Bereiten Sie zunächst eine Beschichtungslösung her, die eine wachstumsfaktorreduzierte Basalmembranmatrix und Organoid-Kulturmedium im Verhältnis von eins zu zwei enthält. Geben Sie 115 Mikroliter der Beschichtungslösung in jede Vertiefung einer 48-Well-Platte und stellen Sie die Platte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einen befeuchteten Inkubator. Für die Kollagen-Methode geben Sie einen Milliliter Kollagengel in eine 30 Millimeter große innere Membraneinlage und lassen es 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator erstarren.
Um das Zellgemisch zu gewinnen, waschen Sie das frisch resezierte Melanomgewebe in einer 10 Milliliter Petrischale mit Waschmedium, die über Eis gelegt wird. Übertragen Sie den Tumor mit einer sterilen Pinzette in eine zweite Schale mit Waschmedium für die nächste Waschung auf Eis. Während der drei Spülgänge mit einer sterilen Schere und einer Klinge überschüssiges Bindegewebe, Fett und Blutreste entfernen.
Legen Sie den Tumor in eine leere Petrischale und hacken Sie ihn mit sterilen Klingen fein. Anschließend wird das Hackfleisch in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen überführt, das 10 Milliliter des vorbereiteten Aufschlussmediums enthält. Legen Sie den Konus in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius und wirbeln Sie ihn alle fünf Minuten auf.
Nach 25 Minuten fügen Sie 30 Milliliter des ADMEM/F12-Mediums mit 10 % FBS hinzu, um die Verdauung zu stoppen. Filtrieren Sie anschließend die verdaute Zellsuspension durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb aus Nylon und spülen Sie das Sieb mit zugesetztem ADMEM/F12. Entnehmen Sie mit einer Pipette alle verbleibenden Medien am Boden des Filters.
Anschließend pelletieren Sie die Zellen bei 300 x g für sieben Minuten bei vier Grad Celsius. Nachdem der Überstand verworfen wurde, suspendieren Sie das Pellet wieder im Organoid-Nährmedium. Für die Kultivierung werden 200.000 Zellen in den mit Matrigel beschichteten Vertiefungen aus der Vorkriegszeit ausgesät, die mit 200 Mikrolitern Organoid-Kulturmedium ergänzt werden.
Alternativ säen Sie 1 Million Zellen, gemischt mit einem Milliliter Kollagengel, auf dem vorverfestigten Kollagengel-Membraneinsatz, der in einer Sechs-Well-Platte platziert ist, und geben Sie das Organoid-Kulturmedium in die Vertiefung. Für die Passage von Organoiden von 150 bis 200 Mikrometern werden sie in einen 15-Milliliter-Kegel überführt und mit Dulbecco's PBS gewaschen. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 300 x g für sieben Minuten bei vier Grad Celsius.
Nach Entfernen des Überstands die Organoide mit Trypsinersatz inkubieren und alle drei Minuten mischen. Um die Verdauung zu stoppen, fügen Sie ADMEM/F12 mit reduziertem Serummedium mit 10% FBS hinzu. Die Mischung wird sieben Minuten lang bei 300 x g zentrifugiert und der Gaumen im Organoid-Nährmedium resuspendiert.
Zum Schluss säen Sie die einzellige Suspension in eine neue Matrigel- oder Kollagen-beschichtete Vertiefung bei der gleichen anfänglichen Aussaatdichte für die Inkubation. Mikroskopische Aufnahmen der Organoide in der späten Matrigelphase am zweiten und siebten Tag zeigten, dass die Größe der Organoide allmählich zunahm. Darüber hinaus gab es keinen statistisch signifikanten Unterschied im Alpha-Beta-T-Zell-Verhältnis zwischen den elterlichen Tumoren und den jeweiligen Organoiden, die entweder in Matrigel oder Kollagen kultiviert wurden.
