הביובנק של NSW Health Statewide מודה בהכרת תודה על תמיכתם של NSW Health Pathology, משרד הבריאות והמחקר הרפואי של NSW ומחוז הבריאות המקומי של סידני. בנוסף, המחברים מודים בהכרת תודה לאומיקו ולמחקרים אחרים הנתמכים על ידי NSW Health Statewide Biobank על מתן רשות לפרסם נתונים שנוצרו בתוך החברה ולהשתמש בדגימות שאינן בשימוש למטרות מחקר. המחברים מודים לפרופסור ג'ניפר בריין (NSW Health Pathology, אוניברסיטת סידני) על מנהיגות ביקורתית ודיונים. איור 1 נוצר באמצעות BioRender.com.

דגימות דם של בקרת איכות ונתונים שנוצרו בתוך החברה (כגון ספירת תאים, כדאיות וגיל הדגימה בעת העיבוד) התקבלו ממחקרים מוסכמים ב- NSW Health Statewide Biobank, Royal Prince Alfred Hospital (אישור HREC: 2019/ETH06776). דגימות דם אנושיות בוגרות מעובדות (כלומר, מרוקנות פלזמה), לא מסומנות ולא מזוהות נאספו בצינורות EDTA. דגימות דם אלה של בקרת איכות עובדו פחות מ-72 שעות לאחר האיסוף, ושימשו לניסויי בידוד PBMC שהשוו בין שיפוע הצפיפות לבין שיטות מבוססות חרוזים. לשיטת ההפרדה של שיפוע הצפיפות המשמשת בתוצאות המייצגות, עיין בהליך בקובץ משלים 1. פרטי הריאגנטים והציוד ששימש למחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.
1. הכנת דם מלא
<ol><li>יש להפוך בעדינות 10 מ"ל צינוריות דם שלמות (מצופות בחומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית [EDTA], חומצה-ציטראט-דקסטרוז [ACD] או ליתיום הפרין) 10 פעמים בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>אופציונלי: אם יש לאחסן דם שלם, aliquot לתוך cryotubes לאחסון -80 °C.</li>
	<li>צנטריפוגה את הצינורות באמצעות רוטור דלי מתנדנד ב 800 x גרם במשך 10 דקות ב 22 ° C עם הבלם מופעל (9 תאוצה / 9 האטה).</li>
</ol>2. קולקציית מעילי באפי
<ol><li>לאחר הצנטריפוגה, הניחו את הדגימות בארון בטיחות ביולוגי ובדקו את שלוש השכבות השונות (כפי שמוצג באיור 1). הערה: RBCs נמצאים בשכבה האדומה כהה התחתונה של צינור הצנטריפוגה. שכבה לבנה אטומה המכילה תאי דם לבנים וטסיות נמצאת מעל שכבת RBC, המכונה מעיל באפי. השכבה הצהובה העליונה מכילה פלזמה.</li>
	<li>אופציונלי: אם יש לאחסן פלזמה, aliquot פלזמה לתוך cryotubes עבור -80 °C אחסון.</li>
	<li>פיפטה 1 מ"ל של מעיל באפי (חומר מוצא) מצינורית דם של 10 מ"ל והעברה לצינור שצוין ומסומן בשלב 3.1 ושלב 4.1 עבור השיטות הידניות והאוטומטיות, בהתאמה. מערבלים את הפרווה הבאפית (שכבה לבנה אטומה) בעזרת קצה הפיפטה, ואוספים את הפרווה הבאפית על ידי שאיפה. הערה: פחות מ -100 μL של פלזמה ו- RBCs מקובלים במהלך שאיפה. אם נאספים צינורות דם מרובים עבור משתתף אחד, ניתן לאגד מעילי באפי; עם זאת, זה עשוי להשפיע על ריכוז טסיות13.</li>
	<li>לעיבוד ידני, המשך לסעיף 3. לעיבוד אוטומטי, המשך לסעיף 4.</li>
	<li>אופציונלי: אם RBCs רוצים להיות מאוחסנים, aliquot RBCs לתוך cryotubes עבור אחסון -80 °C.</li>
</ol>3. טיהור PBMC - שיטה ידנית
הערה: ניתן לעבד עד 8 דגימות לכל מחזיק מגנט על ידי מפעיל יחיד.
<ol><li>תווית 3 x 5 מ"ל צינורות פוליסטירן עם אותיות A-C. הערה: השתמש במספור רציף אם אתה מבצע יותר מדגימה אחת, כלומר, 1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 2C.</li>
	<li>הוסף 60 μL של 0.1 M EDTA (לריכוז EDTA סופי של 6 mM, pH 8.0, ראה קובץ משלים 2 למתכון) לצינור A המכיל את המעיל האפי שהועבר בשלב 2.3.</li>
	<li>מוסיפים 50 μL של צינור תערובת הקוקטיילים (ראו טבלת חומרים) לצינור A, מערבבים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה לפחות 3 פעמים, ודגרים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הוסף 890 μL של PBS לצינור A וערבב על ידי pipeting למעלה ולמטה לפחות 3 פעמים.</li>
	<li>מערבלים את צינור החרוז המגנטי (ראו טבלת חומרים) למשך 30 שניות.</li>
	<li>הוסף 50 μL של חרוזים מגנטיים לצינור A וערבב על ידי pipeting למעלה ולמטה לפחות 3 פעמים.</li>
	<li>הכניסו מיד את צינור A למעמד המגנט ודגרו במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הכניסו בזהירות את תרחיף התא המועשר לתוך צינור B, ואספו את החלק השקוף עם RBCs ללא / מינימלי (<100 μL) להתאוששות PBMC אופטימלית. הערה: אין להפריע לחרוזים הקשורים למגנט. פיפטה העברה מומלצת.</li>
	<li>הסר את צינור A ממעמד המגנט והשליך.</li>
	<li>הוסף 50 μL חרוזים מגנטיים לתרחיף התא בצינור B וערבב על ידי pipeting למעלה ולמטה לפחות 3 פעמים.</li>
	<li>הכניסו מיד את צינור B למעמד המגנט ודגרו במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>בזהירות pipete התא מועשר תרחיף לתוך צינור C, לאסוף רק את החלק הברור. הערה: אין להפריע לחרוזים הקשורים למגנט. פיפטה העברה מומלצת.</li>
