Beschaffung von zuvor vorbereiteten menschlichen Magenorganoiden für die Erstellung von pH-Profilen. Verbinden Sie zunächst die Referenzelektrode über den Stecker mit dem pH-Elektrodenkabel. Verbinden Sie dann die Mikroelektrode mit dem Verstärker und den Verstärker mit einem geerdeten PC mit der Software per USB-Kabel.
Legen Sie die Mikroelektrode und die Referenzelektrode in entionisiertes Wasser, um beide Spitzen mindestens einen Zentimeter in die Flüssigkeit einzutauchen. Füllen Sie konische 50-Milliliter-Röhrchen mit den gewünschten Kalibrierpuffern. Tupfen Sie den Schutzschlauch zusammen mit der Referenzelektrode vorsichtig mit einem feinen Labortuch ab.
Wählen Sie nach dem Öffnen der Software auf der Registerkarte Kalibrierung das Feld Y-Zoom aus und stellen Sie dann den Sensorsignalwert auf Millivolt ein. Ausgehend von den Elektroden im pH 4,01 Puffer geben Sie als bekannten pH-Wert 4,01 ein. Wählen Sie Punkt hinzufügen, sobald sich der Millivolt-Messwert stabilisiert hat, und legen Sie dann beide Elektroden wieder in entionisiertes Wasser, um sie zu spülen.
Nachdem Sie den Vorgang für den pH-Puffer von 9,21 wiederholt haben, klicken Sie auf Punkt hinzufügen, wenn das Signal bei etwa 83 Millivolt stabil ist. Prüfen Sie, ob die Mikroelektroden linear zwischen pH 4,01 und 9,21 reagieren, um eine Zweipunkt-Kalibrierkurve zu erhalten. Legen Sie das Schutzgehäuse vorsichtig flach auf die Bank und ziehen Sie das Gehäuse mit einer schnellen, schnellen Bewegung ab, um die Mikroelektrode zu entfernen.
Montieren Sie die Mikroelektrode auf einem Mikromanipulator und ordnen Sie das Stereoskop und den Mikromanipulator so an, dass die Mikroelektrode frei in Richtung der Kulturschale vorgeschoben werden kann. Positionieren Sie die Kulturschale mit den Organoiden für die Profilerstellung. Befestigen Sie die Referenzelektrode leicht an der Klemme am Ringstativ links vom Stereoskop.
Schieben Sie die Spitze der Mikroelektrode visuell vor, bis sie ausreichend in das Medium eingetaucht ist. Sobald sich das Signal stabilisiert hat, zeichnen Sie drei pH-Messwerte des Mediums auf. Schieben Sie dann die Mikroelektrode langsam in die EZM ein, ohne Organoide zu berühren.
Notieren Sie mindestens drei pH-Messwerte, um den Durchschnitt zu berechnen. Positionieren Sie die Mikroelektrode entlang der senkrechten Achse zur Organoidoberfläche, wobei Sie vorsichtig eine kleine Vertiefung auf der basolateralen Organoidoberfläche vornehmen, ohne sie zu durchdringen. Schieben Sie die Mikroelektrode vorsichtig in das Organoid ein und messen Sie den luminalen pH-Wert.
Fahren Sie nach Abschluss mit der Messung des pH-Werts für das nächste Organoid fort. Setzen Sie die zu reinigende Elektrode wieder in ihr Schutzrohr ein. Spülen Sie die Elektrode nacheinander mit entionisiertem Wasser, Ethanol und Puffer.
Die Referenzelektrode wird in ein Becherglas gelegt, das mit einer dreimolaren Kaliumchloridlösung gefüllt ist. Füllen Sie eine zwei Mikroliter Glaskapillare mit sterilem Mineralöl auf und laden Sie sie auf einen mikromanipulatorgesteuerten Nanoliter-Autoinjektor. Füllen Sie es schließlich mit einer Lösung, die 0,02 % Methylrot und 150 Millimolare Salzsäure enthält, und führen Sie die Injektion mit 9,2 Nanolitern der Lösung durch.
Die Variation des luminalen pH-Werts bei 10 Organoiden auf derselben Kulturplatte war minimal, wobei die Messungen durchweg bei 8,16 lagen. Der intraluminale pH-Wert über fünf verschiedene Organoidlinien war innerhalb jeder Kultur konsistent, aber es wurde eine signifikante Variabilität zwischen den Organoidlinien beobachtet. Der organoide luminale pH-Wert war durchweg niedriger als der der ECM, was wiederum niedriger war als der pH-Wert des Mediums, was darauf hindeutet, dass der luminale pH-Wert physiologisch relevant ist und nicht ausschließlich von der umgebenden Kulturumgebung bestimmt wird.
Die Injektion von Methylrot in das Organoidlumen bestätigte, dass es einen pH-Wert von mehr als 6,2 hatte, was mit den Mikroelektrodenmessungen übereinstimmte, die einen nahezu neutralen pH-Wert zeigten.
