La NSW Health Statewide Biobank riconosce con gratitudine il sostegno di NSW Health Pathology, dell'Ufficio per la salute e la ricerca medica del NSW e del Sydney Local Health District. Inoltre, gli autori ringraziano Omico e altri studi di ricerca supportati dalla NSW Health Statewide Biobank per aver concesso il permesso di pubblicare dati generati internamente e di utilizzare campioni inutilizzati per scopi di ricerca. Gli autori ringraziano la professoressa Jennifer Bryne (NSW Health Pathology, Università di Sydney) per la leadership critica e le discussioni. La Figura 1 è stata creata con BioRender.com.

I campioni di sangue per il controllo di qualità e i dati generati internamente (come la conta cellulare, la vitalità e l'età del campione al momento dell'elaborazione) sono stati ottenuti da studi di ricerca autorizzati presso la NSW Health Statewide Biobank, Royal Prince Alfred Hospital (approvazione HREC: 2019/ETH06776). In provette EDTA sono stati raccolti campioni di sangue umano adulto processati (cioè impoveriti di plasma), non sottoposti a screening e de-identificati. Questi campioni di sangue per il controllo di qualità sono stati elaborati meno di 72 ore dopo la raccolta e sono stati utilizzati per esperimenti di isolamento PBMC confrontando il gradiente di densità e i metodi basati su microsfere. Per il metodo di separazione del gradiente di densità utilizzato nei risultati rappresentativi, vedere la procedura nel File supplementare 1. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate per questo studio sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Preparazione del sangue intero
<ol><li>Capovolgere delicatamente 10 mL di provette di sangue intero (rivestite con acido etilendiamminotetraacetico [EDTA], acido-citrato-destrosio [ACD] o litio eparina) 10 volte a temperatura ambiente.</li>
	<li>Opzionale: se il sangue intero deve essere conservato, aliquotarlo in provette criogeniche per una conservazione a -80 °C.</li>
	<li>Centrifugare le provette con rotore a secchiello oscillante a 800 x g per 10 minuti a 22 °C con il freno inserito (9 accelerazioni/ 9 decelerazioni).</li>
</ol>2. Collezione di cappotti Buffy
<ol><li>Dopo la centrifugazione, collocare i campioni in una cabina di sicurezza biologica e verificare la presenza dei tre strati distinti (come mostrato nella Figura 1). NOTA: I globuli rossi si trovano nello strato inferiore rosso scuro della provetta da centrifuga. Uno strato bianco opaco contenente globuli bianchi e piastrine si trova sopra lo strato di globuli rossi, noto come buffy coat. Lo strato giallo superiore contiene plasma.</li>
	<li>Opzionale: se il plasma deve essere conservato, aliquotare il plasma in provette criogeniche per la conservazione a -80 °C.</li>
	<li>Pipettare 1 mL di buffy coat (materiale di partenza) da una provetta di sangue da 10 mL e trasferirla nella provetta specificata ed etichettata nei passaggi 3.1 e 4.1 rispettivamente per i metodi manuale e automatizzato. Agitare il buffy coat (strato bianco opaco) utilizzando la punta della pipetta e raccogliere il buffy coat aspirando. NOTA: Durante l'aspirazione sono accettabili meno di 100 μL di plasma e globuli rossi. Se vengono raccolte più provette di sangue per un partecipante, i buffy coat possono essere raggruppati; Tuttavia, ciò può influire sulla concentrazione piastrinica13.</li>
	<li>Per l'elaborazione manuale, passare alla sezione 3. Per l'elaborazione automatizzata, passare alla sezione 4.</li>
	<li>Opzionale: se i globuli rossi devono essere conservati, aliquotare i globuli rossi in provette criogeniche per la conservazione a -80 °C.</li>
</ol>3. Purificazione PBMC - Metodo manuale
NOTA: Un singolo operatore può elaborare fino a 8 campioni per supporto magnetico.
<ol><li>Etichettare 3 provette di polistirolo da 5 ml con le lettere A-C. NOTA: Utilizzare la numerazione sequenziale se si esegue più di un campione, ad esempio 1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 2C.</li>
	<li>Aggiungere 60 μl di EDTA 0,1 M (per una concentrazione finale di EDTA di 6 mM, pH 8,0, vedere il file supplementare 2 per la ricetta) alla provetta A contenente il buffy coat trasferito nella fase 2.3.</li>
	<li>Aggiungere 50 μl della provetta per cocktail (vedere la Tabella dei materiali) alla provetta A, miscelare pipettando su e giù almeno 3 volte e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aggiungere 890 μl di PBS alla provetta A e mescolare pipettando su e giù almeno 3 volte.</li>
	<li>Agitare il tubo della perlina magnetica (vedi Tabella dei materiali) per 30 s.</li>
	<li>Aggiungere 50 μl di biglie magnetiche alla provetta A e mescolare pipettando su e giù almeno 3 volte.</li>
	<li>Posizionare immediatamente la provetta A nel supporto magnetico e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Pipettare con cura la sospensione cellulare arricchita nella provetta B, raccogliendo la frazione chiara con globuli rossi nulli/minimi (<100 μl) per un recupero ottimale della PBMC. NOTA: Non disturbare le perline legate al magnete. Si consiglia una pipetta di trasferimento.</li>
	<li>Rimuovere il tubo A dal supporto magnetico e smaltirlo.</li>
	<li>Aggiungere 50 μl di microsfere magnetiche alla sospensione cellulare nella provetta B e mescolare pipettando su e giù almeno 3 volte.</li>
	<li>Posizionare immediatamente la provetta B nel supporto magnetico e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Pipettare con cura la sospensione cellulare arricchita nella provetta C, raccogliendo solo la frazione chiara. NOTA: Non disturbare le perline legate al magnete. Si consiglia una pipetta di trasferimento.</li>
	<li>Rimuovere il tubo B dal supporto magnetico e smaltirlo.</li>