	<li>הסירו את צינור B ממעמד המגנט והשליכו אותו.</li>
	<li>הכניסו מיד את צינור C למעמד המגנט ודגרו במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>יש להכניס בזהירות את מתלה התאים המועשר לצינור צנטריפוגה מסומן ולמלא עד 2 מ"ל עם PBS.</li>
	<li>מעבירים 50 μL של תרחיף התא לכוס דגימה של מונה התאים האוטומטי. לספירת תאי דילול ביחס של 1:10, יש להוסיף 450 μL של PBS. המשך לסעיף 5 לשלבי ספירת תאים.</li>
</ol>4. טיהור PBMC - שיטה אוטומטית
הערה: ניתן לעבד עד 4 דגימות באמצעות מכשיר PBMC אוטומטי יחיד. מכשירים מרובים יכולים להיות מופעלים במקביל על ידי מפעיל יחיד.
<ol><li>תווית 2 x 14 מ"ל צינורות עם אותיות A ו- B, 1 x 50 מ"ל צינור צנטריפוגה עם האות C, וצינור צנטריפוגה 1 x 50 מ"ל עם "פסולת". הערה: מיכל פסולת אחד בלבד נדרש עבור כל הפעלה במכשיר PBMC אוטומטי. השתמש במספור רציף אם אתה מבצע יותר מדגימה אחת, כלומר 1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 2C.</li>
	<li>הוסף 60 μL של 0.1 M EDTA (לריכוז EDTA סופי של 6 mM) לצינור A המכיל את המעיל האפי המועבר בשלב 2.3.</li>
	<li>מערבלים את צינור החרוז המגנטי (ראו טבלת חומרים)  למשך 30 שניות.</li>
	<li>הפעל את מכשיר ה- PBMC האוטומטי על-ידי הפעלת החשמל בקדמת המכשיר.</li>
	<li>במסך הבית של מכשיר PBMC אוטומטי, בחר פרופיל ובחר את הפרוטוקול הרצוי. הערה: EasySep בידוד PBMC אנושי ישיר 19654 - מעיל באפי היה פרופיל הפרוטוקול שנבחר עבור בידוד PBMC זה. ראה את הנוהל הסטנדרטי של היצרן עבור פרופיל זה בדוח פרוטוקול14.</li>
	<li>הזן את עוצמת הקול ההתחלתית (כמות המעיל האפי שנשאף לתוך צינור A), וחזור על הפעולה עבור כל דגימה.</li>
	<li>בחר את כל הרבעים שישתמשו באותה ערכת מגיבים. הערה: אם אותו פרוטוקול משמש עבור יותר מרביע אחד, מכשיר ה- PBMC האוטומטי יציע להשתמש באותה ערכת מגיב עבור כל הרבעים14.</li>
	<li>טען את קרוסלת המכשיר עם חומרים מתכלים מסומנים, קצוות סינון ומיכל חיץ. ערכת המגיב המכילה את צינור החרוז המגנטי ואת צינור תערובת הקוקטיילים יוטענו לרביע 1. הערה: המכשיר ישאל אם המשתמש מעוניין להשתמש בערכת מגיב 1 עבור כל הרבעים. בחר 'כן' וסמן את כל הרבעים באמצעות ערכת המגיב.</li>
	<li>לאחר השלמת הטעינה, הסר מכסים מחומרים מתכלים וריאגנטים ובחר הפעל במסך המכשיר.</li>
	<li>בסיום הריצה, בחר בטל פריקה והסר דגימות (המכילות מתלה PBMC המסומן בצינור C) מהקרוסלה של המכשיר. אחסנו את צינור החרוזים המגנטי, צינור תערובת הקוקטיילים ומיכל החיץ בטמפרטורה של 4°C. השליכו שפופרות המסומנות כ-A, B ופסולת (ראו שלב 4.1) ועצות סינון. הערה: אין צורך בטעינה עם PBS עבור השיטה האוטומטית, מכיוון שמתלי PBMC מייצרים נפח סופי של 7 מ"ל.</li>
	<li>העבירו 500 μL של התאים לכוס דגימה לספירת תאים ללא דילול. המשך לסעיף 5 לספירת תאים.</li>
</ol>5. ספירת תאים
<ol><li>בצע ספירת תאים וכדאיות באמצעות שיטת הרחקת הצבע הכחול טריפאן בהתאם להוראות היצרן15. הערה: עבור התהליכים הפנימיים של המחבר, ניתוח תאים מתבצע באמצעות מונה תאים אוטומטי עם ההגדרות הבאות כדי להשיג PBMCs. מקדם דילול = 10 (עבור פרוטוקול ידני, אם מתלה התא הוא בנפח נמוך) או 1 (עבור פרוטוקול אוטומטי) סוג תא: PBMC טווח ריכוז = 5 x 104 עד 1 x 107 תאים/מ"ל טווח מידות (קוטר) = 8 מיקרומטר עד 50 מיקרומטר מספר תמונות = 50</li>
</ol>6. הכנה לשימור בהקפאה
<ol><li>צנטריפוגה (באמצעות רוטור דלי מתנדנד) צינורות הדגימה ב 300 x גרם במשך 8 דקות ב 22 ° C עם הבלם מופעל (9 תאוצה / 9 האטה).</li>
	<li>לאחר הצנטריפוגה, החזירו את הדגימות לארון הבטיחות הביולוגי.</li>
	<li>בעזרת פיפטה, בזהירות להסיר את supernatant. ניתן להשאיר כמות קטנה של סופרנאטנט עם גלולת PBMC כדי להבטיח שהיא לא תופרע.</li>
	<li>להשעות את הגלולה ב 3 מ"ל של מדיום cryopreservation קר. מערבבים לאט ובעדינות את המתלה מעלה ומטה עד לקבלת מרקם הומוגני. הערה: ניתן לכוונן את נפח מדיום השימור בהתאם לריכוז PBMC הסופי הרצוי.</li>
	<li>יש להוציא 1 מ"ל של PBMC המושעה מחדש לתוך צינור קריו-צינור שהוקצה מראש ולמקם אותו בתוך מיכל הקפאה בקצב בקרה למשך 4 שעות לפחות ב-80°C-. הערה: ניתן לכוונן את נפח ה-PBMCs המותאמים לכל צינור קריו-צינור בהתאם להעדפת החוקר.</li>
	<li>לאחר אחסון cryotubes ב -80 °C למשך מינימום של 4 שעות, להעביר את cryotubes למיכל שלב אדי חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.</li>
</ol>7. ניתוח נתונים סטטיסטיים
<ol><li>נתוני התוצאות המייצגות נותחו באמצעות תוכנות סטטיסטיות וגרפיות כמפורט בקובץ משלים 3.</li>
</ol>

