Schneiden Sie zunächst die Metallgitter in Streifen mit den Maßen 25 x 8 Millimeter. Legen Sie die kundenspezifischen Netze in einen Sterilisationsbehälter und autoklavieren Sie sie zwei Stunden lang. Stellen Sie nach dem Autoklavieren den Sterilisationsbehälter und die 1,8-Milliliter-Fläschchen unter die Laminar-Flow-Bank.
Öffnen Sie den Sterilisationsbehälter und entfernen Sie das Metallgitter. Setzen Sie das Gitter in die Kappe des 1,8-Milliliter-Fläschchens ein und verschließen Sie das Fläschchen. Entfernen Sie nach der Entnahme von menschlichem Gewebe der Eierstockrinde das Mark und schneiden Sie das Gewebe in die gewünschte Form.
Geben Sie fünf Milliliter Vitrifikationslösung 1 in die erste Vertiefung der Sechs-Well-Platte. Äquilibrieren Sie das Gewebe der Ovarialrinde mit dem Zellsieb fünf Minuten lang in Vertiefung 1 der Platte. Bewegen Sie das Zellsieb mit dem Kortexgewebe in die Vertiefung 2, die fünf Milliliter Vitrifikationslösung 2 enthält, und äquilibrieren Sie es fünf Minuten lang.
Legen Sie dann das Sieb mit dem Cortex-Gewebe sechs Minuten lang in die Vertiefung 3 einer Sechs-Well-Platte, die fünf Milliliter Vitrifikationslösung 3 enthält. Füllen Sie das vorbereitete Kryo-Fläschchen mit sterilisiertem Flüssigstickstoff und legen Sie es in das mit flüssigem Stickstoff gefüllte Kryo-Dewargefäß. Laden Sie die Gewebeproben innerhalb einer Minute auf das Metallgitter des Vitrifikationsgeräts.
Führen Sie dann das Metallgitter in den flüssigen Stickstoff im gitterbasierten Kryo-Fläschchen ein. Geben Sie sechs Milliliter Äquilibrierungslösung in Vertiefung 1 einer sterilen Sechs-Well-Platte und übertragen Sie dann jeweils sechs Milliliter RS in die Vertiefungen 2 und 3. Eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren.
Erwärmen Sie die Schnellerwärmungslösung in einem sterilen Probenbecherglas für eine Stunde auf einer auf 37 Grad Celsius eingestellten Heizplatte. Öffnen Sie unter der Laminar-Flow-Bank die kryokonservierten Fläschchen mit vitrifiziertem kortikalem Ovarialgewebe. Übertragen Sie das Netz schnell in die schnell erwärmende Lösung.
Mit einer sterilen Pinzette wird das Gewebe in die Äquilibrierungslösung überführt und drei Minuten lang auf einem Schaukelschüttler inkubiert. Spülen Sie dann das Tuch bei Raumtemperatur jeweils 10 Minuten lang mit RS1 und RS2 auf einem Schaukelschüttler aus. Löse Calcein in 100 Mikrolitern DMSO auf.
Geben Sie drei Mikroliter Calcein in den Boden eines 1,5-Milliliter-Röhrchens und lagern Sie es bei minus 20 Grad Celsius. Geben Sie 0,007 Gramm Kollagenase in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und lagern Sie das Röhrchen bei minus 20 Grad Celsius. Fügen Sie 997 Mikroliter DPBS zu den gefrorenen drei Mikrolitern Calcein hinzu und suspendieren Sie es erneut, um das Calcein aufzulösen.
Fügen Sie dann kaltes Kollagenasepulver hinzu, um 1000 Mikroliter Arbeitslösung zu erhalten. Fügen Sie dann 500 Mikroliter Arbeitscalceinlösung hinzu und übertragen Sie zwei Stücke von zwei Millimetern Fragmenten der Ovarialrinde in die Vertiefungen einer Vier-Well-Schale. Dann 90 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren und vor Licht schützen.
Bestimmen Sie schließlich unter Fluoreszenzmikroskopie die Follikelviabilität.