	<li>Posizionare immediatamente la provetta C nel supporto magnetico e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Pipettare con cura la sospensione cellulare arricchita in una provetta da centrifuga marcata e rabboccare fino a 2 mL con PBS.</li>
	<li>Trasferire 50 μl della sospensione cellulare in una tazza per campioni del contatore di cellule automatizzato. Per una conta delle cellule di diluizione 1:10, aggiungere 450 μL di PBS. Procedere alla sezione 5 per le fasi di conteggio delle cellule.</li>
</ol>4. Purificazione PBMC - Metodo automatizzato
NOTA: È possibile elaborare fino a 4 campioni da un singolo strumento PBMC automatizzato. Più strumenti possono essere eseguiti in parallelo da un singolo operatore.
<ol><li>Etichettare 2 provette da 14 ml con le lettere A e B, 1 provetta da centrifuga da 50 ml con la lettera C e 1 provetta da centrifuga da 50 ml con la dicitura "scarto". NOTA: È necessario un solo contenitore per i rifiuti per ogni seduta sullo strumento PBMC automatizzato. Utilizzare la numerazione sequenziale se si esegue più di un campione, ad esempio 1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 2C.</li>
	<li>Aggiungere 60 μl di EDTA 0,1 M (per una concentrazione finale di EDTA di 6 mM) alla provetta A contenente il buffy coat trasferito nella fase 2.3.</li>
	<li>Agitare il tubo a perline magnetiche (vedi Tabella dei materiali)  per 30 s.</li>
	<li>Accendere lo strumento PBMC automatizzato accendendo l'alimentazione nella parte anteriore dello strumento.</li>
	<li>Nella schermata iniziale dello strumento PBMC automatizzato , selezionare profile e selezionare il protocollo desiderato. NOTA: EasySep Direct Human PBMC isolation 19654 - buffy coat è stato il profilo di protocollo selezionato per questo isolamento PBMC. Vedere la procedura standard del produttore per questo profilo nel rapporto di protocollo14.</li>
	<li>Inserire il volume iniziale (la quantità di buffy coat aspirata nella provetta A) e ripetere per ogni campione.</li>
	<li>Selezionare tutti i quadranti che utilizzeranno lo stesso kit di reagenti. NOTA: Se lo stesso protocollo viene utilizzato per più di un quadrante, lo strumento PBMC automatizzato suggerirà di utilizzare lo stesso kit di reagenti per tutti i quadranti14.</li>
	<li>Caricare il carosello dello strumento con i materiali di consumo etichettati, i puntali del filtro e il contenitore del tampone. Il kit di reagenti contenente la provetta magnetica e la provetta per cocktail deve essere caricato nel quadrante 1. NOTA: Lo strumento chiederà se l'utente desidera utilizzare 1 kit di reagenti per tutti i quadranti. Seleziona "sì" ed evidenzia tutti i quadranti utilizzando il kit di reagenti.</li>
	<li>Una volta completato il caricamento, rimuovere i coperchi dai materiali di consumo e dai reagenti e selezionare Esegui sullo schermo dello strumento.</li>
	<li>Al termine della seduta , selezionare scarica e rimuovi i campioni (contenenti la sospensione PBMC etichettata nel tubo C) dal carosello dello strumento. Conservare il tubo magnetico per perline, il tubo per cocktail e il contenitore tampone a 4 °C. Eliminare i tubi etichettati come A, B e i rifiuti (vedere il passaggio 4.1) e i puntali del filtro. NOTA: Per il metodo automatizzato non è necessario alcun rabbocco con PBS, poiché la sospensione di PBMC produce un volume finale di 7 mL.</li>
	<li>Trasferire 500 μl di cellule in una coppa per campioni per una conta cellulare senza diluizione. Procedere alla sezione 5 per il conteggio delle cellule.</li>
</ol>5. Conteggio delle cellule
<ol><li>Eseguire il conteggio delle cellule e la vitalità utilizzando il metodo di esclusione del colorante blu di tripano seguendo le istruzioni del produttore15. NOTA: Per i processi interni dell'autore, l'analisi delle cellule viene eseguita utilizzando un contatore di celle automatizzato con le seguenti impostazioni per acquisire le PBMC. Fattore di diluizione = 10 (per il protocollo manuale, se la sospensione cellulare è in un volume basso) o 1 (per il protocollo automatizzato) Tipo di cella: PBMC Intervallo di concentrazione = da 5 x 104 a 1 x 107 cellule/mL Intervallo dimensionale (diametro) = da 8 μm a 50 μm Numero di immagini = 50</li>
</ol>6. Preparazione alla crioconservazione
<ol><li>Centrifugare (utilizzando un rotore a secchiello oscillante) le provette del campione a 300 x g per 8 minuti a 22 °C con il freno inserito (9 accelerazione/ 9 decelerazione).</li>
	<li>Dopo la centrifugazione, riposizionare i campioni nella cabina di sicurezza biologica.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta, rimuovere con cautela il surnatante. Una piccola quantità di surnatante può essere lasciata con il pellet PBMC per assicurarsi che non venga disturbato.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 3 mL di terreno di crioconservazione freddo. Mescolare lentamente e delicatamente la sospensione su e giù fino a renderla omogenea. NOTA: Il volume del terreno di ciroconservazione può essere regolato in base alla concentrazione finale di PBMC desiderata.</li>
	<li>Erogare 1 mL di PBMC risospeso in una crioprovetta preassegnata e posizionarlo all'interno di un contenitore di congelamento a velocità di controllo per un minimo di 4 ore a -80 °C. NOTA: Il volume di PBMC aliquotato in ciascuna crioprovetta può essere regolato in base alle preferenze dello sperimentatore.</li>
	<li>Dopo aver conservato le crioprovette a -80 °C per un minimo di 4 ore, trasferire le crioprovette in un serbatoio in fase di vapore di azoto liquido per la conservazione a lungo termine.</li>
</ol>7. Analisi statistica dei dati
<ol><li>I dati rappresentativi dei risultati sono stati analizzati utilizzando software statistici e grafici come specificato nel File supplementare 3.</li>
</ol>