בידוד PBMC בתפוקה גבוהה באמצעות חרוזים אימונומגנטיים

<ol>
	<li>Alexovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+peripheral+blood+mononuclear+cells:+A+review+of+recent+proteomic+applications.">Human peripheral blood mononuclear cells: A review of recent proteomic applications.</a> Proteomics. 22 (15-16), e2200026 (2022).</li><li>Zhang, M., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multi-differentiation+potential+of+peripheral+blood+mononuclear+cells.">The multi-differentiation potential of peripheral blood mononuclear cells.</a> Stem Cell Res Ther. 3 (6), 48 (2012).</li><li>Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+leukocyte+subsets+from+fresh+and+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+clinical+research.">Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research.</a> Cryo Lett. 33 (5), 376-384 (2012).</li><li>Kleeberger, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+and+recovery+of+peripheral+blood+mononuclear+cells+cryopreserved+for+up+to+12+years+in+a+multicenter+study.">Viability and recovery of peripheral blood mononuclear cells cryopreserved for up to 12 years in a multicenter study.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 6 (1), 14-19 (1999).</li><li>Ulmer, A. J., Scholz, W., Ernst, M., Brandt, E., Flad, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+(PBMC)+by+density+gradient+centrifugation+on+percoll.">Isolation and subfractionation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifugation on percoll.</a> Immunobiology. 166 (3), 238-250 (1984).</li><li>Fuss, I. J., Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+whole+mononuclear+cells+from+peripheral+blood+and+cord+blood.">Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood.</a> Curr Protoc Immunol. 7, 711-718 (2009).</li><li>Gautam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+gene+expression+profiles+of+whole+blood+and+peripheral+blood+mononuclear+cells+using+multiple+collection+and+processing+methods.">Investigating gene expression profiles of whole blood and peripheral blood mononuclear cells using multiple collection and processing methods.</a> PLoS One. 14 (12), e0225137 (2019).</li><li>Hamot, G., Ammerlaan, W., Mathay, C., Kofanova, O., Betsou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+validation+for+automated+isolation+of+viable+peripheral+blood+mononuclear+cells.">Method validation for automated isolation of viable peripheral blood mononuclear cells.</a> Biopreserv Biobank. 13 (3), 152-163 (2015).</li><li>Coppola, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+viable+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+biobanking+using+a+robotized+liquid+handling+workstation.">Purification of viable peripheral blood mononuclear cells for biobanking using a robotized liquid handling workstation.</a> J Transl Med. 17 (1), 371 (2019).</li><li>Stemcell Technologies. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 27156, (2020).</li><li>Hornschuh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+magnetic+sorting+preserves+the+functionality+of+ex+vivo+cultivated+non-adherent+human+monocytes.">Negative magnetic sorting preserves the functionality of ex vivo cultivated non-adherent human monocytes.</a> Biology (Basel). 11 (11), 1583 (2022).</li><li>Bhattacharjee, J., Das, B., Mishra, A., Sahay, P., Upadhyay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+isolated+by+positive+and+negative+magnetic+sorting+techniques+show+different+molecular+characteristics+and+immunophenotypic+behaviour.">Monocytes isolated by positive and negative magnetic sorting techniques show different molecular characteristics and immunophenotypic behaviour.</a> F1000Res. 6, 2045 (2017).</li><li>Ohlsson, S., Diedrich, B., Uhlin, M., Sandgren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+processing+for+pathogen+inactivation+of+double-dose+buffy-coat+platelet+concentrates:+Maintained+in+vitro+quality+over+7-day+storage.">Optimized processing for pathogen inactivation of double-dose buffy-coat platelet concentrates: Maintained in vitro quality over 7-day storage.</a> Vox Sang. 113 (7), 611-621 (2018).</li><li>Easysep direct human PBMC isolation kit for processing 100 mL buffy coat. Available from: <a target="_blank" href="https://www.stemcell.com/products/brands/easysep-cell-separation.html">https://www.stemcell.com/products/brands/easysep-cell-separation.html</a> (2022)</li><li>. Vi-cell XR cell viability analyzer instructions for use Available from: <a target="_blank" href="https://mbcbiolabs.com/wp-content/uploads/2022/08/Beckman-Coulter-ViCell-Manual.pdf">https://mbcbiolabs.com/wp-content/uploads/2022/08/Beckman-Coulter-ViCell-Manual.pdf</a> (2017)</li><li>Fuchs, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+biobanking:+Employing+a+robotic+system+for+automated+mononuclear+cell+isolation.">Next-generation biobanking: Employing a robotic system for automated mononuclear cell isolation.</a> Biopreserv Biobank. 21 (1), 106-110 (2023).</li><li>Tigner, A., Ibrahim, S. A., Murray, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histology, white blood cell. , (2024).</li><li>Mathay, C., Ammerlaan, W., Betsou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+buffy+coat+extract+on:+Methodology,+feasibility,+optimization,+and+validation+study.">Automatic buffy coat extract on: Methodology, feasibility, optimization, and validation study.</a> Biopreserv Biobank. 10 (6), 543-547 (2012).</li><li>Golke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delays+during+PBMC+isolation+have+a+moderate+effect+on+yield,+but+severly+compromise+cell+viability.">Delays during PBMC isolation have a moderate effect on yield, but severly compromise cell viability.</a> Clin Chem Lab Med. 60 (5), 701-706 (2022).</li><li>Yi, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+delayed+PBMC+processing+on+functional+and+genomic+assays.">Impact of delayed PBMC processing on functional and genomic assays.</a> J Immunol Methods. 519, 113514 (2023).</li><li>Mckenna, K. C., Beatty, K. M., Vicetti Miguel, R., Bilonick, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+processing+of+blood+increases+the+frequency+of+activated+CD11b++CD15++granulocytes+which+inhibit+t-cell+function.">Delayed processing of blood increases the frequency of activated CD11b+ CD15+ granulocytes which inhibit t-cell function.</a> J Immunol Methods. 341 (1-2), 68-75 (2009).</li><li>Mallone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+preservation+of+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+analysis+of+islet+antigen-reactive+t-cell+responses:+Position+statement+of+the+t-cell+workshop+committee+of+the+immunology+of+diabetes+society.">Isolation and preservation of peripheral blood mononuclear cells for analysis of islet antigen-reactive t-cell responses: Position statement of the t-cell workshop committee of the immunology of diabetes society.</a> Clin Exp Immunol. 163 (1), 33-49 (2011).</li><li>Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biospecimen+science+of+blood+for+peripheral+blood+mononuclear+cell+(PBMC)+functional+applications.">Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications.</a> Curr Pathobiol Rep. 7 (2), 17-27 (2019).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

