新南威尔士州卫生局全州生物样本库感谢新南威尔士州卫生病理学、新南威尔士州卫生和医学研究办公室以及悉尼地方卫生区的支持。此外，作者非常感谢 Omico 和新南威尔士州卫生部全州生物样本库支持的其他研究，感谢他们允许发布内部生成的数据并将未使用的标本用于研究目的。作者感谢 Jennifer Bryne 教授（悉尼大学新南威尔士州健康病理学）的重要领导和讨论。 图 1 是使用 BioRender.com 创建的。

质量控制血液标本和内部生成的数据（例如细胞计数、活力和处理时标本的年龄）来自皇家阿尔弗雷德王子医院新南威尔士州卫生全州生物银行的同意研究（HREC 批准：2019/ETH06776）。在 EDTA 管中收集经过处理（即血浆耗尽）、未筛查和去识别化的成人血液样本。这些质控血液标本在采集后不到 72 小时内进行处理，并用于比较密度梯度和基于磁珠的方法的 PBMC 分离实验。有关代表性结果中使用的密度梯度分离方法，请参见 补充文件 1 中的程序。用于本研究的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。
1. 全血制备
<ol><li>在室温下轻轻倒置 10 mL 全血管（包被乙二胺四乙酸 [EDTA]、酸-柠檬酸盐-葡萄糖 [ACD] 或肝素锂）10 次。</li>
	<li>可选：如果要储存全血，请分装到冻存管中，在 -80 °C 下储存。</li>
	<li>使用水平转子在 22 °C 下以 800 x g 离心试管 10 分钟，同时打开制动器（9 加速/9 减速）。</li>
</ol>2. Buffy 外套系列
<ol><li>离心后，将样品放入生物安全柜中，检查三个不同的层（如图 1 所示）。 注意：红细胞位于离心管的下部深红色层中。包含白细胞和血小板的白色不透明层位于 RBC 层上方，称为血沉棕黄层。顶部黄色层包含等离子体。</li>
	<li>可选：如果要储存血浆，请将血浆分装到冻存管中，在 -80 °C 下储存。</li>
	<li>从 10 mL 采血管中吸取 1 mL 血沉棕黄层（起始材料），然后转移到分别在步骤 3.1 和步骤 4.1 中指定和标记的试管中，用于手动和自动方法。使用移液器吸头旋转血沉棕黄层（白色不透明层），并通过吸出收集血沉棕黄层。 注：抽吸过程中血浆和红细胞少于 100 μL 是可以接受的。如果为一名参与者收集了多支血管，则可以合并血沉棕黄层;但是，这可能会影响血小板浓度13。</li>
	<li>对于手动处理，请继续执行第 3 部分。对于自动处理，请继续执行第 4 部分。</li>
	<li>可选：如果要储存红细胞，请将红细胞分装到冻存管中，在 -80 °C 下储存。</li>
</ol>3. PBMC 纯化 - 手动方法
注：每个磁体架最多可由一名操作员处理 8 个样品。
<ol><li>用字母 A-C 标记 3 x 5 mL 聚苯乙烯管。 注：如果执行多个样品，即 1A、1B、1C、2A、2B、2C，请使用顺序编号。</li>
	<li>将 60 μL 的 0.1 M EDTA（EDTA 终浓度为 6 mM，pH 值为 8.0，参见 配方补充文件 2 ）添加到包含步骤 2.3 中转移的血沉棕黄层的试管 A 中。</li>
	<li>将 50 μL 鸡尾酒混合管（参见 材料表）添加到管 A 中，通过上下吹打至少 3 次混合，并在室温下孵育 5 分钟。</li>
	<li>将 890 μL PBS 添加到试管 A 中，并通过上下吹打至少 3 次进行混合。</li>
	<li>涡旋磁珠管（参见材料表）30 秒。</li>
	<li>将 50 μL 磁珠添加到试管 A 中，并通过上下吹打至少 3 次进行混合。</li>
	<li>立即将试管 A 放入磁架中，并在室温下孵育 5 分钟。</li>
	<li>小心地将富集的细胞悬液移液到试管 B 中，收集不含/少量 （<100 μL） RBC 的透明组分，以实现最佳的 PBMC 回收率。 注意：请勿打扰绑定到磁铁上的磁珠。建议使用移液管。</li>
	<li>从磁铁架上取下管 A 并丢弃。</li>
	<li>将 50 μL 磁珠添加到试管 B 中的细胞悬液中，并通过上下吹打至少 3 次混匀。</li>
	<li>立即将试管 B 放入磁架中，并在室温下孵育 5 分钟。</li>
	<li>小心地将富集的细胞悬液移液到管 C 中，仅收集透明组分。 注意：请勿打扰绑定到磁铁上的磁珠。建议使用移液管。</li>