Isolamento di PBMC ad alto rendimento mediante biglie immunomagnetiche

<ol>
	<li>Alexovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+peripheral+blood+mononuclear+cells:+A+review+of+recent+proteomic+applications.">Human peripheral blood mononuclear cells: A review of recent proteomic applications.</a> Proteomics. 22 (15-16), e2200026 (2022).</li><li>Zhang, M., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multi-differentiation+potential+of+peripheral+blood+mononuclear+cells.">The multi-differentiation potential of peripheral blood mononuclear cells.</a> Stem Cell Res Ther. 3 (6), 48 (2012).</li><li>Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+leukocyte+subsets+from+fresh+and+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+clinical+research.">Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research.</a> Cryo Lett. 33 (5), 376-384 (2012).</li><li>Kleeberger, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+and+recovery+of+peripheral+blood+mononuclear+cells+cryopreserved+for+up+to+12+years+in+a+multicenter+study.">Viability and recovery of peripheral blood mononuclear cells cryopreserved for up to 12 years in a multicenter study.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 6 (1), 14-19 (1999).</li><li>Ulmer, A. J., Scholz, W., Ernst, M., Brandt, E., Flad, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+(PBMC)+by+density+gradient+centrifugation+on+percoll.">Isolation and subfractionation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifugation on percoll.</a> Immunobiology. 166 (3), 238-250 (1984).</li><li>Fuss, I. J., Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+whole+mononuclear+cells+from+peripheral+blood+and+cord+blood.">Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood.</a> Curr Protoc Immunol. 7, 711-718 (2009).</li><li>Gautam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+gene+expression+profiles+of+whole+blood+and+peripheral+blood+mononuclear+cells+using+multiple+collection+and+processing+methods.">Investigating gene expression profiles of whole blood and peripheral blood mononuclear cells using multiple collection and processing methods.</a> PLoS One. 14 (12), e0225137 (2019).</li><li>Hamot, G., Ammerlaan, W., Mathay, C., Kofanova, O., Betsou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+validation+for+automated+isolation+of+viable+peripheral+blood+mononuclear+cells.">Method validation for automated isolation of viable peripheral blood mononuclear cells.</a> Biopreserv Biobank. 13 (3), 152-163 (2015).</li><li>Coppola, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+viable+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+biobanking+using+a+robotized+liquid+handling+workstation.">Purification of viable peripheral blood mononuclear cells for biobanking using a robotized liquid handling workstation.</a> J Transl Med. 17 (1), 371 (2019).</li><li> Stemcell Technologies. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vol.+27156.">Vol. 27156.</a> STEMCELL TECHNOLOGIES. , 1-4 (2020).</li><li>Hornschuh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+magnetic+sorting+preserves+the+functionality+of+ex+vivo+cultivated+non-adherent+human+monocytes.">Negative magnetic sorting preserves the functionality of ex vivo cultivated non-adherent human monocytes.</a> Biology (Basel). 11 (11), 1583 (2022).</li><li>Bhattacharjee, J., Das, B., Mishra, A., Sahay, P., Upadhyay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+isolated+by+positive+and+negative+magnetic+sorting+techniques+show+different+molecular+characteristics+and+immunophenotypic+behaviour.">Monocytes isolated by positive and negative magnetic sorting techniques show different molecular characteristics and immunophenotypic behaviour.</a> F1000Res. 6, 2045 (2017).</li><li>Ohlsson, S., Diedrich, B., Uhlin, M., Sandgren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+processing+for+pathogen+inactivation+of+double-dose+buffy-coat+platelet+concentrates:+Maintained+in+vitro+quality+over+7-day+storage.">Optimized processing for pathogen inactivation of double-dose buffy-coat platelet concentrates: Maintained in vitro quality over 7-day storage.</a> Vox Sang. 113 (7), 611-621 (2018).</li><li>Easysep direct human PBMC isolation kit for processing 100 mL buffy coat. Stemcell Technologies Available from: <a target="_blank" href="https://www.stemcell.com/products/brands/easysep-cell-separation.html">https://www.stemcell.com/products/brands/easysep-cell-separation.html</a> (2022)</li><li>Vi-cell XR cell viability analyzer instructions for use. Beckman Coulter Available from: <a target="_blank" href="https://mbcbiolabs.com/wp-content/uploads/2022/08/Beckman-Coulter-ViCell-Manual.pdf">https://mbcbiolabs.com/wp-content/uploads/2022/08/Beckman-Coulter-ViCell-Manual.pdf</a> (2017)</li><li>Fuchs, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+biobanking:+Employing+a+robotic+system+for+automated+mononuclear+cell+isolation.">Next-generation biobanking: Employing a robotic system for automated mononuclear cell isolation.</a> Biopreserv Biobank. 21 (1), 106-110 (2023).</li><li>Tigner, A., Ibrahim, S. A., Murray, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histology,+white+blood+cell.">Histology, white blood cell.</a> StatPearls Publishing. , (2024).</li><li>Mathay, C., Ammerlaan, W., Betsou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+buffy+coat+extract+on:+Methodology,+feasibility,+optimization,+and+validation+study.">Automatic buffy coat extract on: Methodology, feasibility, optimization, and validation study.</a> Biopreserv Biobank. 10 (6), 543-547 (2012).</li><li>Golke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delays+during+PBMC+isolation+have+a+moderate+effect+on+yield,+but+severly+compromise+cell+viability.">Delays during PBMC isolation have a moderate effect on yield, but severly compromise cell viability.</a> Clin Chem Lab Med. 60 (5), 701-706 (2022).</li><li>Yi, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+delayed+PBMC+processing+on+functional+and+genomic+assays.">Impact of delayed PBMC processing on functional and genomic assays.</a> J Immunol Methods. 519, 113514 (2023).</li><li>Mckenna, K. C., Beatty, K. M., Vicetti Miguel, R., Bilonick, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+processing+of+blood+increases+the+frequency+of+activated+CD11b++CD15++granulocytes+which+inhibit+t-cell+function.">Delayed processing of blood increases the frequency of activated CD11b+ CD15+ granulocytes which inhibit t-cell function.</a> J Immunol Methods. 341 (1-2), 68-75 (2009).</li><li>Mallone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+preservation+of+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+analysis+of+islet+antigen-reactive+t-cell+responses:+Position+statement+of+the+t-cell+workshop+committee+of+the+immunology+of+diabetes+society.">Isolation and preservation of peripheral blood mononuclear cells for analysis of islet antigen-reactive t-cell responses: Position statement of the t-cell workshop committee of the immunology of diabetes society.</a> Clin Exp Immunol. 163 (1), 33-49 (2011).</li><li>Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biospecimen+science+of+blood+for+peripheral+blood+mononuclear+cell+(PBMC)+functional+applications.">Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications.</a> Curr Pathobiol Rep. 7 (2), 17-27 (2019).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Le PBMC umane sono tipi cellulari versatili utilizzati per numerosi saggi; Tuttavia, la produttività dell'isolamento è spesso un limite in molti laboratori, comprese le biobanche16. In precedenza, la NSW Health Statewide Biobank ha isolato le PBMC utilizzando il metodo del gradiente di densità. L'automazione è stata studiata per il metodo di separazione a gradiente di densità per aumentare la capacità di elaborazione, ma sono stati identificati ostacoli all'implementazione, tra cui (i) il costo di un gestore di liquidi con un'unità di centrifugazione completamente automatizzata, con l'aggiunta del requisito di un'unità HEPA per produrre un prodotto sterile, (ii) personale addestrato per la programmazione e (iii) tempo necessario per i test del protocollo. Pertanto, questo studio ha esplorato metodi alternativi e ha identificato il kit PBMC umano ottenuto commercialmente che potrebbe essere utilizzato per l'elaborazione manuale e automatizzata. La sterilità è garantita in quanto l'attrezzatura necessaria per la lavorazione si inserisce all'interno di una cabina di sicurezza biologica standard (lunghezza di 1,2 m). Questo documento descrive in dettaglio le modifiche apportate al protocollo14 raccomandato dal produttore, per aumentare l'efficienza e ridurre i costi dei reagenti senza sacrificare la qualità. Inoltre, il protocollo del produttore è stato esteso per dettagliare i passaggi dei campioni della biobanca per la ricerca futura, tra cui il sangue intero (fase 1.2), il plasma (fase 2.2) e i globuli rossi (fase 2.5) che vengono aliquotati dalla provetta di sangue originale, nonché il conteggio delle cellule e la crioconservazione.
