiden gezeigt, wenn das Ausmaß der Tumorzellinvasion, mit Angaben zu den zellulären Prozessen und invadopodia sich in den BMM ist klar ersichtlich. Vollautomatische Bildanalyse unter Verwendung eines Bild Zytometer ermöglicht eine präzise Quantifizierung der Tumorzellinvasion im Laufe der Zeit. Die Quantifizierung in Figur 2 erhalten wird, wie in Figur 1, wobei die automatisierte Analyse erzeugt Segmentierungs um die Zell Vorsprünge, die sich in den BMM vom U-87 MG Sphäroid Körper dargestellt. Man beachte, dass für diese Zellinie, das Tumor Sphäroid Körpers aus der Messung der Eindringzone Bereich ausgeschlossen. Ein anderes Muster der INVASIon wurde von menschlichen Plattenepithelkarzinomen Kopf-Hals-Krebszelllinien angezeigt. CAL CAL S und R sind isogene aber CAL S ist empfindlich gegenüber, und CAL R resistent gegen EGFR-Tyrosinkinase-Hemmer 14. In Abwesenheit des EGF weder Zelllinie in den BMM (Abbildung 3) aber, wie die Konzentration von EGF erhöht (2,5 ng / ml), die Sphäroide scheinen &quot;Bud&quot; eingedrungen. Bei den höheren Konzentrationen von EGF (40 und 80 ng / ml) den Grad der Invasion war reduziert. Dies steht im Einklang mit der klassischen glockenförmige Dosis-Wirkungs-EGF in Bezug auf die Invasion, die zuvor berichtet worden ist 15. In 20 ng / ml EGF, waren fingerartigen Vorsprünge von dem Hauptkörper des CAL R Sphäroide während CAL S Zellen extrudiert nach 72 h (Figur 3) weniger invasiv. Dieser Differenz Invasion war evident 48 h nach Sphäroide wurden in BMM (enthaltend 20 ng / ml EGF für eine maximale Unterscheidung zwischen Zelllinien platziert) Und größte nach 72 h (Abbildung 4). Diese Bilder wurden rasch mit Hilfe eines Zytometers, wie U-87 MG erworben. (Figuren 3 und 4), jedoch in diesem Fall, ein alternatives Verfahren veranschaulichen, wurde der Grad der Invasion manuell mit eigenständigen Bildanalyse-Software quantifiziert und graphisch dargestellt. Diese Ergebnisse veranschaulichen eine phänotypische Unterschied zwischen Drogenempfindlichen und resistenten Zellen, die verwendet werden könnte, um für Verbindungen, die spezifisch antagonisieren die arzneimittelresistente, invasiven Phänotyp zu screenen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der 3D-Tumor Sphäroid Invasionstest. Der Arbeitsablauf zeigt die Schritte beinhaltet das Verfahren einschließlich repräsentativer Bilder von U-87-MG Glioblastom Sphäroide direkt nach Einbetten BMM (oberes Feld; T = 0) und nach der Invasion<html> in BMM (unten; t = 72 h) mit und ohne die Segmentierung, die das Gebiet von den eindringenden Zellen bedeckt misst. Bar = 100 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig2.jpg" /> Abbildung 2. Zeitverlauf der U-87 MG Glioblastom Sphäroid Invasion in BMM. U-87 MG spheroid 3D-Invasion in BMM wurde überwacht und bis zu 72 Stunden mit einem Zytometers quantifiziert. (A) Repräsentative Bilder und (B) Quantifizierung Tumorzellinvasion gezeigt. Bar = 500 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> re 3 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 52.686 / 52686fig3.jpg &quot;/&gt; Abbildung 3. CAL R (resistent) und CAL S (Kleinschreibung beachten) Tumor Sphäroid Invasion. (A) Repräsentative Bilder und (B) manuelle Quantifizierung der EGF dosisabhängige CAL CAL R und S Tumorinvasion Sphäroid dargestellt. Bar = 500 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig4.jpg" /> 4. Die Zellen aus CAL R (resistent) Sphäroiden, wenn in B gesetzt sind invasiv als CAL S (Kleinschreibung beachten) TumorsphäroideMM. Bei EGF Stimulation CAL R Tumorsphäroide zeigen eine ausgeprägtere Invasion als CAL S. (A) Repräsentative Bilder und (B) manuelle Quantifizierung der Invasion gezeigt. Bar = 500 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Dreidimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasionsassay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

three-dimensional-3d-tumor-spheroid-invasion-assay

Research

JoVE Journal

Medicine

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

56.7K Aufrufe.  The Institute of Cancer Research. Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Serie: Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

Spheroid Assay to Measure TGF-&amp;#946;-induced Invasion

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

Spheroid Assay zur TGF-β-induzierte Invasion Measure

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

Forschung

Medizin

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

Menschliche neuroendokrinen Tumor-Zelllinien als dreidimensionales Modell für das Studium der menschlichen neuroendokrinen Tumor-Therapie