	<li>从磁铁架上取下管 B 并丢弃。</li>
	<li>立即将试管 C 放入磁架中，并在室温下孵育 5 分钟。</li>
	<li>小心地将富集的细胞悬液移液到标记的离心管中，并用 PBS 加满至 2 mL。</li>
	<li>将 50 μL 细胞悬液转移至自动细胞计数仪的样品杯中。对于 1：10 稀释的细胞计数，添加 450 μL PBS。继续第 5 节了解细胞计数步骤。</li>
</ol>4. PBMC 纯化 - 自动化方法
注： 一台自动化 PBMC 仪器最多可处理 4 个样品。单个操作员可以并行运行多台仪器。
<ol><li>用字母 A 和 B 标记 2 x 14 mL 离心管，用字母 C 标记 1 x 50 mL 离心管，用“废液”标记 1 x 50 mL 离心管。 注：在自动化 PBMC 仪器上每次运行只需要一个废液容器。如果执行多个样品，请使用 Sequences，即 1A、1B、1C、2A、2B、2C。</li>
	<li>将 60 μL 的 0.1 M EDTA（最终 EDTA 浓度为 6 mM）添加到包含步骤 2.3 中转移的血沉棕黄层的试管 A 中。</li>
	<li>涡旋磁珠管（参见材料表） 30 s。</li>
	<li>通过打开仪器前部的电源来打开自动 PBMC 仪器。</li>
	<li>在自动 PBMC 仪器主屏幕上，选择 Profile（ 配置文件 ）并选择所需的方案。 注： EasySep Direct 人 PBMC 分离 19654 - 血沉棕黄层 是为此 PBMC 分离选择的方案配置文件。请参阅协议报告14 中此配置文件的制造商标准程序。</li>
	<li>输入起始体积（吸入试管 A 中的血沉棕黄层量），并对每个样品重复上述步骤。</li>
	<li>选择将使用相同试剂盒的所有象限。 注：如果对多个象限使用相同的方案，自动 PBMC 仪器将建议对所有象限14 使用相同的试剂盒。</li>
	<li>将带标签的耗材、滤光片吸头和缓冲液容器装入仪器的转盘中。包含磁珠管和混合物管的试剂盒将加载到象限 1 中。 注：仪器将询问用户是否希望对所有象限使用 1 个试剂盒。选择“是”并使用试剂盒突出显示所有象限。</li>
	<li>上样完成后，取下耗材和试剂的盖子，然后在仪器屏幕上选择运行。</li>
	<li>运行完成后，从仪器转盘中选择 卸载 和取出样品（包含试管 C 中标记的 PBMC 悬浮液）。将磁珠管、混合物管和缓冲容器储存在 4 °C 下。 丢弃标记为 A、B 和废液的试管（参见步骤 4.1）和过滤吸头。 注：自动化方法无需加注 PBS，因为 PBMC 悬浮液产生的最终体积为 7 mL。</li>
	<li>将 500 μL 细胞转移到样品杯中，进行不稀释细胞计数。继续第 5 部分进行细胞计数。</li>
</ol>5. 细胞计数
<ol><li>按照制造商的说明15 使用台盼蓝染料排除法进行细胞计数和活力。 注：对于作者的内部过程，使用具有以下设置的自动细胞计数器进行细胞分析，以获取 PBMC。 稀释因子 = 10（对于手动方案，如果细胞悬液体积较低）或 1（对于自动方案） 细胞类型：PBMC 浓度范围 = 5 x 104 至 1 x 107 个细胞/mL 尺寸范围（直径）= 8 μm 至 50 μm 图像数量 = 50</li>
</ol>6. 冻存制备
<ol><li>在22°C下以300 x g 离心（使用摆动桶转子）样品管8分钟，同时打开制动器（9加速/ 9减速）。</li>
	<li>离心后，将样品放回生物安全柜中。</li>
	<li>使用移液管小心去除上清液。PBMC 沉淀可以留下少量上清液，以确保其不受干扰。</li>
	<li>将沉淀重悬于 3 mL 冷冻存培养基中。缓慢而轻柔地上下混合悬浮液，直到均匀。 注：Cyropreservation 培养基的体积可以根据所需的最终 PBMC 浓度进行调整。</li>
	<li>将 1 mL 重悬的 PBMC 分配到预先分配的冻存管中，并将其置于控制速率冷冻容器中，在 -80 °C 下至少 4 小时。 注意：等分到每个冷冻管的 PBMC 的体积可以根据研究者的偏好进行调整。</li>
	<li>将冻存管在 -80 °C 下存放至少 4 小时后，将冻存管转移到液氮气相罐中进行长期储存。</li>
</ol>7. 统计数据分析
<ol><li>使用 补充文件 3 中指定的统计和绘图软件分析代表性结果数据。</li>
</ol>