In questo studio, sono stati confrontati tre protocolli di isolamento PBMC: separazione del gradiente di densità, isolamento manuale e automatizzato basato su perline. Sono state apportate modifiche al protocollo manuale basato su microsfere del produttore, tra cui la rimozione della diluizione del buffy coat prima dell'isolamento della PBMC e l'eliminazione della necessità di interruzione per le centrifugazioni, consentendo ai ricercatori di seguire un protocollo di isolamento PBMC adattabile, economico e ad alto rendimento. In primo luogo, sono stati utilizzati otto campioni di sangue intero abbinati per isolare le PBMC per confrontare la separazione in gradiente di densità e la tecnica manuale basata su microsfere. È importante sottolineare che le distribuzioni della popolazione cellulare, la vitalità cellulare e il recupero delle PBMC non erano significativamente diversi tra i due metodi confrontati, come mostrato rispettivamente nella Figura 2A-F, nella Figura 3A e nella Figura 1 supplementare. Nei dati rappresentativi, la conta cellulare era più alta per il metodo di separazione in gradiente di densità utilizzando il metodo di esclusione del blu di tripano, ma non quando è stato utilizzato un analizzatore cellulare ematologico. Le impostazioni del tipo di cellula PBMC sul contatore di cellule utilizzavano un intervallo di diametro cellulare di 8-50 μm e, pertanto, i conteggi includeranno PBMC e granulociti (circa 12-15 μm di diametro) quando si utilizza il metodo di esclusione del blu di tripano17. Sebbene il contatore di cellule ematologiche offrisse una specificità più elevata rispetto al metodo di esclusione del blu di tripano, alcuni calcoli di recupero erano superiori al 100%, riflettendo il margine di errore dello strumento (vedere la Figura 1 supplementare). Si raccomanda pertanto agli investigatori di applicare una combinazione di tecniche di conteggio cellulare quando confrontano i rendimenti dei protocolli di isolamento PBMC, poiché la maggior parte delle tecniche non offre conteggi cellulari differenziali sia specifici che altamente sensibili. Inoltre, non sono stati eseguiti saggi per confrontare l'attività funzionale delle PBMC prodotte da entrambe le tecniche, il che è una limitazione della nostra analisi.
Successivamente, sono stati confrontati i metodi manuali e automatizzati basati su perline e non sono state identificate differenze significative tra la resa o la vitalità della PBMC da 8 campioni abbinati (Figura 4A, B). Le popolazioni cellulari non sono state confrontate individualmente, poiché per entrambi i metodi è stato utilizzato lo stesso cocktail di isolamento anticorpale. È importante sottolineare che il tempo di elaborazione manuale di 8 campioni è stato ridotto da 43 minuti a 22 minuti utilizzando il protocollo automatizzato (Figura 4C). Mentre la produttività, la prevenzione del burnout dei tecnici e la coerenza dell'elaborazione dei campioni sono garantite dall'automazione, il costo dei reagenti e dei materiali di consumo è significativamente più elevato, 3-4 volte superiore rispetto al metodo manuale basato su microsfere. Questo dopo aver apportato modifiche al protocollo del produttore per utilizzare 1 mL di buffy coat (da un volume di sangue intero di 10 mL) invece dell'intervallo raccomandato di 2-5 mL (da un volume di sangue intero di 10 mL e/o superiore). Se il budget è un limite, optare per il metodo manuale può ridurre i tempi di lavorazione del ~25%, mantenendo i costi dei reagenti e dei materiali di consumo paragonabili a quelli del metodo di separazione per densità. Si consiglia di elaborare non più di 8 campioni alla volta per tecnico per garantire un adeguato scaglionamento dei campioni (~30 s/campione) entro i periodi di incubazione di 5 minuti (passaggi 3.7, 3.11 e 3.14).
Sia nei metodi manuali che in quelli automatizzati basati su microsfere, la rimozione del buffy coat è un passaggio fondamentale per garantire un isolamento ottimale della PBMC. È importante notare che in questo protocollo viene utilizzato un buffy coat piuttosto che sangue intero poiché il volume dei reagenti si basa sui volumi del materiale di partenza10. Rimuovere efficacemente l'intero volume del buffy coat può essere tecnicamente impegnativo. Inizialmente, questo metodo prevedeva la rimozione di 0,5 ml di buffy coat, ma è stato aumentato a 1 ml per migliorare il recupero. Per garantire un recupero adeguato e coerente del buffy coat, la descrizione dettagliata di questo processo è importante nella documentazione del protocollo e nella formazione. Si raccomanda di agitare il puntale di una pipetta durante l'aspirazione del buffy coat, facendo attenzione a non aspirare troppi globuli rossi dallo strato sottostante (passaggio 2.3). È importante non saturare il cocktail di anticorpi che lega le cellule indesiderate (cioè i granulociti e i globuli rossi), che possono influire sulla resa e sulla purezza10. Per ridurre al minimo i globuli rossi raccolti durante l'estrazione del buffy coat, la punta della pipetta deve trovarsi tra il plasma e lo strato di buffy coat. Il volume del buffy coat può essere aumentato da 1 mL; tuttavia, è necessario prestare attenzione come descritto sopra per garantire che non più del 10% del volume raccolto contenga globuli rossi. In alternativa, è possibile utilizzare un manipolatore automatico di liquidi per raccogliere i buffy coat in modo coerente18. Tuttavia, le ore dedicate necessarie per calibrare e risolvere i problemi relativi ai protocolli degli strumenti per la manipolazione dei liquidi, soprattutto considerando la spesa, potrebbero non essere fattibili per la maggior parte dei laboratori.
La transizione e l'applicazione del protocollo basato su microsfere di automazione è stata essenziale dato l'obiettivo della NSW Health Statewide Biobank di elaborare 23.000 PBMC nei prossimi 3 anni. Qui, è stato dimostrato che le PBMC possono essere isolate da provette ACD fino a 9 giorni dalla raccolta con vitalità medie >70%. Sebbene le rese siano state ottimali 24 ore dopo la raccolta, l'elaborazione entro questo lasso di tempo non è sempre fattibile in quanto potrebbe essere necessario trasportare i campioni. È stato dimostrato che le PBMC isolate con il metodo manuale o automatizzato basato su microsfere possono avere rese di >3 x 105 cellule/mL di sangue intero se isolate entro 4 giorni dalla raccolta e di >1 x 105 cellule/mL di sangue intero se isolate entro 10 giorni dalla raccolta. Numeri bassi per campioni superiori a 5 giorni sono considerati una limitazione di questa analisi. Inoltre, i dati non sono stati separati in base all'età, al sesso e alla storia clinica dei partecipanti, poiché queste informazioni non sono state rese disponibili. Sebbene sia necessaria un'analisi comparativa per esaminare gli effetti dei ritardi nei tempi di elaborazione per entrambi i metodi, è stato precedentemente riportato che i ritardi nell'isolamento delle PBMC utilizzando il metodo del gradiente di densità riducono la qualità delle cellule e aumentano significativamente la contaminazione da globuli rossi19,20. Inoltre, le proporzioni dei granulociti aumentano se l'elaborazione viene ritardata e, quindi, i campioni di "età" simili dovrebbero essere raggruppati per le analisi a valle 20,21,22. Da notare che questo esperimento è stato eseguito utilizzando sangue anticoagulato con destrosio citrico acido (cioè citrato trisodico, acido citrico e destrosio); tuttavia, la resa e/o la proporzione dei tipi di cellule possono variare se vengono utilizzati altri anticoagulanti23; pertanto, si consiglia agli investigatori di scegliere un anticoagulante appropriato in base alle analisi PBMC a valle previste.
In sintesi, un protocollo per l'isolamento di PBMC che utilizza biglie magnetiche adattabile a flussi di lavoro ad alta produttività è dettagliato per soddisfare i requisiti di scalabilità senza compromettere la vitalità cellulare. Sia il metodo manuale che quello automatizzato possono essere ottimizzati per produrre concentrazioni cellulari specifiche modificando i volumi di avviamento e di risospensione. La NSW Health Statewide Biobank è passata dall'estrazione di ~60 PBMC al mese utilizzando la tradizionale tecnica di separazione a gradiente di densità a ~300 PBMC al mese utilizzando questo metodo basato su microsfere compatibile con l'automazione. Il prossimo obiettivo degli autori è quello di utilizzare la piattaforma automatizzata per elaborare fino a 1200 PBMC al mese e confrontare ulteriormente le PBMC isolate sia con tecniche basate su biglie magnetiche (manuali e automatizzate) che con tecniche di gradiente di densità per guidare l'implementazione di questa tecnica in altri laboratori con particolare attenzione alle biobanche.