PBMCs אנושיים הם סוגי תאים רב-תכליתיים המשמשים לבדיקות רבות; עם זאת, תפוקת בידוד היא לעתים קרובות מגבלה במעבדות רבות, כולל ביובנקים16. בעבר, ה- NSW Health Statewide Biobank בודד PBMCs באמצעות שיטת שיפוע הצפיפות. אוטומציה נחקרה עבור שיטת הפרדת שיפוע צפיפות כדי להגדיל את קיבולת העיבוד, אך זוהו חסמים ליישום, כולל (i) העלות של מטפל בנוזלים עם יחידת צנטריפוגה להיות אוטומטית לחלוטין, עם דרישה נוספת ליחידת HEPA לייצר מוצר סטרילי, (ii) כוח אדם מיומן לתכנות, ו (iii) הזמן הדרוש לבדיקת פרוטוקול. לכן, מחקר זה בחן שיטות חלופיות וזיהה את ערכת PBMC האנושית שהושגה באופן מסחרי שיכולה לשמש לעיבוד ידני ואוטומטי. סטריליות מובטחת מכיוון שהציוד הדרוש לעיבוד מתאים לארון בטיחות ביולוגי סטנדרטי (אורך של 1.2 מטר). מאמר זה מפרט שינויים שבוצעו בפרוטוקול14 המומלץ של היצרן, כדי להגביר את היעילות ולהוזיל את עלויות המגיבים מבלי להקריב את האיכות. בנוסף, פרוטוקול היצרן הורחב כדי לפרט צעדים לדגימות ביובנק למחקר עתידי, כולל דם שלם (שלב 1.2), פלזמה (שלב 2.2) ו- RBC (שלב 2.5) היוצא מצינורית הדם המקורית, כמו גם ספירת תאים ושימור בהקפאה.
במחקר זה הושוו שלושה פרוטוקולי בידוד PBMC: הפרדת שיפוע צפיפות, בידוד ידני ואוטומטי מבוסס חרוזים. בוצעו שינויים בפרוטוקול מבוסס החרוזים הידני של היצרן, כולל הסרת דילול מעיל באפי לפני בידוד PBMC, וביטול הדרישה לניתוק OFF לצנטריפוגציות, מה שמאפשר לחוקרים לעקוב אחר פרוטוקול בידוד PBMC הניתן להתאמה, חסכוני ובתפוקה גבוהה. ראשית, שמונה דגימות דם שלמות תואמות שימשו לבידוד PBMCs כדי להשוות את הפרדת שיפוע הצפיפות וטכניקה ידנית מבוססת חרוזים. חשוב לציין שהתפלגות אוכלוסיית התאים, כדאיות התאים וההתאוששות של PBMCs לא היו שונים באופן משמעותי בין שתי השיטות שהושוו, כפי שניתן לראות באיור 2A-F, איור 3A ואיור משלים 1, בהתאמה. בנתונים המייצגים, ספירת התאים הייתה גבוהה יותר בשיטת הפרדת שיפוע הצפיפות בשיטת ההדרה הכחולה של טריפאן, אך לא כאשר נעשה שימוש במנתח תאים המטולוגי. הגדרות סוג התא PBMC על מונה התא השתמשו בטווח קוטר התא של 8-50 מיקרומטר, ולכן הספירה תכלול PBMCs כמו גם גרנולוציטים (בקוטר 12-15 מיקרומטר בקירוב) בעת שימוש בשיטת ההרחקה הכחולה של טריפאן17. בעוד מונה התאים ההמטולוגיים הציע ספציפיות גבוהה יותר מאשר שיטת ההרחקה הכחולה של טריפאן, חלק מחישובי השחזור היו גבוהים מ-100%, מה ששיקף את מרווח הטעות של המכשיר (ראה איור משלים 1). לכן, מומלץ לחוקרים ליישם שילוב של טכניקות ספירת תאים בעת השוואת התפוקה מפרוטוקולי בידוד PBMC, מכיוון שרוב הטכניקות אינן מציעות ספירת תאים דיפרנציאלית ספציפית ורגישה מאוד. יתר על כן, בדיקות לא בוצעו כדי להשוות את הפעילות הפונקציונלית של PBMCs הניבה משתי הטכניקות, וזו מגבלה של הניתוח שלנו.
לאחר מכן, הושוו השיטות הידניות והאוטומטיות המבוססות על חרוזים, ולא זוהו הבדלים משמעותיים בין תפוקת PBMC או כדאיות מ-8 דגימות תואמות (איור 4A,B). אוכלוסיות התאים לא הושוו בנפרד, שכן אותו קוקטייל בידוד נוגדנים שימש בשתי השיטות. חשוב לציין שהזמן המעשי לעיבוד 8 דגימות הופחת מ-43 דקות ל-22 דקות באמצעות הפרוטוקול האוטומטי (איור 4C). בעוד התפוקה, מניעת שחיקת טכנאים ועקביות עיבוד הדגימות מובטחים באמצעות אוטומציה, עלות הריאגנטים והחומרים המתכלים גבוהה משמעותית פי 3-4 מהשיטה הידנית המבוססת על חרוזים. זאת לאחר ביצוע שינויים בפרוטוקול הייצור לשימוש ב-1 מ"ל מעיל באפי (מנפח דם שלם של 10 מ"ל) במקום בטווח המומלץ של 2-5 מ"ל (מנפח דם שלם של 10 מ"ל ומעלה). אם התקציב הוא מגבלה, בחירה בשיטה הידנית יכולה להפחית את זמן העיבוד ב~ 25% תוך שמירה על עלויות מגיב ומתכלות דומות לאלה של שיטת הפרדת הצפיפות. מומלץ לעבד לא יותר מ-8 דגימות בכל פעם לכל טכנאי כדי להבטיח התאמה מספקת של הדגימות (~30 שניות לדגימה) בתוך תקופות הדגירה של 5 דקות (שלבים 3.7, 3.11 ו-3.14).
הן בשיטות הידניות והן בשיטות האוטומטיות המבוססות על חרוזים, הסרת מעיל באפי היא צעד קריטי להבטחת בידוד PBMC אופטימלי. חשוב לציין כי בפרוטוקול זה נעשה שימוש במעיל באפי ולא בדם שלם מכיוון שנפח הריאגנטים מבוסס על נפחי חומר התחלתי10. הסרה יעילה של כל נפח מעיל באפי יכולה להיות מאתגרת מבחינה טכנית. בתחילה, שיטה זו פירטה הסרת 0.5 מ"ל מעיל באפי, אולם הוא הוגדל ל 1 מ"ל כדי לשפר את ההתאוששות. כדי להבטיח התאוששות נאותה ועקבית של מעיל באפי, פירוט תהליך זה חשוב בתיעוד פרוטוקול והדרכה. מומלץ לסובב קצה פיפטה תוך כדי שאיפת הפרווה הבוהקת תוך הקפדה לא לשאוף יותר מדי RBCs מהשכבה שמתחתיה (שלב 2.3). חשוב לא להרוות את קוקטייל הנוגדנים הקושר תאים לא רצויים (גרנולוציטים ותאי דם אדומים), מה שעלול להשפיע על היבול והטוהר10. כדי למזער RBCs שנאספו במהלך מיצוי מעיל הבאפי, קצה פיפטה צריך להיות בין שכבת הפלזמה לשכבת הפרווה הבאפי. נפח מעיל באפי ניתן להגדיל מ 1 מ"ל; עם זאת, יש להקפיד כמתואר לעיל כדי להבטיח שלא יותר מ -10% מהנפח שנאסף מכיל RBCs. לחלופין, ניתן להשתמש במטפל אוטומטי בנוזלים כדי לאסוף מעילי באפי באופן עקבי18. עם זאת, השעות הייעודיות הנדרשות לכיול ופתרון בעיות בפרוטוקולי מכשירים לטיפול בנוזלים, במיוחד בהתחשב בהוצאה, עשויות שלא להיות ריאליות עבור רוב המעבדות.
המעבר והיישום של פרוטוקול מבוסס חרוזי אוטומציה היה חיוני בהתחשב במטרתו של NSW Health Statewide Biobank לעבד 23,000 PBMCs במהלך 3 השנים הבאות. כאן, הוכח כי PBMCs ניתן לבודד צינורות ACD עד 9 ימים מהאיסוף עם כדאיות ממוצעת >70%. בעוד שהתפוקות היו אופטימליות 24 שעות לאחר האיסוף, עיבוד במסגרת זמן זו אינו תמיד אפשרי מכיוון שייתכן שיהיה צורך להעביר דגימות. הוכח כי PBMCs שבודדו בשיטה ידנית או אוטומטית המבוססת על חרוזים עשויים להיות בעלי תפוקות של >3 x 105 תאים/מ"ל דם שלם כאשר בודדו תוך 4 ימים מהאיסוף ו->1 x 105 תאים/מ"ל דם שלם כאשר בודדו תוך 10 ימים מהאיסוף. מספרים נמוכים עבור דגימות מעל 5 ימים מצוינים כמגבלה של ניתוח זה. יתר על כן, הנתונים לא הופרדו על בסיס גילאי המשתתפים, מינם וההיסטוריה הקלינית שלהם, מכיוון שמידע זה לא היה זמין. למרות שיש צורך בניתוח השוואתי כדי לבחון את ההשפעות של עיכובים בזמני עיבוד עבור שתי השיטות, דווח בעבר כי עיכובים בבידוד PBMC בשיטת שיפוע הצפיפות מפחיתים את איכות התאים ומגדילים באופן משמעותי את זיהום RBC 19,20. בנוסף, פרופורציות גרנולוציטים גדלות אם העיבוד מתעכב, ולכן יש לקבץ דגימות של "גילאים" דומים לניתוחים במורד הזרם 20,21,22. יש לציין כי ניסוי זה בוצע באמצעות נוגדי קרישה בדם עם דקסטרוז ציטרי חומצי (כלומר, טריסודיום ציטראט, חומצת לימון ודקסטרוז); עם זאת, התפוקה ו / או החלק היחסי של סוגי התאים עשויים להשתנות אם נעשה שימוש בנוגדי קרישה אחרים23; לכן, מומלץ לחוקרים לבחור נוגד קרישה מתאים בהתבסס על ניתוחי PBMC המיועדים במורד הזרם.
לסיכום, מפורט פרוטוקול לבידוד PBMC באמצעות חרוזים מגנטיים הניתנים להתאמה לזרימות עבודה בעלות תפוקה גבוהה כדי למלא את הדרישות לקנה מידה מבלי לפגוע בכדאיות התא. ניתן למטב הן את השיטה הידנית והן את השיטה האוטומטית כדי לייצר ריכוזי תאים ספציפיים על ידי שינוי נפחי ההתחלה וההשעיה. ה- NSW Health Statewide Biobank עבר מחילוץ ~ 60 PBMCs לחודש באמצעות טכניקת הפרדת שיפוע הצפיפות המסורתית ל~ 300 PBMCs לחודש באמצעות שיטה מבוססת חרוזים תואמת אוטומציה זו. המטרה הבאה של המחברים היא להשתמש בפלטפורמה האוטומטית כדי לעבד עד 1200 PBMCs בחודש ולהשוות עוד יותר PBMCs שבודדו הן על ידי טכניקות מבוססות חרוזים מגנטיים (ידניות ואוטומטיות) והן על ידי טכניקות שיפוע צפיפות כדי להנחות את היישום של טכניקה זו למעבדות אחרות עם דגש מיוחד על ביובנקים.