使用 Immunomagnetic Beads 进行高通量 PBMC 分离

<ol>
	<li>Alexovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+peripheral+blood+mononuclear+cells:+A+review+of+recent+proteomic+applications.">Human peripheral blood mononuclear cells: A review of recent proteomic applications.</a> Proteomics. 22 (15-16), e2200026 (2022).</li><li>Zhang, M., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multi-differentiation+potential+of+peripheral+blood+mononuclear+cells.">The multi-differentiation potential of peripheral blood mononuclear cells.</a> Stem Cell Res Ther. 3 (6), 48 (2012).</li><li>Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+leukocyte+subsets+from+fresh+and+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+clinical+research.">Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research.</a> Cryo Lett. 33 (5), 376-384 (2012).</li><li>Kleeberger, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+and+recovery+of+peripheral+blood+mononuclear+cells+cryopreserved+for+up+to+12+years+in+a+multicenter+study.">Viability and recovery of peripheral blood mononuclear cells cryopreserved for up to 12 years in a multicenter study.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 6 (1), 14-19 (1999).</li><li>Ulmer, A. J., Scholz, W., Ernst, M., Brandt, E., Flad, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+(PBMC)+by+density+gradient+centrifugation+on+percoll.">Isolation and subfractionation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifugation on percoll.</a> Immunobiology. 166 (3), 238-250 (1984).</li><li>Fuss, I. J., Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+whole+mononuclear+cells+from+peripheral+blood+and+cord+blood.">Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood.</a> Curr Protoc Immunol. 7, 711-718 (2009).</li><li>Gautam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+gene+expression+profiles+of+whole+blood+and+peripheral+blood+mononuclear+cells+using+multiple+collection+and+processing+methods.">Investigating gene expression profiles of whole blood and peripheral blood mononuclear cells using multiple collection and processing methods.</a> PLoS One. 14 (12), e0225137 (2019).</li><li>Hamot, G., Ammerlaan, W., Mathay, C., Kofanova, O., Betsou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+validation+for+automated+isolation+of+viable+peripheral+blood+mononuclear+cells.">Method validation for automated isolation of viable peripheral blood mononuclear cells.</a> Biopreserv Biobank. 13 (3), 152-163 (2015).</li><li>Coppola, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+viable+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+biobanking+using+a+robotized+liquid+handling+workstation.">Purification of viable peripheral blood mononuclear cells for biobanking using a robotized liquid handling workstation.</a> J Transl Med. 17 (1), 371 (2019).</li><li>Stemcell Technologies. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 27156, (2020).</li><li>Hornschuh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+magnetic+sorting+preserves+the+functionality+of+ex+vivo+cultivated+non-adherent+human+monocytes.">Negative magnetic sorting preserves the functionality of ex vivo cultivated non-adherent human monocytes.</a> Biology (Basel). 11 (11), 1583 (2022).</li><li>Bhattacharjee, J., Das, B., Mishra, A., Sahay, P., Upadhyay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+isolated+by+positive+and+negative+magnetic+sorting+techniques+show+different+molecular+characteristics+and+immunophenotypic+behaviour.">Monocytes isolated by positive and negative magnetic sorting techniques show different molecular characteristics and immunophenotypic behaviour.</a> F1000Res. 6, 2045 (2017).</li><li>Ohlsson, S., Diedrich, B., Uhlin, M., Sandgren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+processing+for+pathogen+inactivation+of+double-dose+buffy-coat+platelet+concentrates:+Maintained+in+vitro+quality+over+7-day+storage.">Optimized processing for pathogen inactivation of double-dose buffy-coat platelet concentrates: Maintained in vitro quality over 7-day storage.</a> Vox Sang. 113 (7), 611-621 (2018).</li><li>Easysep direct human PBMC isolation kit for processing 100 mL buffy coat. Available from: <a target="_blank" href="https://www.stemcell.com/products/brands/easysep-cell-separation.html">https://www.stemcell.com/products/brands/easysep-cell-separation.html</a> (2022)</li><li>. Vi-cell XR cell viability analyzer instructions for use Available from: <a target="_blank" href="https://mbcbiolabs.com/wp-content/uploads/2022/08/Beckman-Coulter-ViCell-Manual.pdf">https://mbcbiolabs.com/wp-content/uploads/2022/08/Beckman-Coulter-ViCell-Manual.pdf</a> (2017)</li><li>Fuchs, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+biobanking:+Employing+a+robotic+system+for+automated+mononuclear+cell+isolation.">Next-generation biobanking: Employing a robotic system for automated mononuclear cell isolation.</a> Biopreserv Biobank. 21 (1), 106-110 (2023).</li><li>Tigner, A., Ibrahim, S. A., Murray, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histology, white blood cell. , (2024).</li><li>Mathay, C., Ammerlaan, W., Betsou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+buffy+coat+extract+on:+Methodology,+feasibility,+optimization,+and+validation+study.">Automatic buffy coat extract on: Methodology, feasibility, optimization, and validation study.</a> Biopreserv Biobank. 10 (6), 543-547 (2012).</li><li>Golke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delays+during+PBMC+isolation+have+a+moderate+effect+on+yield,+but+severly+compromise+cell+viability.">Delays during PBMC isolation have a moderate effect on yield, but severly compromise cell viability.</a> Clin Chem Lab Med. 60 (5), 701-706 (2022).</li><li>Yi, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+delayed+PBMC+processing+on+functional+and+genomic+assays.">Impact of delayed PBMC processing on functional and genomic assays.</a> J Immunol Methods. 519, 113514 (2023).</li><li>Mckenna, K. C., Beatty, K. M., Vicetti Miguel, R., Bilonick, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+processing+of+blood+increases+the+frequency+of+activated+CD11b++CD15++granulocytes+which+inhibit+t-cell+function.">Delayed processing of blood increases the frequency of activated CD11b+ CD15+ granulocytes which inhibit t-cell function.</a> J Immunol Methods. 341 (1-2), 68-75 (2009).</li><li>Mallone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+preservation+of+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+analysis+of+islet+antigen-reactive+t-cell+responses:+Position+statement+of+the+t-cell+workshop+committee+of+the+immunology+of+diabetes+society.">Isolation and preservation of peripheral blood mononuclear cells for analysis of islet antigen-reactive t-cell responses: Position statement of the t-cell workshop committee of the immunology of diabetes society.</a> Clin Exp Immunol. 163 (1), 33-49 (2011).</li><li>Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biospecimen+science+of+blood+for+peripheral+blood+mononuclear+cell+(PBMC)+functional+applications.">Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications.</a> Curr Pathobiol Rep. 7 (2), 17-27 (2019).</li></ol>