L'isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) è una tecnica che separa e isola i linfociti e i monociti da altri costituenti del sangue intero. Le PBMC sono un tipo di cellula versatile utilizzato per numerose applicazioni, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, l'immunoterapia, lo sviluppo di vaccini, l'identificazione di bersagli o biomarcatori e lo sviluppo di farmaci anticorpi/piccole molecole 1,2. Queste cellule possono essere isolate da individui sani o malati e possono essere utilizzate immediatamente nei processi a valle o crioconservate per ricerche future3. In alcuni casi, lo scopo a valle è noto, mentre in altri, come è comune nel biobanking, le PBMC vengono isolate e conservateper future applicazioni non specificate.
La centrifugazione in gradiente di densità è la tecnica tradizionale per isolare le PBMC 5,6,7 dal sangue intero, utilizzando la separazione differenziale dei tipi di cellule costituenti in base alla densità cellulare durante la centrifugazione. Sebbene ci possano essere alcune variazioni in questo metodo, il sangue intero viene generalmente diluito con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), stratificato su un mezzo a gradiente di densità in una provetta da centrifuga specializzata o standard e quindi filato. Ne risultano quattro strati distinti: lo strato superiore del plasma è arricchito con piastrine, un sottile strato di PBMC è al di sopra del mezzo del gradiente di densità e, infine, lo strato inferiore è costituito da globuli rossi (RBC) e granulociti. Sebbene questo metodo sia stato precedentemente definito "il gold standard"8, ci sono limitazioni per lo scale-up, come il lungo tempo di elaborazione, la capacità della centrifuga, la difficoltà di aliquotare altri prodotti sanguigni (ad esempio, plasma e globuli rossi) e la laboriosità dell'automazione. Sebbene l'automazione sia possibile per questo metodo9, richiede una programmazione completa di un gestore di liquidi (con un modulo di centrifugazione completamente automatizzato) e rimarrebbe un processo lungo.
D'ora in poi, viene presentato un flusso di lavoro alternativo che utilizza la separazione di microsfere immunomagnetiche con un magnete a otto supporti per l'elaborazione manuale o uno strumento per l'elaborazione completamente automatizzata. Questo metodo utilizza un cocktail di anticorpi che viene aggiunto alle cellule e lega le popolazioni cellulari indesiderate, in questo caso piastrine, granulociti e globuli rossi. Queste popolazioni indesiderate vengono successivamente rimosse mediante separazione magnetica, lasciando le popolazioni di monociti e linfociti nella frazione negativa che sono pronte per l'elaborazione a valle10. Questo metodo di selezione negativa è più veloce dei metodi di selezione positiva che richiedono passaggi aggiuntivi per rimuovere l'anticorpo e il complesso di biglie magnetiche dalle PBMC. La selezione negativa è inoltre vantaggiosa in quanto è stata descritta come un modo per preservare la funzionalità cellulare11,12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell cryopreservation media CS10, 100 mL (CRYOSTOR)</td>
			<td>StemCellTM Technologies</td>
			<td>07930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo ScientififcTM</td>
			<td>51033311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell 1 mL FX</td>
			<td>BioTools</td>
			<td>BCS-407P</td>
			<td>This is the control rate freezing container used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water&#160;</td>
			<td>Bacto Laboratories</td>
			<td>561832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DxH 500 Hematology Analyzer&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>B40601</td>
			<td>Referred to as external automated cell counter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyEightsTM EasySepTM Magnet</td>
			<td>StemCellTM Technologies</td>
			<td>18103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySepTM Direct Human PBMC Isolation Kit</td>
			<td>StemCellTM Technologies</td>
			<td>19654</td>
			<td>Kit includes the magnetic bead tube and the cocktail mix tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>E6758-500G</td>
			<td>Instructions to make 0.1M EDTA solution from EDTA salt is located in supplemental file 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LymphoprepTM Density Gradient Medium</td>
			<td>StemCellTM Technologies</td>
			<td>7851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megafuge ST4 Plus Centrifuge</td>
			<td>Thermo ScientififcTM</td>
			<td>THR75009903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orion Star A211 pH meter electrode</td>
			<td>Thermo ScientififcTM</td>
			<td>STARA2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orion&#8482; ROSS Ultra&#8482; Glass Triode&#8482; pH/ATC Combination Electrodes</td>
			<td>Thermo ScientififcTM</td>
			<td>8302BNURCA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), solution, 1X, 500ml</td>
			<td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RoboSepTM Buffer 1X</td>
			<td>StemCellTM Technologies</td>
			<td>20104</td>
			<td>Software used for statistical analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RoboSepTM-S</td>
			<td>StemCellTM Technologies</td>
			<td>21000</td>
			<td>Fully automated cell separator instrument.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RoboSep&#8482; Filter Tips</td>
			<td>StemCellTM Technologies</td>
			<td>20125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SepMateTM-50 (IVD) tubes</td>
			<td>StemCellTM Technologies</td>
			<td>85460</td>
			<td>IVD - In vitro diagnostics. Also known as SepMateTM-50 tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-CELL XR Cell Anlayzer</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>Internal automated cell counter. Instrument obsolete and no longer available for purchase (as of December 31, 2022). Alternative instrument is the ViCell BLU Cell Viability Analyzer (Product no. C19196).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-CELL XR Quad Pack Reagent Kit</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>383722</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating human peripheral blood mononuclear cells from buffy coats via high throughput immunomagnetic bead separation

Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono una popolazione eterogenea di monociti e linfociti. Le PBMC crioconservate hanno una vitalità stabile nella conservazione a lungo termine, il che le rende un tipo di cellula ideale per molti scopi di ricerca a valle, tra cui la citometria a flusso, i saggi immunologici e il sequenziamento del genoma. In genere, le PBMC vengono isolate tramite centrifugazione in gradiente di densità, tuttavia si tratta di un flusso di lavoro a basso rendimento che è difficile e costoso da scalare. Questo articolo presenta un flusso di lavoro ad alta produttività utilizzando un metodo di isolamento PBMC basato su biglie magnetiche che è rapido da implementare. Sono state confrontate la concentrazione totale delle cellule, la vitalità e la distribuzione della popolazione con le PBMC ottenute utilizzando l'isolamento del gradiente di densità, e la vitalità cellulare e la proporzione dei tipi di cellule erano comparabili per entrambe le tecniche. Le PBMC isolate hanno dimostrato una vitalità superiore al 70% fino a 9 giorni dopo il prelievo del sangue, sebbene la resa sia diminuita della metà dopo 5 giorni rispetto alle PBMC trattate entro 24 ore dal prelievo. In sintesi, questo articolo descrive un protocollo PBMC che utilizza un approccio basato su microsfere per adattarsi a un flusso di lavoro ad alta produttività e dimostra che sia i metodi manuali che quelli automatizzati basati su perline possono aumentare la capacità di elaborazione e fornire flessibilità per vari budget.