בידוד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMC) היא טכניקה המפרידה ומבודדת לימפוציטים ומונוציטים ממרכיבי דם שלמים אחרים. PBMCs הם סוג תא רב-תכליתי המשמש ליישומים רבים, כולל, אך לא רק, אימונותרפיה, פיתוח חיסונים, זיהוי מטרה או סמנים ביולוגיים, ופיתוח תרופות נוגדנים/מולקולות קטנות 1,2. תאים אלה עשויים להיות מבודדים מאנשים בריאים או חולים וניתן להשתמש בהם באופן מיידי בתהליכים במורד הזרם או בהקפאה למחקר עתידי3. במקרים מסוימים, המטרה במורד הזרם ידועה, בעוד שבמקרים אחרים, כפי שמקובל בביו-בנקאות, PBMCs מבודדים ומאוחסנים עבור יישומים עתידיים שלא צוינו4.
צנטריפוגת שיפוע צפיפות היא הטכניקה המסורתית לבידוד PBMCs 5,6,7 מדם שלם, תוך שימוש בהפרדה דיפרנציאלית של סוגי התאים המרכיבים בהתבסס על צפיפות התאים במהלך הצנטריפוגה. אמנם ייתכנו שינויים מסוימים בשיטה זו, דם שלם בדרך כלל מדולל במי מלח חוצצי פוספט (PBS), שכבות על מדיום שיפוע צפיפות בצינור צנטריפוגה מיוחד או סטנדרטי, ולאחר מכן מסובב. התוצאה היא ארבע שכבות נפרדות: שכבת הפלזמה העליונה מועשרת בטסיות דם, שכבת PBMC דקה נמצאת מעל מדיום שיפוע הצפיפות, ולבסוף, השכבה התחתונה מורכבת מכדוריות דם אדומות (RBCs) וגרנולוציטים. אף על פי ששיטה זו כונתה בעבר "תקן הזהב"8, ישנן מגבלות להתרחבות, כגון זמן עיבוד ממושך, קיבולת צנטריפוגות, קושי בציטוט מוצרי דם אחרים (כלומר, פלזמה ו- RBCs), ולהיות מייגע לאוטומציה. בעוד אוטומציה אפשרית עבור שיטהזו 9, היא דורשת תכנות מקיף של מטפל נוזלים (עם מודול צנטריפוגה להיות אוטומטי לחלוטין) ויישאר תהליך ארוך.
מעתה, מוצג תהליך עבודה חלופי המשתמש בהפרדת חרוזים אימונומגנטית עם מגנט בעל שמונה מחזיקים לעיבוד ידני או מכשיר לעיבוד אוטומטי לחלוטין. שיטה זו משתמשת בקוקטייל נוגדנים המוסף לתאים וקושר אוכלוסיות תאים לא רצויות, במקרה זה טסיות דם, גרנולוציטים ו-RBC. אוכלוסיות לא רצויות אלה מוסרות לאחר מכן על ידי הפרדה מגנטית, ומשאירות אוכלוסיות מונוציטים ולימפוציטים בחלק השלילי המוכנות לעיבוד במורד הזרם10. שיטת ברירה שלילית זו מהירה יותר משיטות ברירה חיובית הדורשות צעדים נוספים להסרת קומפלקס הנוגדנים והחרוזים המגנטיים מהמרכזיות. ברירה שלילית היא יתרון נוסף מכיוון שהיא תוארה כדרך לשמר את פונקציונליות התא11,12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell cryopreservation media CS10, 100 mL (CRYOSTOR)</td>
			<td>StemCellTM Technologies</td>
			<td>07930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo ScientififcTM</td>
			<td>51033311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell 1 mL FX</td>
			<td>BioTools</td>
			<td>BCS-407P</td>
			<td>This is the control rate freezing container used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water&#160;</td>
			<td>Bacto Laboratories</td>
			<td>561832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DxH 500 Hematology Analyzer&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>B40601</td>
			<td>Referred to as external automated cell counter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyEightsTM EasySepTM Magnet</td>
			<td>StemCellTM Technologies</td>
			<td>18103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySepTM Direct Human PBMC Isolation Kit</td>
			<td>StemCellTM Technologies</td>
			<td>19654</td>
			<td>Kit includes the magnetic bead tube and the cocktail mix tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>E6758-500G</td>
			<td>Instructions to make 0.1M EDTA solution from EDTA salt is located in supplemental file 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LymphoprepTM Density Gradient Medium</td>
			<td>StemCellTM Technologies</td>
			<td>7851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megafuge ST4 Plus Centrifuge</td>
			<td>Thermo ScientififcTM</td>
			<td>THR75009903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orion Star A211 pH meter electrode</td>
			<td>Thermo ScientififcTM</td>
			<td>STARA2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orion&#8482; ROSS Ultra&#8482; Glass Triode&#8482; pH/ATC Combination Electrodes</td>
			<td>Thermo ScientififcTM</td>
			<td>8302BNURCA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), solution, 1X, 500ml</td>
			<td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RoboSepTM Buffer 1X</td>
			<td>StemCellTM Technologies</td>
			<td>20104</td>
			<td>Software used for statistical analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RoboSepTM-S</td>
			<td>StemCellTM Technologies</td>
			<td>21000</td>
			<td>Fully automated cell separator instrument.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RoboSep&#8482; Filter Tips</td>
			<td>StemCellTM Technologies</td>
			<td>20125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SepMateTM-50 (IVD) tubes</td>
			<td>StemCellTM Technologies</td>
			<td>85460</td>
			<td>IVD - In vitro diagnostics. Also known as SepMateTM-50 tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-CELL XR Cell Anlayzer</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>Internal automated cell counter. Instrument obsolete and no longer available for purchase (as of December 31, 2022). Alternative instrument is the ViCell BLU Cell Viability Analyzer (Product no. C19196).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-CELL XR Quad Pack Reagent Kit</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>383722</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating human peripheral blood mononuclear cells from buffy coats via high throughput immunomagnetic bead separation

תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) הם אוכלוסייה הטרוגנית של מונוציטים ולימפוציטים. למרכזיות בהקפאה יש יכולת קיום יציבה באחסון לטווח ארוך, מה שהופך אותן לסוג תא אידיאלי למטרות מחקר רבות במורד הזרם, כולל ציטומטריית זרימה, בדיקות חיסוניות וריצוף גנום. בדרך כלל, PBMCs מבודדים באמצעות צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות, עם זאת, זהו תהליך עבודה בתפוקה נמוכה שקשה ויקר לשנות את קנה המידה. מאמר זה מציג זרימת עבודה בעלת תפוקה גבוהה באמצעות שיטת בידוד PBMC מבוססת חרוזים מגנטיים הניתנת ליישום במהירות. ריכוז התאים הכולל, הכדאיות ופיזור האוכלוסייה עם PBMCs שהתקבלו באמצעות בידוד שיפוע צפיפות הושוו, ויכולת קיום התאים וחלקם היחסי של סוגי התאים היו דומים בשתי הטכניקות. מרכזיות מבודדות הדגימו יכולת קיום של מעל 70% עד 9 ימים לאחר איסוף הדם, אם כי התפוקה ירדה בחצי לאחר 5 ימים בהשוואה למרכזיות שעובדו תוך 24 שעות מהאיסוף. לסיכום, מאמר זה מתאר פרוטוקול PBMC המשתמש בגישה מבוססת חרוזים כדי להסתגל לזרימת עבודה בתפוקה גבוהה ומדגים כי שיטות ידניות ואוטומטיות מבוססות חרוזים יכולות להגדיל את קיבולת העיבוד ולספק גמישות לתקציבים שונים.

Peripheral blood mononuclear cell (PBMC) isolation is a technique that separates and isolates lymphocytes and monocytes from other whole blood constituents. PBMCs are a versatile cell type used for numerous applications including, but not limited to, immunotherapy, vaccine development, target or biomarker identification, and antibody/small molecule drug development1,2. These cells may be isolated from healthy or diseased individuals and can be used immediately in downstream processes or cryopreserved for future research3. In some instances, the downstream purpose is known, while in others, as is common in biobanking, PBMCs are isolated and stored for future unspecified applications4.
Density gradient centrifugation is the traditional technique for isolating PBMCs5,6,7 from whole blood, utilizing the differential separation of the constituent cell types based on cell density during centrifugation. While there may be some variation in this method, whole blood is generally diluted with phosphate-buffered saline (PBS), layered over a density gradient medium in a specialized or standard centrifuge tube, and then spun. Four distinct layers result: the top plasma layer is enriched with platelets, a thin PBMC layer is above the density gradient medium, and finally, the bottom layer consists of red blood cells (RBCs) and granulocytes. Although this method has previously been termed &#39;the gold standard&#39;8, there are limitations for scale-up, such as lengthy processing time, centrifuge capacity, difficulty in aliquoting other blood products (i.e., plasma and RBCs), and being laborious to automate. While automation is possible for this method9, it does require comprehensive programming of a liquid handler (with a centrifugation module to be fully automated) and would remain a lengthy process.
Henceforth, an alternate workflow that uses immunomagnetic bead separation with either an eight-holder magnet for manual processing or an instrument for fully automated processing is presented. This method utilizes an antibody cocktail that is added to cells and binds unwanted cell populations, in this case, platelets, granulocytes, and RBCs. These unwanted populations are subsequently removed by magnetic separation, leaving monocyte and lymphocyte populations in the negative fraction that are ready for downstream processing10. This negative selection method is faster than positive selection methods which require additional steps to remove the antibody and magnetic bead complex from the PBMCs. Negative selection is additionally advantageous as it has been described as a way to preserve cell functionality11,12.

מחבר זרקור: התקדמות בבידוד PBMC - שיפור התפוקה והעקביות במחקר

בידוד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים ממעילי באפי באמצעות הפרדת חרוזים אימונומגנטית בתפוקה גבוהה

Isolating peripheral blood mononuclear cells, also known as PBMCs, is typically a lengthy and manual process. We saw an alternative method that'd be quick to implement and capable of processing high numbers of samples. Our protocol offers an automated high throughput method, ensuring consistency while preventing technician burnout.We also detail our medium throughput automation-compatible method that can be utilized during equipment downtime. This medium throughput option is a more budget-friendly alternative for other laboratories. A biobank can now process more samples with the same number of technicians.This will increase the specimen collection size as well as its diversity, enabling future research and improving patient care.