作者声明没有利益冲突。

人 PBMC 是用于多种检测的多功能细胞类型;然而，在许多实验室（包括生物样本库）中，分离通量通常是一个限制16。以前，新南威尔士州卫生局全州生物样本库使用密度梯度法分离 PBMC。对密度梯度分离方法的自动化进行了研究，以提高处理能力，但确定了实施障碍，包括 （i） 带有离心装置的液体处理器的成本是完全自动化的，并且需要 HEPA 装置来生产无菌产品，（ii） 训练有素的编程人员，以及 （iii） 方案测试所需的时间。因此，本研究探索了替代方法，并确定了可用于手动和自动处理的市售人 PBMC 试剂盒。由于处理所需的设备适合标准（长度为 1.2 m）生物安全柜，因此可确保无菌。本文详细介绍了对制造商推荐的方案14 所做的修改，以便在不牺牲质量的情况下提高效率并降低试剂成本。此外，制造商的方案还扩展到了用于未来研究的生物样本库样本的详细步骤，包括从原始采血管中分装的全血（步骤 1.2）、血浆（步骤 2.2）和红细胞（步骤 2.5），以及细胞计数和冻存。
在本研究中，比较了三种 PBMC 分离方案：密度梯度分离、手动和基于磁珠的自动分离。对制造商的手动基于微珠的方案进行了修改，包括在 PBMC 分离之前去除血沉棕黄层稀释，以及消除离心时中断的要求，使研究人员能够遵循适应性强、经济高效且高通量的 PBMC 分离方案。首先，使用 8 个匹配的全血样品分离 PBMC，以比较密度梯度分离和基于微珠的手动技术。重要的是，两种比较方法之间的细胞群分布、细胞活力和 PBMC 回收率没有显著差异，分别如图 2A-F、图 3A 和补充图 1 所示。在代表性数据中，使用台盼蓝排除法的密度梯度分离方法的细胞计数较高，但使用血液学细胞分析仪时则不然。细胞计数仪上的 PBMC 细胞类型设置采用 8-50 μm 的细胞直径范围，因此，当使用台盼蓝排除法时，计数将包括 PBMC 以及粒细胞（直径约 12-15 μM）17。虽然血液细胞计数仪的特异性高于台盼蓝排除法，但一些回收率计算结果高于 100%，反映了仪器的误差范围（参见补充图 1）。因此，建议研究人员在比较 PBMC 分离方案的产量时应用细胞计数技术的组合，因为大多数技术不提供特异性和高灵敏度的差异细胞计数。此外，没有进行分析以比较两种技术产生的 PBMC 的功能活性，这是我们分析的一个局限性。
接下来，比较了基于微珠的手动和自动方法，从 8 个匹配样品中未发现 PBMC 产量或活力之间的显着差异（图 4A、B）。由于两种方法使用相同的抗体分离混合物，因此未单独比较细胞群。重要的是，使用自动化方案，处理 8 个样品的手动操作时间从 43 分钟减少到 22 分钟（图 4C）。虽然使用自动化确保了通量、防止技术人员倦怠和样本处理的一致性，但试剂和耗材的成本明显高出 3-4 倍，比基于微珠的手动方法高出 3-4 倍。这是在修改制造商的方案以使用 1 mL 血沉棕黄层（来自 10 mL 的全血体积）而不是推荐的 2-5 mL 范围（来自 10 mL 和/或更大的全血体积）之后。如果预算有限，选择手动方法可以将处理时间缩短 ~25%，同时保持与密度分离方法相当的试剂和耗材成本。建议每位技术人员一次处理不超过 8 个样品，以确保在 5 分钟的孵育期间（步骤 3.7、3.11 和 3.14）内充分交错放置样品（~30 秒/样品）。
