Humane Organoide sind dreidimensionale In-vitro-Modellsysteme, die sowohl die Patientenvielfalt als auch die zelluläre Heterogenität der Tumoren repräsentieren. Dieses Protokoll und die Videodemonstration bieten eine detaillierte, praktische Anleitung zur Feststellung von Brusttumoren und normalen Organoiden. Von Patientinnen abgeleitete Brusttumor-Organoide sind aufregende neue Modelle, aber schwer zu etablieren.
Das umfassende Protokoll, das wir hier zur Verfügung stellen, soll dazu beitragen, die Forscher, die versuchen, Brustorganoide zu entwickeln, vorzubereiten und sie mit den zu erwartenden Herausforderungen vertraut zu machen. Jede PDO-Linie, die von einem anderen Patienten stammt, ist in Morphologie und Wachstumsrate einzigartig. Im Gegensatz zu zwei 2D-Zellliniensystemen wachsen Organoide besser, wenn sie mit einer hohen Dichte plattiert werden, was bessere interzelluläre Interaktionen ermöglicht.
Das Verfahren wird von Disha Aggarwal, einer Doktorandin in meinem Labor, demonstriert. Tauen Sie zunächst eine Flasche Basalmembranmatrix auf Eis oder über Nacht bei vier Grad Celsius auf. Übertragen Sie das resezierte Gewebe in eine 10 Zentimeter sterile Petrischale.
Untersuchen Sie das Gewebe makroskopisch und notieren Sie sich, ob es morphologisch fettig, vaskularisiert oder nekrotisch erscheint. Notieren Sie außerdem die Größe und Form des Gewebes und machen Sie ein Foto des Gewebes mit einem Lineal im Blick. Hacken Sie das Gewebe mit einem sterilen Skalpell Nummer 10 in kleine Stücke und geben Sie es in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen.
Fügen Sie 10 Milliliter von zwei Milligramm pro Milliliter Kollagenase-IV-Lösung hinzu und verschließen Sie das Röhrchen. Legen Sie das Röhrchen bei 37 Grad Celsius bei 140 U/min für 30 bis 90 Minuten in einem 30-Grad-Winkel auf einen Orbitalschüttler. Während der Inkubation wird ein Aliquot des vollständigen Mediums zum Vorwärmen bei 37 Grad Celsius in ein Perlen- oder Wasserbad gegeben.
Resuspendieren Sie das Gewebe alle 15 Minuten, indem Sie es mit einer sterilen, vorbeschichteten serologischen Pipette von fünf Millilitern kräftig auf und ab mischen. Überwachung der Dissoziation über die Zeit durch Beobachtung des Tubus unter dem Mikroskop bei einer 5-fachen oder höheren Vergrößerung. Sobald das Gewebe dissoziiert ist, zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 400 G, saugen Sie den Überstand ab und fügen Sie 10 Milliliter AdDF+Again hinzu, zentrifugieren Sie und saugen Sie den Überstand vorsichtig ab, da Gewebepellets gelegentlich lose sein können.
Wenn das Gewebepellet teilweise rot ist, fügen Sie zwei Milliliter Puffer zur Lyse der roten Blutkörperchen hinzu und inkubieren Sie es fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation 10 Milliliter AdDF+ in das Röhrchen geben, fünf Minuten bei 400 G zentrifugieren und den Überstand entsorgen. Das Pellet wird in 50 bis 300 Mikrolitern unverdünnter kalter Kellermembranmatrix resuspendiert und durch sorgfältiges Pipettieren gemischt, um Blasenbildung zu vermeiden.
Unter Verwendung einer Gewebekulturplatte mit sechs Wells, die über Nacht im Inkubator vorgewärmt wird, werden 300 Mikroliter der Basalmembranmatrixkuppel mit Organoiden in jede Vertiefung geschüttet. Lassen Sie die Platte fünf Minuten lang ungestört in der Haube, bevor Sie sie 20 bis 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius platzieren, damit sich die Kuppel der Basalmembranmatrix vollständig verfestigen kann. Am Ende der Inkubation drei Milliliter vorgewärmtes Komplettmedium in jede Vertiefung geben und bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren.
Nehmen Sie nach der Inkubation Bilder der Organoide mit einem 5X-Objektiv auf einem inversen Hellfeldmikroskop auf. Heben Sie die Basalmembranmatrixkuppel mit einem Zellschaber oder einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze in das Medium im Well. Übertragen Sie mit einer vorbeschichteten Pipettenspitze die schwimmende Kuppel der Organoide mit Medium in ein konisches 15- oder 50-Milliliter-Röhrchen, je nach Anzahl der geernteten Wells.