הפרופורציות של לימפוציטים, מונוציטים, נויטרופילים, אאוזינופילים ובזופילים לפני (כלומר, בדם שלם) ואחרי בידוד PBMC נמדדו כאשר PBMCs בודדו באמצעות שיטת ההפרדה ההדרגתית מבוססת חרוזים או צפיפות. הפרופורציות של לימפוציטים ומונוציטים הועשרו באופן משמעותי בשתי השיטות (איור 2A,B). נוסף על כך, הפרופורציות של נויטרופילים, אאוזינופילים ובזופילים (כלומר, גרנולוציטים) ירדו באופן משמעותי ב-PBMCs שבודדו בשיטה מבוססת חרוזים (איור 2C-F). לא היו הבדלים משמעותיים בפרופורציות של לימפוציטים, מונוציטים, נויטרופילים, אאוזינופילים, בזופילים וגרנולוציטים בין שיפוע הצפיפות לבין שיטות מבוססות חרוזים (איור 2). אחוזי ההתאוששות חושבו בנוסף עבור סוגי התאים שצוינו לעיל (ראו איור משלים 1). הכדאיות הממוצעת של התאים הייתה מעל 95% בשתי השיטות, ולא הייתה שונה באופן משמעותי (איור 3A). PBMCs נספרו גם באמצעות טווח גדלים (קוטר) של 8 מיקרומטר עד 50 מיקרומטר, כאשר שיטת ההפרדה ההדרגתית של הצפיפות הפיקה ספירת תאים כוללת גבוהה בערך פי שניים (איור 3B). 
לאחר מכן, השיטה האוטומטית מבוססת החרוזים הושוותה לשיטה הידנית. לא זוהו הבדלים משמעותיים בכדאיות התא (איור 4A) או בספירה הכוללת של התאים (איור 4B) בשיטה הידנית או האוטומטית. הזמן לעיבוד 8 הדגימות הללו הושווה, כולל זמן ללא התערבות אנושית. זמן העיבוד הכולל של 8 דגימות היה 43 דקות לעומת . 57 דק' למדריך לעומת השיטה האוטומטית. השיטה האוטומטית כללה 35 דקות של עיבוד ידני (איור 4C).
תהליך העבודה מבוסס החרוזים של בידוד PBMC (עם דם שלם ופלזמה aliquoting) היה פיילוט במשך 9 חודשים, שבו 1410 דגימות PBMC בודדו מדם אנושי לא מסונן באמצעות פלטפורמה ידנית עבור 820 המשתתפים הראשונים ולאחר מכן באמצעות השיטה האוטומטית עבור 590 המשתתפים הבאים. העיבוד בוצע באותו יום או עד 10 ימים לאחר האיסוף בהתאם לקריטריונים לקבלת המחקר, עם עיכובים בעיבוד בעיקר בגלל זמני העברת הדגימה. בשיטה הידנית או האוטומטית, PBMCs שעובדו בתוך 24 שעות מהאיסוף היו בעלי הכדאיות וההתאוששות הגבוהות ביותר (איור 5). הכדאיות הממוצעת של התאים הייתה >90% עבור PBMCs שעובדו תוך 5 ימים ו->70% עבור PBMCs שעובדו תוך 10 ימים (איור 5A). התשואות הממוצעות של PBMC ירדו ב-50% לאחר 5 ימים בהשוואה לדגימות שעובדו תוך 24 שעות (איור 5B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig01.jpg"> איור 1: זרימת עבודה סכמטית של פרוטוקול בידוד PBMC מבוסס חרוזים ממעיל באפי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig02.jpg"> איור 2: פרופורציות של לימפוציטים, מונוציטים, נויטרופילים, אאוזינופילים, בזופילים וגרנולוציטים בבידוד דם שלם לפני ואחרי PBMC על-ידי שיפוע צפיפות ושיטות מבוססות חרוזים. אחוז הלימפוציטים (A), מונוציטים (B), נויטרופילים (C), אאוזינופילים (D), בזופילים (E) וגרנולוציטים (F) בבידוד תואם של דם שלם לפני PBMC (ריבועים) וב- PBMCs לאחר בידוד באמצעות שיטת שיפוע צפיפות (מעגלים פתוחים) או מבוסס חרוזים (מעגלים סגורים) (n = 8). ns = לא משמעותי, ו- *p < 0.05 כפי שנקבע על ידי ANOVA חד כיווני (A ו- B) או מבחן פרידמן (C- ו). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig03.jpg"> איור 3: כדאיות וספירת תאים כוללת של PBMC שבודדו על-ידי שיפוע צפיפות ושיטות מבוססות חרוזים. (A) כדאיות תא ממוצעת (± SD) עבור דגימות שעובדו באמצעות שיפוע צפיפות (ריבועים, פס כהה) לעומת שיטות מבוססות חרוזים (עיגולים, סרגל פתוח) עבור 8 דוגמאות זוגיות. ns = לא משמעותי על ידי מבחן T זוגי. (B) ספירת התאים הכוללת עבור דגימות שעובדו באמצעות שיפוע צפיפות (ריבועים, פס כהה) לעומת שיטות מבוססות חרוזים (עיגולים, סרגל פתוח) עבור 8 דוגמאות זוגיות. *P < 0.05 נקבע באמצעות מבחן T זוגי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig04.jpg"> איור 4: השוואה בין שיטות ידניות ואוטומטיות המבוססות על חרוזים. (A) כדאיות תא ממוצעת (± SD) עבור דגימות שעובדו באמצעות ידני (ריבועים, פס כהה) לעומת שיטות אוטומטיות (עיגולים, סרגל פתוח) מבוססות חרוזים עבור 8 דוגמאות זוגיות. ns = לא משמעותי לפי מבחן מאן-ויטני. (B) ספירת התאים הכוללת עבור דגימות שעובדו באמצעות ידני (ריבועים) לעומת שיטות אוטומטיות (מעגלים) מבוססות חרוזים עבור 8 דוגמאות זוגיות. ns = לא משמעותי על ידי מבחן T זוגי. (ג) זמן עיבוד של 8 דגימות שעובדו באמצעות ידני לעומת שיטות אוטומטיות, כולל הפעלה מעשית (סרגל בהיר) ופרקי זמן ללא ידיים (סרגל כהה). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig05.jpg"> איור 5: הכדאיות והתשואה של PBMC שבודדו מהשיטה מבוססת החרוזים באופן ידני או באמצעות אוטומציה בהתאם לזמן שבין איסוף הדגימות לאחסון PBMC. (A) כדאיות תאים ממוצעת (± 95% CI) עבור דגימות משתתפים שעובדו באמצעות ידני (סרגל כהה) לעומת שיטות אוטומטיות (בר פתוח) מבוססות חרוזים. טבלה המפרטת את מספרי המשתתפים. ns = לא משמעותי. na = לא ישים. *p < 0.05 לפי מבחן ההשוואה המרובה של Tukey. (B) ספירת התאים הכוללת עבור דגימות משתתפים שעובדו באמצעות ידני (פס כהה) לעומת שיטות אוטומטיות (בר פתוח) מבוססות חרוזים. טבלה המפרטת את מספרי המשתתפים. ns = לא משמעותי. na = לא ישים. *p < 0.05 לפי מבחן ההשוואה המרובה של Tukey. אין ערך עבור יום 10 אוטומטי מכיוון שהמספר המשוכפל נמוך מ- 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
איור משלים 1: איור של התאוששות אחוזי תאים דיפרנציאליים עם שיפוע צפיפות ושיטות מבוססות חרוזים. האחוז חושב באמצעות ספירת תאים מוחלטת לפני בידוד בדם שלם ותרחיף תאים לאחר בידוד בשיטת שיפוע צפיפות (ריבועים, סרגל כהה) ושיטה מבוססת חרוזים (עיגולים, סרגל פתוח) (n = 8). ns = לא משמעותי, ו- *p < 0.05 כפי שנקבע על ידי מבחן t לא מזווג. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 1: פרוטוקול שיפוע צפיפות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/Supplementary%20File%201_editedv2.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 2: הכנת 0.1 M EDTA, pH 8.0 ב- PBS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/Supplementary%20File%202_editedv2.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 3: הליכים מפורטים שבוצעו להפקת הנתונים המייצגים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/Supplementary%20File%203_editedv2.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