在基于微珠的手动和自动方法中，去除血沉棕黄层是确保最佳 PBMC 分离的关键步骤。需要注意的是，本方案中使用了血沉棕黄层而不是全血，因为试剂的体积基于起始材料体积10。有效去除整个血沉棕黄层体积在技术上可能具有挑战性。最初，该方法详细去除 0.5 mL 血沉棕黄层，但为了提高回收率，将其增加到 1 mL。为了确保充分和一致地回收血沉棕黄层，详细说明此过程在方案文档和培训中很重要。建议在吸出血沉棕黄层的同时旋转移液器吸头，同时注意不要从下面一层吸出过多的红细胞（步骤 2.3）。重要的是不要使结合不需要的细胞（即粒细胞和红细胞）的抗体混合物饱和，这会影响产量和纯度10.为了尽量减少血沉棕黄层提取过程中收集的红细胞，移液器吸头应位于血浆和血沉棕黄层之间。血沉棕黄层的体积可以从 1 mL 开始增加;但是，必须如上所述小心，以确保收集体积中含有红细胞的体积不超过 10%。或者，可以使用自动液体处理器来持续收集血沉棕黄层18。然而，对于大多数实验室来说，校准和排除液体处理仪器方案故障所需的专门时间，尤其是考虑到费用，可能并不可行。
鉴于新南威尔士州卫生部全州生物样本库的目标是在未来 3 年内处理 23,000 个 PBMC，因此基于自动化微珠的方案的过渡和应用至关重要。在这里，证明 PBMC 可以在采集后长达 9 天内从 ACD 管中分离出来，平均活力为 >70%。虽然采集后 24 小时的产量是最佳的，但在此时间范围内进行处理并不总是可行的，因为可能需要运输样品。结果表明，使用手动或基于磁珠的方法分离的 PBMC 在采集后 4 天内分离时，全血产量为 >3 x 105 个细胞/mL，在采集后 10 天内分离时，全血产量为 >1 x 105 个细胞/mL 全血。超过 5 天的样品数量较低被认为是该分析的局限性。此外，由于没有提供这些信息，因此没有根据参与者的年龄、性别和临床病史对数据进行分离。尽管需要进行比较分析来检查两种方法处理时间延迟的影响，但之前已经报道过，使用密度梯度法分离 PBMC 的延迟会降低细胞质量并显著增加红细胞污染19,20。此外，如果处理延迟，粒细胞比例会增加，因此，应将相似“年龄”的标本分组进行下游分析 20,21,22。值得注意的是，该实验是使用柠檬酸葡萄糖（即柠檬酸三钠、柠檬酸和葡萄糖）抗凝的血液进行的;但是，如果使用其他抗凝剂，产量和/或细胞类型的比例可能会有所不同23;因此，建议研究人员根据预期的下游 PBMC 分析选择合适的抗凝剂。
总之，详细介绍了一种适用于高通量工作流程的磁珠分离 PBMC 方案，以满足在不影响细胞活力的情况下进行放大的要求。手动和自动方法均可进行优化，通过改变起始体积和重悬体积来产生特定的细胞浓度。新南威尔士州卫生部全州生物样本库已从使用传统密度梯度分离技术每月提取 ~60 个 PBMC 过渡到使用这种自动化兼容的基于微珠的方法每月提取 ~300 个 PBMC。作者的下一个目标是使用自动化平台每月处理多达 1200 个 PBMC，并进一步比较通过基于磁珠（手动和自动）和密度梯度技术分离的 PBMC，以指导该技术在其他实验室的实施，特别关注生物样本库。