Le proporzioni di linfociti, monociti, neutrofili, eosinofili e basofili pre- (cioè nel sangue intero) e post-isolamento di PBMC sono state misurate quando le PBMC sono state isolate utilizzando il metodo di separazione a gradiente di densità o basato su microsfere. Le proporzioni di linfociti e monociti sono state significativamente arricchite da entrambi i metodi (Figura 2A, B). Inoltre, le proporzioni di neutrofili, eosinofili e basofili (cioè granulociti) erano significativamente diminuite nelle PBMC isolate con il metodo basato su perline (Figura 2C-F). Non ci sono state differenze significative nelle proporzioni di linfociti, monociti, neutrofili, eosinofili, basofili e granulociti tra i metodi basati sul gradiente di densità e quelli basati su perline (Figura 2). La percentuale di recupero è stata calcolata in aggiunta per i tipi di cellule sopra elencati (vedi Figura 1 supplementare). La vitalità cellulare media era superiore al 95% per entrambi i metodi e non era significativamente diversa (Figura 3A). Le PBMC sono state contate anche utilizzando un intervallo di dimensioni (diametro) compreso tra 8 μm e 50 μm, mentre il metodo di separazione in gradiente di densità ha prodotto un numero totale di cellule circa due volte superiore (Figura 3B). 
Successivamente, il metodo automatizzato basato su perline è stato confrontato con il metodo manuale. Non sono state identificate differenze significative per la vitalità cellulare (Figura 4A) o la conta cellulare totale (Figura 4B) utilizzando il metodo manuale o automatizzato. È stato confrontato il tempo necessario per elaborare questi 8 campioni, compreso il tempo di non intervento umano che non richiede alcun intervento umano. Il tempo totale di elaborazione di 8 campioni è stato di 43 minuti vs. 57 minuti per il manuale vs. il metodo automatizzato. Il metodo automatizzato includeva 35 minuti di elaborazione a mani libere (Figura 4C).
Il flusso di lavoro basato su microsfere di isolamento di PBMC (con aliquotazione di sangue intero e plasma) è stato testato per 9 mesi, in base al quale 1410 campioni di PBMC sono stati isolati da sangue umano non sottoposto a screening utilizzando la piattaforma manuale per i primi 820 partecipanti e quindi utilizzando il metodo automatizzato per i successivi 590 partecipanti. L'elaborazione è stata eseguita lo stesso giorno o fino a 10 giorni dopo la raccolta secondo i criteri di accettazione dello studio, con ritardi nell'elaborazione in gran parte dovuti ai tempi di transito del campione. Con il metodo manuale o automatizzato, le PBMC elaborate entro 24 ore dalla raccolta hanno avuto la massima vitalità e recupero (Figura 5). La vitalità cellulare media è stata del >90% per le PBMC trattate entro 5 giorni e del >70% per le PBMC trattate entro 10 giorni (Figura 5A). Le rese medie di PBMC sono diminuite del 50% dopo 5 giorni rispetto ai campioni processati entro 24 ore (Figura 5B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig01.jpg"> Figura 1: Flusso di lavoro schematico del protocollo di isolamento PBMC basato su perline da buffy coat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig02.jpg"> Figura 2: Proporzioni di linfociti, monociti, neutrofili, eosinofili, basofili e granulociti nel sangue intero prima e dopo l'isolamento di PBMC mediante gradiente di densità e metodi basati su sfere. Percentuale di linfociti (A), monociti (B), neutrofili (C), eosinofili (D), basofili (E) e granulociti (F) nel sangue intero abbinato prima dell'isolamento (quadrati) e nelle PBMC dopo l'isolamento tramite il metodo del gradiente di densità (cerchi aperti) o basato su perline (cerchi chiusi) (n = 8). ns = non significativo e *p < 0,05 come determinato dall'ANOVA unidirezionale (A e B) o dal test di Friedman (C- F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig03.jpg"> Figura 3: Vitalità e conta totale delle cellule di PBMC isolate mediante gradiente di densità e metodi basati su microsfere. (A) Vitalità cellulare media (± SD) per campioni processati utilizzando il gradiente di densità (quadrati, barra scura) vs. Metodi basati su perline (cerchi, barra aperta) per 8 campioni accoppiati. ns = non significativo dal test t accoppiato. (B) Conta totale delle cellule per i campioni processati utilizzando il gradiente di densità (quadrati, barra scura) rispetto a Metodi basati su perline (cerchi, barra aperta) per 8 campioni accoppiati. *P < 0,05 determinato utilizzando un test T accoppiato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig04.jpg"> Figura 4: Confronto tra metodi manuali e automatizzati basati su microsfere. (A) Vitalità cellulare media (± SD) per campioni trattati manualmente (quadrati, barra scura) rispetto a Metodi automatizzati (cerchi, barra aperta) basati su perline per 8 campioni accoppiati. ns = non significativo secondo il test di Mann-Whitney. (B) Conteggio totale delle cellule per i campioni elaborati utilizzando i manuali (quadrati) vs. Metodi automatizzati (cerchi) basati su perline per 8 campioni accoppiati. ns = non significativo dal test t accoppiato. (C) Tempo di elaborazione per 8 campioni elaborati utilizzando il manuale vs. Metodi automatizzati, inclusi periodi di tempo hands-on (barra luminosa) e hands-off (barra scura). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig05.jpg"> Figura 5: Vitalità e resa della PBMC isolata dal metodo basato su microsfere manualmente o utilizzando l'automazione in base al tempo che intercorre tra la raccolta del campione e la conservazione della PBMC. (A) Vitalità cellulare media (± IC 95%) per i campioni partecipanti trattati utilizzando il manuale (barra scura) vs. Metodi automatizzati (barra aperta) basati su perline. Tabella con i numeri dei partecipanti. ns = non significativo. Na = non applicabile. *p < 0,05 secondo il test di confronto multiplo di Tukey. (B) Conta totale delle cellule per i campioni dei partecipanti elaborati utilizzando il manuale (barra scura) rispetto a Metodi automatizzati (barra aperta) basati su perline. Tabella con i numeri dei partecipanti. ns = non significativo. Na = non applicabile. *p < 0,05 secondo il test di confronto multiplo di Tukey. Nessun valore per il giorno 10 automatizzato a causa del numero di replica inferiore a 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Figura supplementare 1: Figura del recupero percentuale differenziale delle celle con il gradiente di densità e i metodi basati su perline. La percentuale è stata calcolata utilizzando la conta cellulare assoluta pre-isolamento nel sangue intero e la sospensione cellulare post-isolamento utilizzando il metodo del gradiente di densità (quadrati, barra scura) e il metodo basato su perline (cerchi, barra aperta) (n = 8). ns = non significativo e *p < 0,05 come determinato dal test t non appaiato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 1: Protocollo del gradiente di densità. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/Supplementary%20File%201_editedv2.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 2: Preparazione di EDTA 0,1 M, pH 8,0 in PBS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/Supplementary%20File%202_editedv2.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 3: Procedure dettagliate eseguite per generare i dati rappresentativi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/Supplementary%20File%203_editedv2.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Autore in primo piano: Progressi nell'isolamento delle PBMC - Miglioramento della produttività e della coerenza nella ricerca

Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo compatibile con l'automazione ad alto rendimento per isolare cellule mononucleate del sangue periferico umano per la biobanca e altri scopi.

Isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico umano da Buffy Coats tramite separazione di microsfere immunomagnetiche ad alto rendimento

Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are a heterogeneous population of monocytes and lymphocytes. Cryopreserved PBMCs have stable viability in ...

isolating-human-peripheral-blood-mononuclear-cells-from-buffy-coats

Research

JoVE Journal

Biology

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells from Buffy Coats via High Throughput Immunomagnetic Bead Separation

2.2K Views.  New South Wales Health Pathology. L'isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico, note anche come PBMC, è in genere un processo lungo e manuale. Abbiamo visto un metodo alternativo che sarebbe stato veloce da implementare e in grado di elaborare un numero elevato di campioni. Il nostro protocollo offre un metodo automatizzato ad alta produttività, garantendo la coerenza e prevenendo il burnout dei tecnici.Descriviamo anche il nostro metodo compatibile con l'automazione...