פרוטוקול זה מפרט שיטה תואמת אוטומציה בתפוקה גבוהה לבידוד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים למטרות ביו-בנקאות ולמטרות אחרות.

Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are a heterogeneous population of monocytes and lymphocytes. Cryopreserved PBMCs have stable viability in ...

isolating-human-peripheral-blood-mononuclear-cells-from-buffy-coats

Research

JoVE Journal

Biology

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells from Buffy Coats via High Throughput Immunomagnetic Bead Separation

1.4K Views.  New South Wales Health Pathology. בידוד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים, הידועים גם בשם PBMCs, הוא בדרך כלל תהליך ארוך וידני. ראינו שיטה חלופית שתהיה מהירה ליישום ומסוגלת לעבד מספר גבוה של דגימות. הפרוטוקול שלנו מציע שיטת תפוקה גבוהה אוטומטית, המבטיחה עקביות תוך מניעת שחיקה של טכנאים.אנו גם מפ...

Video: מחבר זרקור: התקדמות בבידוד PBMC - שיפור התפוקה והעקביות במחקר

Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are a heterogeneous population of monocytes and lymphocytes. Cryopreserved PBMCs have stable viability in long-term storage, making them an ideal cell type for many downstream research purposes, including flow cytometry, immunoassays, and genome sequencing. Typically, PBMCs are isolated via&#160;density gradient centrifugation, however, it is a low-throughput workflow that is difficult and costly to scale. This article presents a high-throughput workflow using a magnetic bead-based PBMC isolation method that is quick to implement. Total cell concentration, viability, and population distribution with PBMCs obtained using density gradient isolation were compared, and cell viability and proportion of cell types were comparable for both techniques. Isolated PBMCs demonstrated over 70% viability up to 9 days after blood collection, although yield decreased by half after 5 days compared to PBMCs processed within 24 h of collection. In summary, this article describes a PBMC protocol that utilizes a bead-based approach to adapt to a high throughput workflow and demonstrates that both manual and automated bead-based methods can increase processing capacity and provide flexibility for various budgets.

This protocol details a high-throughput automation-compatible method to isolate human peripheral blood mononuclear cells for biobanking and other purposes.

Whole Blood Purification and Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) Isolation Using Manual Method

To begin, gently invert 10-milliliter whole blood tubes 10 times at room temperature. Using a swinging bucket rotor, centrifuge the tubes at 800 g for 10 minutes at 22 degrees Celsius with the brake on. Then place the samples in a biological safety cabinet and check for the three distinct layers.Label three five-milliliter polystyrene tubes with letters A, B, and C.Swirl and collect one milliliter of the buffy coat by aspiration and transfer to the tube labeled as A.Then add 60 microliters of 0.1 molar EDTA to tube A containing the buffy coat. Add 50 microliters of the cocktail mix to tube A.Pipette up and down at least three times to mix it and incubate for five minutes at room temperature. After that, add 890 microliters of PBS to tube A and mixed by pipetting at least three times.Next, vortex the magnetic bead tube for 30 seconds. Add 50 microliters of the magnetic beads to tube A and pipette at least three times to mix the beads thoroughly. Immediately place tube A into the magnet stand and incubate for five minutes at room temperature.Then carefully pipette the enriched cell suspension into tube B, collecting the clear fraction with no or minimal red blood cells for optimal PBMC recovery. After that, remove tube A from the magnet stand and dispose of it. Next, add 50 microliters of magnetic beads to cell suspension in tube B and pipette up and down at least three times.Immediately place tube B into the magnet stand and incubate for five minutes at room temperature. Carefully pipette the enriched cell suspension into tube C, collecting only the clear fraction. Remove tube B from the magnet stand and dispose of it.Then immediately place tube C into the magnet stand and incubate for five minutes at room temperature. Carefully pipette the enriched cell suspension into a labeled centrifuge tube and top up to two milliliters with PBS. Transfer 50 microliters of the cell suspension to a sample cup of the automated cell counter.Add 450 microliters of PBS for a 1 to 10 dilution cell count.

טיהור דם מלא ובידוד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) בשיטה ידנית

Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) Purification Using a High Throughput Automated Bead-Based Method

To begin, label two 14-milliliter tubes as A and B, one 15-milliliter centrifuge tube as C, and one 15-milliliter centrifuge tube as waste. After centrifuging the whole blood, collect and add one milliliter of the prepared buffy coat to tube A.Add 60 microliters of 0.1 molar EDTA to tube A.Then vortex the magnetic bead tube for 30 seconds. To turn on the automated PBMC instrument, switch the power on at the front of the instrument.On the instrument's home screen, select profile and choose the desired protocol. Then enter the starting volume and repeat for each sample. Select all the quadrants that will use the same reagent kit.Next, load labeled consumables, filter tips, and buffer container into each quadrant of the instrument's carousel as directed on the automated PBMC instrument screen. Once loading is complete, remove lids from consumables and reagents and select run on the instrument screen. When the run is complete, select unload and remove samples from the instrument's carousel.Transfer 500 microliters of the cells to a sample cup for a no-dilution cell count. Comparing the automated bead-based method to the manual method, no significant differences were identified in cell viability or total cell counts. The manual method processed eight samples in 43 minutes while the automated method took 57 minutes, including 35 minutes of hands-off processing.Mean cell viability was greater than 90%for PBMCs processed within five days and greater than 75%for those processed within 10 days. Mean PBMC yields decreased by 50%after five days compared to specimens processed within 24 hours.