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in particular the role of the resident (stromal) cells. Studies in primary carcinomas demonstrate the influence of the microenvironment on metastasis, even on prognosis1,2. Especially the tumor associated macrophages (TAM) support migration, invasion and proliferation3. Interestingly, the major target sites of metastasis possess tissue-specific macrophages, such as Kupffer cells in the liver or microglia in the CNS. Moreover, the metastatic sites also possess other tissue-specific cells, like astrocytes. Recently, astrocytes were demonstrated to foster proliferation and persistence of cancer cells4,5. Therefore, functions of these tissue-specific cell types seem to be very important in the process of brain metastasis6,7.
Despite these observations, however, up to now there is no suitable in vivo/in vitro model available to directly visualize glial reactions during cerebral metastasis formation, in particular by bright field microscopy. Recent in vivo live imaging of carcinoma cells demonstrated their cerebral colonization behavior8. However, this method is very laborious, costly and technically complex. In addition, these kinds of animal experiments are restricted to small series and come with a substantial stress for the animals (by implantation of the glass plate, injection of tumor cells, repetitive anaesthesia and long-term fixation). Furthermore, in vivo imaging is thus far limited to the visualization of the carcinoma cells, whereas interactions with resident cells have not yet been illustrated. Finally, investigations of human carcinoma cells within immunocompetent animals are impossible8.
For these reasons, we established a coculture system consisting of an organotypic mouse brain slice and epithelial cells embedded in matrigel (3D cell sphere). The 3D carcinoma cell spheres were placed directly next to the brain slice edge in order to investigate the invasion of the neighboring brain tissue. This enables us to visualize morphological changes and interactions between the glial cells and carcinoma cells by fluorescence and even by bright field microscopy. After the coculture experiment, the brain tissue or the 3D cell spheroids can be collected and used for further molecular analyses (e.g. qRT-PCR, IHC, or immunoblot) as well as for investigations by confocal microscopy. This method can be applied to monitor the events within a living brain tissue for days without deleterious effects to the brain slices. The model also allows selective suppression and replacement of resident cells by cells from a donor tissue to determine the distinct impact of a given genotype. Finally, the coculture model is a practicable alternative to in vivo approaches when testing targeted pharmacological manipulations.

The organotypic brain slice coculture with carcinoma cells enables visualizing morphological changes by fluorescence as well as bright field (video) microscopy during the process of carcinoma cell invasion of brain tissue. This model system also allows for cell exchange and replenishment approaches and offers a wide variety of manipulations and analyses.

Co-Kultur-System mit einer Scheibe Organotypische Gehirn-und 3D-Sphäroid von Karzinomzellen

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

Quantifizierung der Brustkrebs-Zelle Invasivität Mit einem Drei-dimensionale (3D) Modell

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

Beurteilung von Eierstockkrebs Sphäroid Bindung und Invasion von Mesothelzellen in Echtzeit

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal cells. The tumor microenvironment is comprised of a variety of cell types, such as fibroblasts, immune cells, vascular endothelial cells, pericytes and bone-marrow-derived cells, embedded in the extracellular matrix (ECM). Cancer-associated fibroblasts (CAFs) have a pro-tumorigenic role through the secretion of soluble factors, angiogenesis and ECM remodeling. The experimental models for cancer cell survival, proliferation, migration, and invasion have mostly relied on two-dimensional monocellular and monolayer tissue cultures or Boyden chamber assays. However, these experiments do not precisely reflect the physiological or pathological conditions in a diseased organ. To gain a better understanding of tumor stromal or tumor matrix interactions, multicellular and three-dimensional cultures provide more powerful tools for investigating intercellular communication and ECM-dependent modulation of cancer cell behavior. As a platform for this type of study, we present an experimental model in which cancer cells are cultured on collagen gels embedded with primary cultures of CAFs.

Here we present a protocol to co-culture in three-dimensions, which is useful for investigating multicellular interactions and extracellular matrix-dependent modulation of cancer cell behavior. In this experimental model, cancer cells are cultured on collagen gels embedded with human cancer-associated fibroblasts.

Dreidimensionale Co-Kultur-Modell für Tumor-Stroma-Interaktion

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.

This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.

Eine Krebszelle Spheroid Assay zur Invasion in einem 3D-Rahmen Beurteilen

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential.  Most traditional assays, however, do not examine these ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

Dreidimensionale Alginat-Perle Kultur der Menschen Hypophysenadenom Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells often generates unwanted artifacts. Therefore, cell culture in a three-dimensional (3D) environment, often using extracellular matrix components, emerged as an interesting alternative due to its close similarity to the native in vivo tissue or organ. We developed a 3D cell culture system using two compartments, namely (i) a central compartment containing cancer cells embedded in a collagen gel acting as a pseudo-primary macrospherical tumor and (ii) a peripheral cell-free compartment made of a fibrin gel, i.e. an extracellular matrix component different from that used in the center, in which cancer cells can migrate (invasion front) and/or form microspherical tumors representing secondary or satellite tumors. The formation of satellite tumors in the peripheral compartment is remarkably correlated to the known aggressiveness or metastatic origin of the native tumor cells, which makes this 3D culture system unique. This cell culture approach might be considered to assess cancer cell invasiveness and motility, cell-extracellular matrix interactions and as a method to evaluate anti-cancer drug properties.

Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

Dreidimensionale Kulturtest auf Krebszelle Invasivität und Satelliten Tumorbildung erkunden

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

Three-Dimensional Printing of a Complex Aortic Anomaly

Complex congenital aortic anomalies include diverse types of malformations that may be clinically asymptomatic or present with respiratory or esophageal symptoms. These anomalies may be associated with other congenital heart diseases. It is hard to identify the accurate anatomic vessel location from two-dimensional imaging data, such as computed tomography. As an additive manufacturing method, three-dimensional (3-D) printing can covert the acquired imaging data into 3-D physical models. This protocol describes the procedure for modeling the volumetric DICOM imaging into 3-D data and printing it as an anatomically realistic 3-D model. Using this model, surgeons can identify the vessel location of complex aortic anomalies, which is helpful for pre-operative planning and intra-operative guidance.

Here, we present a protocol to use three dimensional printed models for pre-operative planning and intra-operative reorganization of complicated vascular locations when handling a congenital aortic anomaly.

Drei-dimensionale Druck einer komplexen Aorten Anomalie

Complex congenital aortic anomalies include diverse types of malformations that may be clinically asymptomatic or present with respiratory or esophageal ...