Video: Autore in primo piano: Progressi nell'isolamento delle PBMC - Miglioramento della produttività e della coerenza nella ricerca

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolamento e la coltura di cellule endoteliali polmonari da topi neonati

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Ricerca

Biologia

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

Generazione di cellule pluripotenti indotte umane staminali da sangue periferico mediante il STEMCCA lentivirale Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

Generazione di immunoprecipitazione della cromatina Template DNA di alta qualità per high-throughput sequencing (ChIP-Seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Screening ad alto rendimento per i modulatori chimici di Genes post-trascrizionale regolamentati

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

L&#39;isolamento di mitocondri da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per misurazioni High Throughput micropiastre respiratorie

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular mechanisms underlying endothelial dysfunction in these individuals. However, the recent identification of blood outgrowth endothelial cells (BOECs), generated from circulating endothelial progenitors in adult peripheral blood, may circumvent this limitation by offering an endothelial-like, primary cell surrogate for patient-derived endothelial cells. Beyond their value to understanding endothelial biology and disease modeling, BOECs have potential uses in endothelial cell transplantation therapies. They are also a suitable cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) via nuclear reprogramming, offering a number of advantages over other cell types. We describe a method for the reliable generation, culture and characterization of BOECs from adult peripheral blood for use in these and other applications. This approach (i) allows for the generation of patient-specific endothelial cells from a relatively small volume of adult peripheral blood and (ii) produces cells that are highly similar to primary endothelial cells in morphology, cell signaling and gene expression.

This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.

Generazione e Cultura Sangue escrescenza endoteliali cellule da sangue periferico umano

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived microvesicles (MVs, diameter &#62; 100 nm) is a fundamental cellular process that occurs in all living cells. These vesicles transport proteins, lipids and nucleic acids specific for their cell of origin and in vitro studies have highlighted their importance as mediators of intercellular communication. EVs have been successfully isolated from various body fluids and especially EVs in blood have been identified as promising biomarkers for cancer or infectious diseases. In order to allow the study of MV subpopulations in blood, we present a protocol for the standardized isolation and characterization of MVs from peripheral blood samples. MVs are pelleted from EDTA-anticoagulated plasma samples by differential centrifugation and typically possess a diameter of 100 - 600 nm. Due to their larger size, they can easily be studied by flow cytometry, a technique that is routinely used in clinical diagnostics and available in most laboratories. Several examples for quality control assays of the isolated MVs will be given and markers that can be used for the discrimination of different MV subpopulations in blood will be presented.

Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.

Isolamento e caratterizzazione di microvescicole da sangue periferico

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry

Many biological cells/tissues sense the mechanical properties of their local environments via mechanoreceptors, proteins that can respond to forces like pressure or mechanical perturbations. Mechanoreceptors detect their stimuli and transmit signals via a great diversity of mechanisms. Some of the most common roles for mechanoreceptors are in neuronal responses, like touch and pain, or hair cells which function in balance and hearing. Mechanosensation is also important for cell types which are regularly exposed to shear stress such as endothelial cells, which line blood vessels, or blood cells which experience shear in normal circulation. Viscometers are devices that detect the viscosity of fluids. Rotational viscometers may also be used to apply a known shear force to fluids. The ability of these instruments to introduce uniform shear to fluids has been exploited to study many biological fluids including blood and plasma. Viscometry may also be used to apply shear to the cells in a solution, and to test the effects of shear on specific ligand-receptor pairs. Here, we utilize cone-plate viscometry to test the effects of endogenous levels of shear stress on platelets treated with antibodies against the platelet mechanosensory receptor complex GPIb-IX.

We describe an in-solution method to apply uniform shear to platelet surface receptors using cone-plate viscometry. This method may also be used more broadly to apply shear to other cell types and cell-fragments and need not target a specific ligand-receptor pair.

Un saggio di taglio uniforme per piastrine umane e recettori superficiali delle cellule tramite viscometria conica

Many biological cells/tissues sense the mechanical properties of their local environments via mechanoreceptors, proteins that can respond to forces like ...

Isolation of Human Neutrophils from Whole Blood and Buffy Coats

Neutrophils (PMNs) are the most abundant leukocytes in human circulation, ranging from 40 to 70% of total blood leukocytes. They are the first cells recruited at the site of inflammation via rapid extravasation through vessels. There, neutrophils perform an array of functions to kill invading pathogens and mediate immune signaling. Freshly purified neutrophils from human blood are the model of choice for study, as no cell line fully replicates PMN functions and biology. However, neutrophils are short-lived, terminally differentiated cells and are highly susceptible to activation in response to physical (temperature, centrifugation speed) and biological (endotoxin, chemo- and cytokines) stimuli. Therefore, it is crucial to follow a standardized, reliable, and fast method to obtain pure and non-activated cells. This protocol presents an updated protocol combining density gradient centrifugation, red blood cell (RBC) sedimentation, and RBC lysis to obtain high PMN purity and minimize cell activation. Furthermore, methods to assess neutrophil isolation quality, viability, and purity are also discussed.

This protocol details a method for the isolation of neutrophils from whole blood, buffy coats, or leukapheresis membranes, achieving good yield, high purity, and minimal cell activation. We utilize gradient purification, red blood cell (RBC) sedimentation, and RBC lysis to obtain a high-quality/purity neutrophil preparation.

Isolamento dei neutrofili umani da Whole Blood e Buffy Coats

Neutrophils (PMNs) are the most abundant leukocytes in human circulation, ranging from 40 to 70% of total blood leukocytes. They are the first cells ...

Profilazione del trascrittoma per lo screening di farmaci ad alto rendimento

Cost-Efficient Transcriptomic-Based Drug Screening

Transcriptomics allows&#160;to obtain comprehensive insights into cellular programs and their responses to perturbations. Despite a significant decrease in the costs of library production and sequencing in the last decade, applying these technologies at the scale necessary for drug screening remains prohibitively expensive, obstructing the immense potential of these methods. Our study presents a cost-effective system for transcriptome-based drug screening, combining miniaturized perturbation cultures with mini-bulk transcriptomics. The optimized mini-bulk protocol provides informative biological signals at cost-effective sequencing depth, enabling extensive screening of known drugs and new molecules. Depending on the chosen treatment and incubation time, this protocol will result in sequencing libraries within approximately 2 days. Due to several stopping points within this protocol, the library preparation, as well as the sequencing, can be performed time-independently. Processing simultaneously a high number of samples is possible; measurement of up to 384 samples was tested without loss of data quality. There are also no known limitations to the number of conditions and/or drugs, despite considering variability in optimal drug incubation times.

Autore in primo piano: Screening farmacologico trascrittomico a costi contenuti - Sbloccare nuovi bersagli 

This protocol describes a workflow from ex vivo or in vitro cell cultures to transcriptomic data pre-processing for cost-effective transcriptome-based drug screening.

Screening farmacologico basato sulla trascrittomica efficiente in termini di costi

Transcriptomics allows&#160;to obtain comprehensive insights into cellular programs and their responses to perturbations. Despite a significant decrease ...