Fügen Sie dann DPBS hinzu, um das Volumen auf mindestens fünf Milliliter zu erhöhen. Drehen Sie die Röhrchen fünf Minuten lang bei 400 g. Die Basalmembranmatrix mit Organoiden bildet am Boden eine Schicht.
Nach dem Absaugen des Überstands werden 5 bis 20 Milliliter DPBS hinzugefügt, abhängig von der Anzahl der Vertiefungen, die sich in einem Röhrchen befinden. Mischen Sie das organoide Basalmembranmatrix-Pellet in DBPS mit einer vorbeschichteten sterilen Einwegpipette. Zentrifugieren Sie erneut und entsorgen Sie den Überstand.
Fügen Sie mit einer beschichteten Pipettenspitze ein Zelldissoziationsreagenz mit dem dreifachen Volumen der Basalmembranmatrix hinzu und resuspendieren Sie die Organoide. Legen Sie das Röhrchen bei 37 Grad Celsius bei 140 U/min für 8 bis 15 Minuten in abgewinkelter Position auf einen Orbitalschüttler. Überwachen Sie das Röhrchen, indem Sie es alle fünf Minuten unter dem Mikroskop beobachten, um sicherzustellen, dass die Organoide in kleinere Cluster zerlegt werden.
Fügen Sie AdDF+ in einem Volumen hinzu, das gleich oder größer als das Zelldissoziationsreagenz ist, und pipettieren Sie, um die Organoide zu mischen. Fünf Minuten lang bei 400 g schleudern, um ein Organoid-Pellet zu erhalten. Sobald ein weißes Organoid-Pellet ohne ungelöste Basalmembranmatrix erhalten wurde, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter AdDF+Füllen Sie das Volumen mit AdDF+Schleudern Sie das Röhrchen für den Waschschritt auf 10 Milliliter und entsorgen Sie den Überstand.
Fügen Sie den verdauten Organoiden die erforderliche Menge an Basalmembranmatrix hinzu, basierend auf dem entsprechenden Spaltverhältnis. Mischen Sie durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren, um Blasen zu vermeiden, und legen Sie es sofort auf Eis. Platte 300-Mikroliter-Kuppeln aus Organoiden, die in einer Basalmembranmatrix in einer vorgewärmten Sechs-Well-Platte resuspendiert wurden.
Lassen Sie die Platte fünf Minuten lang ungestört in der Haube, bevor Sie sie 20 bis 30 Minuten lang auf 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid stellen, damit sich die Kuppeln verfestigen. Am Ende der Inkubation geben Sie drei Milliliter vorgewärmtes Fertigmedium in jede Vertiefung und stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator. Fügen Sie alle fünf bis sieben Tage frisches komplettes Medium hinzu.
Die verschiedenen patienteneigenen Brusttumor-Organoidlinien unterscheiden sich in Morphologie und Wachstumsrate. Die normalen Brustorganoide und die wenigen frühen duktalen Karzinome in C2-abgeleiteten Organoiden ähnelten der normalen Bruststruktur mit einem zentralen Lumen, das von duktalen Zellen umgeben war. Organoide, die aus invasiven lobulären Karzinomen stammen, neigen dazu, lose anhaftende traubenartige Strukturen zu bilden.
Währenddessen neigen Organoide, die aus invasiven duktalen Karzinomen stammen, dazu, dichte, große und runde Organoide zu bilden. Das Wachstum der Organoide wurde an den Tagen drei, sechs, neun und 12 mit einem Lumineszenz-Zellviabilitätstest gemessen, wobei am ersten Tag nach der Beschichtung ein Ausgangswert gemessen wurde. Die Hellfeldbilder der gleichen Organoide, die sich im Laufe der Zeit vergrößert haben, sind hier zu sehen.
Einige von Patienten stammende Organoidlinien haben eine Verdopplungszeit von zwei Tagen, während andere fünf Tage benötigen. Es ist wichtig, geduldig mit bestimmten Organoidlinien zu sein, die sich nur langsam etablieren. Unserer Erfahrung nach fördert eine Erhöhung der Beschichtungsdichte oder das Herausfiltern von Ablagerungen das Wachstum von g.U.
Patientenabgeleitete Organoide (PDOs) sind hervorragende Modelle für das Screening von Arzneimitteln. Sie modellieren Zell-Zell- sowie Zell-extrazelluläre Matrix-Interaktionen, die für die Erforschung der Pathophysiologie von Krebs von entscheidender Bedeutung sind. Darüber hinaus können PDOs einer genetischen Manipulation unterzogen und zur Entwicklung von Xenotransplantaten in Kokultursystemen verwendet werden, was sie zu großartigen Modellen für mechanistische Studien macht.