外周血单核细胞 （PBMC） 分离是一种将淋巴细胞和单核细胞与其他全血成分分离和分离的技术。PBMC 是一种用途广泛的细胞类型，可用于多种应用，包括但不限于免疫疗法、疫苗开发、靶标或生物标志物鉴定以及抗体/小分子药物开发 1,2。这些细胞可以从健康或患病个体中分离出来，可以立即用于下游工艺或冷冻保存以备将来研究3。在某些情况下，下游目的已知，而在其他情况下，如生物样本库的常见情况，PBMC 被分离并储存起来以备将来未指定的应用4。
密度梯度离心是从全血中分离 PBMC5、6、7 的传统技术，利用离心过程中基于细胞密度的组成细胞类型的差异分离。虽然这种方法可能存在一些变化，但全血通常用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 稀释，在专用或标准离心管中的密度梯度介质上分层，然后旋转。结果有四个不同的层：顶层血浆富含血小板，密度梯度培养基上方有一层薄的 PBMC，最后，底层由红细胞 （RBC） 和粒细胞组成。尽管这种方法以前被称为“金标准”8，但放大生产存在局限性，例如处理时间长、离心机容量大、难以分装其他血液制品（即血浆和红细胞）以及难以实现自动化。虽然这种方法9 可以实现自动化，但它确实需要对液体处理器进行全面编程（离心模块完全自动化），并且仍然是一个漫长的过程。
此后，提出了一种替代工作流程，该工作流程使用免疫磁珠分离，使用八支架磁力架进行手动处理，或使用仪器进行全自动处理。该方法利用添加到细胞中的抗体混合物并结合不需要的细胞群，在本例中为血小板、粒细胞和红细胞。随后通过磁分离去除这些不需要的细胞群，留下阴性组分中的单核细胞和淋巴细胞群，这些细胞群可用于下游处理10。这种阴性选择方法比阳性选择方法更快，后者需要额外的步骤才能从 PBMC 中去除抗体和磁珠复合物。阴性选择还具有优势，因为它已被描述为保持细胞功能的一种方式11,12。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell cryopreservation media CS10, 100 mL (CRYOSTOR)</td>
			<td>StemCellTM Technologies</td>
			<td>07930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo ScientififcTM</td>
			<td>51033311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell 1 mL FX</td>
			<td>BioTools</td>
			<td>BCS-407P</td>
			<td>This is the control rate freezing container used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water&#160;</td>
			<td>Bacto Laboratories</td>
			<td>561832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DxH 500 Hematology Analyzer&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>B40601</td>
			<td>Referred to as external automated cell counter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyEightsTM EasySepTM Magnet</td>
			<td>StemCellTM Technologies</td>
			<td>18103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySepTM Direct Human PBMC Isolation Kit</td>
			<td>StemCellTM Technologies</td>
			<td>19654</td>
			<td>Kit includes the magnetic bead tube and the cocktail mix tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>E6758-500G</td>
			<td>Instructions to make 0.1M EDTA solution from EDTA salt is located in supplemental file 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LymphoprepTM Density Gradient Medium</td>
			<td>StemCellTM Technologies</td>
			<td>7851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megafuge ST4 Plus Centrifuge</td>
			<td>Thermo ScientififcTM</td>
			<td>THR75009903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orion Star A211 pH meter electrode</td>
			<td>Thermo ScientififcTM</td>
			<td>STARA2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orion&#8482; ROSS Ultra&#8482; Glass Triode&#8482; pH/ATC Combination Electrodes</td>
			<td>Thermo ScientififcTM</td>
			<td>8302BNURCA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), solution, 1X, 500ml</td>
			<td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RoboSepTM Buffer 1X</td>
			<td>StemCellTM Technologies</td>
			<td>20104</td>
			<td>Software used for statistical analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RoboSepTM-S</td>
			<td>StemCellTM Technologies</td>
			<td>21000</td>
			<td>Fully automated cell separator instrument.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RoboSep&#8482; Filter Tips</td>
			<td>StemCellTM Technologies</td>
			<td>20125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SepMateTM-50 (IVD) tubes</td>
			<td>StemCellTM Technologies</td>
			<td>85460</td>
			<td>IVD - In vitro diagnostics. Also known as SepMateTM-50 tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-CELL XR Cell Anlayzer</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>Internal automated cell counter. Instrument obsolete and no longer available for purchase (as of December 31, 2022). Alternative instrument is the ViCell BLU Cell Viability Analyzer (Product no. C19196).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-CELL XR Quad Pack Reagent Kit</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>383722</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating human peripheral blood mononuclear cells from buffy coats via high throughput immunomagnetic bead separation

