Patienten-Drive-Organoid-Modelle repräsentieren genetisch und funktionell ihre Muttertumoren und sind daher zuverlässige Modelle für die Untersuchung neuartiger Therapeutika und komplexer biologischer Prozesse bei Eierstockkrebs. Durch die Rekapitulation der klonalen Heterogenität, der Tumormikroumgebung und der In-vitro-Zell-zu-Zell-Interaktionen überwinden diese Modelle die Einschränkungen von Krebszelllinien und von Patienten stammenden Xenotransplantaten. Von Patienten abgeleitete Organoide bieten langfristige Expansions- und Speichermöglichkeiten und ahmen die Tumorphysiologie nach.
Daher sind sie ideale Modelle für die Untersuchung neuartiger Therapeutika und prädiktiver Biomarker. Beginnen Sie mit der Ernte der Organoide, indem Sie die Tumorproben in eine 10-Zentimeter-Gewebekulturschale geben und das Gewebe mit einem Einwegskalpell zu einer homogenen Mischung zerkleinern. Legen Sie die homogene Gewebemischung mit einer Pinzette in ein Dissoziationsröhrchen.
Für jeweils ein bis zwei Milliliter homogenisiertes Gewebe fügen Sie sieben bis acht Milliliter eines Milligramms pro Milliliter Kollagenaselösung vom Typ zwei in organoidem Basismedium und einen Milliliter DNase One-Lösung hinzu. Wirbeln Sie die Lösung bei 458 G.Verflüssigen Sie das Gewebe, während es sich in der Kollagenase-Lösung befindet, mit der Dissoziationsmaschine. Führen Sie das Programm 37 C Unterstrich H Unterstrich TDK drei eine Stunde lang aus, bis es sich um eine Einzelzellsuspension handelt.
Wenn Sie fertig sind, geben Sie die homogenisierte Mischung in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie 20 bis 40 Milliliter organoides Basismedium hinzu und wirbeln Sie die Lösung bei 458 G.Dann filtrieren Sie die Lösung durch ein 100-Mikrometer-Zellsieb in ein neu beschriftetes konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Anschließend wird die filtrierte Mischung bei 1.650 G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugiert und der Überstand mit einer Weidepipette aus Glas abgesaugt.
Bereiten Sie 100 Mikrogramm pro Milliliter Dnase One vor und resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter Dnase One-Lösung, indem Sie tropfenweise DNase One-Lösung hinzufügen. Nach 15 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur 25 Milliliter organoides Basismedium in die Zellen geben und umdrehen, um sich zu vermischen. Zentrifugieren Sie dann die Zellen bei 1.650 G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius und saugen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Glasweidepipette ab.
Resuspendieren Sie das neu gebildete Zellpellet in fünf Millilitern vorgewärmten roten Blutkörperchen oder Erythrozyten-Lysepuffer. Die Lösungen in jedem konischen Röhrchen bei 458 G wirbeln und fünf Minuten inkubieren. Das in Erythrozyten-Lysepuffer suspendierte Pellet wird erneut zentrifugiert und der Überstand mit einer Weidepipette aus Glas abgesaugt.
Waschen Sie das Pellet mit 10 Milliliter PBS und wirbeln Sie die Zellen vor dem Zentrifugieren der Zellen. Für ein großzelliges Pellet saugen Sie das PBS ab und geben Sie einen Milliliter des organoiden Basismediums auf das Pellet. Nach dem Vortexen der Lösung werden 300 bis 400 Mikroliter der Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
Nach fünfminütiger Zentrifugation wird der Überstand abgesaugt und mit kalten Spitzen in Basalmembranextrakt (BME) und organoidem Basismedium resuspendiert. Die resuspendierte Zelllösung wird in eine Platte mit sechs Vertiefungen in 40-Mikroliter-Aliquoten gefüllt. Platten mit bis zu fünf Aliquoten pro Vertiefung.
Legen Sie die Well-Platte sofort für 20 Minuten in den Inkubator und geben Sie nach der Inkubation vorsichtig zwei Milliliter des gesamten organoiden Mediums in jede Vertiefung. Geben Sie einen Milliliter Organoid-Basismedium in jede Vertiefung und pipettieren Sie das Medium zur Dissoziation direkt auf die Organoid-Tabs. Sammeln Sie das gesamte Medium, das die resuspendierten Pellets enthält, in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen.
Zentrifugieren Sie dann das konische 15-Milliliter-Röhrchen mit der Mischung fünf Minuten lang, bevor Sie den Überstand absaugen. Fügen Sie dem Zellpellet einen Milliliter freies rekombinantes Enzym tierischen Ursprungs hinzu. Durch Vortexen mischen und die Suspension in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen.
Nach 15 Minuten Inkubation in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius und fünf Minuten Zentrifugation den Überstand absaugen. Resuspendieren Sie das Pellet in BME und organoidem Basismedium und füllen Sie die resuspendierte Zelllösung in eine Sechs-Well-Platte in 40-Mikroliter-Aliquots. Platten mit bis zu fünf Aliquoten pro Vertiefung.
Geben Sie nach 20 Minuten Inkubation vorsichtig zwei Milliliter des gesamten organoiden Mediums in jede Vertiefung. Resuspendieren Sie das Passage-Organoid-Zellpellet in 0,5 bis einem Milliliter Recovery Cell Culture Freezing Medium und geben Sie einen Milliliter in jedes Kryofläschchen, bevor Sie es zur Langzeitlagerung auf minus 80 Grad und Flüssigstickstofftank überführen. Tauen Sie die Organoide auf, indem Sie die in flüssigem Stickstoff gelagerten Kryofläschchen in ein 37 Grad Celsius warmes Wasserbad überführen.
Nach dem Auftauen werden die Organoide in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt und zentrifugiert, bevor der Überstand abgesaugt wird. Als nächstes geben Sie einen Milliliter PBS in das Pellet und überführen das resuspendierte Pellet in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Nach der Zentrifugation bei 1.650 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius saugen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Glasweidepipette ab. Resuspendieren Sie das Pellet in BME und organoidem Basismedium und plattieren Sie die resuspendierten Zellen in 40-Mikroliter-Aliquoten auf eine Platte mit sechs Vertiefungen.
Platzieren Sie bis zu fünf Aliquote pro Vertiefung. Legen Sie die Platte sofort für 20 Minuten in den Inkubator, bevor Sie zwei Milliliter vollständiges organoides Medium in die Vertiefungen geben. Organoide wurden über 10 Tage etabliert, danach zeigten sie diskrete Organoide in Kultur.
Von Patienten stammende Organoidkulturen wurden bewertet, indem sie in Agarose eingebettet und mit Hämatoxylin- und Eosinfärbung bewertet wurden. Es ist wichtig, die Herausforderungen der Zusammenarbeit mit BME zu berücksichtigen. Die Resuspension des Zellpellets und des BME muss auf Eis erfolgen, um sicherzustellen, dass sich dabei keine Blasen bilden.
Diese Technik ermöglicht weitere Untersuchungen zu den Auswirkungen der Chemotherapie auf die Erzeugung und Entwicklung von Organoiden aufgrund der Probleme, mit denen Patienten konfrontiert sind, die sich einer neoadjuvanten Chemotherapie unterzogen haben.