外周血单核细胞 （PBMC） 是单核细胞和淋巴细胞的异质性群体。冻存的 PBMC 在长期储存中具有稳定的活力，使其成为许多下游研究目的的理想细胞类型，包括流式细胞术、免疫测定和基因组测序。通常， PBMC 通过密度梯度离心分离，但这是一种低通量工作流程，难以扩展且成本高昂。本文介绍了一种使用基于磁珠的 PBMC 分离方法的高通量工作流程，该方法可快速实现。比较了使用密度梯度分离获得的 PBMC 的总细胞浓度、活力和群体分布，两种技术的细胞活力和细胞类型比例相当。分离的 PBMC 在采血后 9 天内表现出超过 70% 的活力，尽管与采集后 24 小时内处理的 PBMC 相比，5 天后的产量下降了一半。总之，本文介绍了一种 PBMC 方案，该方案利用基于微珠的方法来适应高通量工作流程，并证明基于微珠的手动和自动方法都可以提高处理能力并为各种预算提供灵活性。

Peripheral blood mononuclear cell (PBMC) isolation is a technique that separates and isolates lymphocytes and monocytes from other whole blood constituents. PBMCs are a versatile cell type used for numerous applications including, but not limited to, immunotherapy, vaccine development, target or biomarker identification, and antibody/small molecule drug development1,2. These cells may be isolated from healthy or diseased individuals and can be used immediately in downstream processes or cryopreserved for future research3. In some instances, the downstream purpose is known, while in others, as is common in biobanking, PBMCs are isolated and stored for future unspecified applications4.
Density gradient centrifugation is the traditional technique for isolating PBMCs5,6,7 from whole blood, utilizing the differential separation of the constituent cell types based on cell density during centrifugation. While there may be some variation in this method, whole blood is generally diluted with phosphate-buffered saline (PBS), layered over a density gradient medium in a specialized or standard centrifuge tube, and then spun. Four distinct layers result: the top plasma layer is enriched with platelets, a thin PBMC layer is above the density gradient medium, and finally, the bottom layer consists of red blood cells (RBCs) and granulocytes. Although this method has previously been termed &#39;the gold standard&#39;8, there are limitations for scale-up, such as lengthy processing time, centrifuge capacity, difficulty in aliquoting other blood products (i.e., plasma and RBCs), and being laborious to automate. While automation is possible for this method9, it does require comprehensive programming of a liquid handler (with a centrifugation module to be fully automated) and would remain a lengthy process.
Henceforth, an alternate workflow that uses immunomagnetic bead separation with either an eight-holder magnet for manual processing or an instrument for fully automated processing is presented. This method utilizes an antibody cocktail that is added to cells and binds unwanted cell populations, in this case, platelets, granulocytes, and RBCs. These unwanted populations are subsequently removed by magnetic separation, leaving monocyte and lymphocyte populations in the negative fraction that are ready for downstream processing10. This negative selection method is faster than positive selection methods which require additional steps to remove the antibody and magnetic bead complex from the PBMCs. Negative selection is additionally advantageous as it has been described as a way to preserve cell functionality11,12.

作者聚焦：PBMC 分离的进步 - 提高研究的通量和一致性

通过高通量免疫磁珠分离从血沉棕黄层中分离人外周血单核细胞

Isolating peripheral blood mononuclear cells, also known as PBMCs, is typically a lengthy and manual process. We saw an alternative method that'd be quick to implement and capable of processing high numbers of samples. Our protocol offers an automated high throughput method, ensuring consistency while preventing technician burnout.We also detail our medium throughput automation-compatible method that can be utilized during equipment downtime. This medium throughput option is a more budget-friendly alternative for other laboratories. A biobank can now process more samples with the same number of technicians.This will increase the specimen collection size as well as its diversity, enabling future research and improving patient care.

当使用基于微珠或密度梯度分离方法分离 PBMC 时，测量 PBMC 分离前（即全血中）和分离后淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的比例。两种方法均显著富集淋巴细胞和单核细胞的比例（图 2A、B）。此外，在通过基于微珠的方法分离的 PBMC 中，中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞（即粒细胞）的比例显着降低（图 2C-F）。密度梯度和基于微珠的方法之间淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞的比例没有显著差异（图 2）。此外，还计算了上面列出的细胞类型的回收率百分比（参见补充图 1）。两种方法的平均细胞活力均超过 95%，并且没有显着差异（图 3A）。还使用 8 μm 至 50 μm 的尺寸范围（直径）对 PBMC 进行计数，其中密度梯度分离方法产生的细胞总数大约高出两倍（图 3B）。 
接下来，将基于磁珠的自动方法与手动方法进行了比较。使用手动或自动方法未发现细胞活力（图 4A）或总细胞计数（图 4B）的显著差异。比较了处理这 8 个样品的时间，包括无需人工干预的免提时间。8 个样品的总处理时间为 43 min ，而 8 个样品的总处理时间为 43 min。手册 57 分钟 vs.自动化方法。自动化方法包括 35 分钟的免提处理（图 4C）。
PBMC 分离的基于微珠的工作流程（全血和血浆等分）进行了 9 个月的试点，其中前 820 名参与者使用手动平台从未经筛选的人血中分离 1410 个 PBMC 样本，然后在接下来的 590 名参与者使用自动化方法。根据研究验收标准，处理在采集当天或采集后最多 10 天内进行，处理延迟主要是由于样品运输时间。使用手动或自动方法，在收集后 24 小时内处理的 PBMC 具有最高的活力和回收率（图 5）。5 天内加工的 PBMC 的平均细胞活力为 >90%，10 天内加工的 PBMC 的平均细胞活力为 >70%（图 5A）。与在 24 小时内处理的标本相比，5 天后平均 PBMC 产量下降了 50%（图 5B）。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig01.jpg"> 图 1：从血沉棕黄层中分离微珠的 PBMC 方案的示意图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig01large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig02.jpg"> 图 2：通过密度梯度和基于微珠的方法分离 PBMC 前后全血中淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞的比例。匹配全血 PBMC 前分离（正方形）和分离后通过密度梯度（空心圈）或基于珠子（闭合圈）方法 （n = 8） 确定的 PBMC 中淋巴细胞 （A）、单核细胞 （B）、中性粒细胞 （C）、嗜酸性粒细胞 （D）、嗜碱性粒细胞 （E） 和粒细胞 （F） 的百分比。ns = 不显著，*p < 0.05，由单因素方差分析（A 和 B）或 Friedman 检验 （C- 确定）F） 的<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig02large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig03.jpg"> 图 3：通过密度梯度和基于磁珠的方法分离的 PBMC 的活力和总细胞计数。 （A） 使用密度梯度（正方形、深色条）处理的样品的平均 （± SD） 细胞活力与基于 beads（圆圈、Open Bar）方法，用于 8 个配对样品。ns = 配对 t 检验不显著。（B） 使用密度梯度（正方形、深色条）处理的样品的总细胞计数 与基于 beads（圆圈、Open Bar）方法，用于 8 个配对样品。*p < 0.05 使用配对 t 检验确定。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig03large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig04.jpg"> 图 4：手动和自动基于微珠的方法的比较。 （A） 使用手动（正方形、深色条形）处理的样品的平均 （± SD） 细胞活力与基于 Beads 的自动化（圆圈、Open Bar）方法，用于 8 个配对样品。ns = Mann-Whitney 检验不显著。（B） 使用手动（正方形）处理的样品的总细胞计数 与基于 8 个配对样品的基于微珠的自动化（圆圈）方法。ns = 配对 t 检验不显著。（C） 使用手动处理的 8 个样品的处理时间 与自动化方法，包括手动操作（浅色条形）和无需干预的时间段（深色条形）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig04large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig05.jpg"> 图 5：根据样品采集和 PBMC 储存之间的时间，手动或使用自动化方法分离的 PBMC 的活力和产量。 （A） 使用手动（深色条）处理的参与者样品的平均 （± 95% CI） 细胞活力与基于微珠的自动化（Open Bar）方法。详细说明参与者编号的表格。ns = 不显著。na = 不适用。*p < 0.05（通过 Tukey 多重比较检验）。（B） 使用手动（深色条形）处理的参与者样品的总细胞计数 与基于微珠的自动化（Open Bar）方法。详细说明参与者编号的表格。ns = 不显著。na = 不适用。*p < Tukey 多重比较检验的 0.05。由于重复数小于 3，因此 Automated Day 10 没有值。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig05large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
补充图 1： 使用密度梯度和基于磁珠的方法获得的差异细胞百分比回收图。 使用密度梯度法（正方形、暗条形）和基于磁珠的方法（圆圈、开放条形）（n = 8）使用全血分离前的绝对细胞计数和分离后的细胞悬液计算百分比。ns = 不显著，*p < 0.05，由未配对 的 t 检验确定。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充文件 1：密度梯度协议。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/Supplementary%20File%201_editedv2.zip" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充文件 2：在 PBS 中制备 0.1 M EDTA，pH 值为 8.0。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/Supplementary%20File%202_editedv2.zip" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充文件 3：为生成代表性数据而执行的详细过程。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/Supplementary%20File%203_editedv2.zip" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>

该协议详细介绍了一种高通量自动化兼容方法，用于分离人外周血单核细胞用于生物样本库和其他目的。

Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are a heterogeneous population of monocytes and lymphocytes. Cryopreserved PBMCs have stable viability in ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells from Buffy Coats via High Throughput Immunomagnetic Bead Separation

1.0K 次观看.  New South Wales Health Pathology. 分离外周血单核细胞（也称为 PBMC）通常是一个漫长的手动过程。我们看到了一种替代方法，该方法可以快速实施并能够处理大量样品。我们的方案提供了一种自动化的高通量方法，可确保一致性，同时防止技术人员倦怠。我们还详细介绍了可在设备停机期间使用的中等通量自动化兼容方法。对于其他实验室来说，这种中等通量选项是更经济实?...