Name: quantitation of intra-peritoneal ovarian cancer metastasis
Uploaded: 2016-07-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitation of Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metastasis at JoVE.com

This research was supported by research grants RO1CA109545 and RO1CA086984 to M.S.S. by the National Institutes of Health/National Cancer Institute and by an award from the Leo and Ann Albert Charitable Trust (to M.S.S.).

Alle in - vivo - Studien wurden von der University of Notre Dame Animal Care und Use Committee und verwendet weiblichen C57 / BL6J Mäuse zugelassen. 1. Murine Ovarian Cancer Cell Culture <ol><li> Machen das ID8 murine Eierstockkrebszellkulturmedium wie folgt: 1 L von Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM), supplementiert mit 4% fötalem Rinderserum (FBS), 1% Penicillin / Streptomycin, 5 ug / ml Insulin, 5 ug / ml Transferrin und 5 ng / ml Natriumselenit. </li><li> Unter Verwendung von kommerziell beschafft lentivirale Partikel exprimieren , RFP und einen Selektionsmarker (Blasticidin - Gen) transduzieren ID8 murine Ovarkrebszellen 13 bis rot fluoreszierendes Protein (RFP) exprimieren. Beachten Sie, dass grün fluoreszierendes Protein verwendet werden kann, bietet aber eine schwächere Fluoreszenzsignal. <ol><li> Unmittelbar vor der Transduktion, Kulturzellen zu 50-70% Konfluenz und fügen Sie frisches Medium (ohne Penicillin / Streptomycin), die 1 ml Polybren enthält (5 ug / ml finalKonzentration). </li><li> Gently Pipette RFP-Lentivirus (20 ul) tropfenweise in die Schale und für 72 Stunden bei 37 ° C inkubiert. Entfernen Sie Medium und Inkubation mit frischem Medium für 24 Stunden. Beginnen Selektion von transduzierten Zellen durch Blasticidin zum Kulturmedium Zugabe von (5 &amp; mgr; g / ml) und Monitor für rote Zellen unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie (Abbildung 1 ). </li></ol></li><li> Kultur die RFP-markierten Zellen in ID8 Medium um etwa 10 6 Zellen in eine Gewebekulturschale Säen und Visualisierung täglich mit einem Lichtmikroskop , bis die Zellschicht konfluent ist. </li><li> Wenn konfluent, ernten die Zellen unter Verwendung von Trypsin (0,25%, 3 min) und zurück den Kolben an die C - Inkubator 37 o , bis die Zellen abgelöst werden. </li><li> Neutralisieren des Trypsins mit 6 ml ID8 Kulturmedium, das Serum. Pipette nach oben und unten gegen den Boden der Schale, dann Transfer zu einem 15 ml konischen Röhrchen. Zentrifuge bei 1200 UpM für 2 Minuten absaugen dann das Medium mit einem glass Pipette. </li><li> Waschen Sie die Zellen mit Phosphat-gepufferte Saline (PBS), indem Sie vorsichtig in 6 ml warmem PBS Resuspendieren und Zentrifugieren wie in 1.5 oben. In PBS auf eine Endkonzentration von 5 x 10 6 Zellen / ml resuspendieren. Halten Zellen warm (37 ° C) bis zur Injektion. </li></ol> 2. intraperitoneale Injektion von ID8 Zellen und in - vivo - Bildgebung <ol><li> Injizieren jeder Maus mit 2 ml des warmen ID8-PBS-Lösung für insgesamt 10 Millionen Zellen durch intraperitoneale (ip) Injektion. Lassen Tumorzellen für ca. 10 Wochen mit wöchentlichen Live - Bildgebung in vivo zu wachsen. </li><li> Unmittelbar nach der Injektion und jede Woche danach die Mäuse wiegen und dann betäuben jede Maus Isofluran (2,5% Durchfluss in 0,5 l / min O 2 Flow) verwendet wird . Anmerkung: Die Mäuse wurden gewogen, nicht als ein quantitatives Maß der Tumorlast, sondern eine allgemeinere Maß der einzelnen Maus physikalischen Progression während der Studie. Mäuse wiegents wurden mit ihrem eigenen früheren Gewichtswerten verglichen. <ol><li> Anesthetize Mäuse durch in einer Isofluran Kammer platzieren. Pflegen konstante Anästhesie während des Scannens durch die Positionierung der Maus den Kopf in den Nasenkegel für die Belichtung mit 2,5% Flussrate Isofluran während des gesamten Verfahrens. </li></ol></li><li> Verwenden Sie Enthaarungscreme die Haare auf dem Oberkörper und Bauch jeder Maus zu entfernen, da das schwarze Haar Abschwächung des Fluoreszenzsignals verursacht. Mäuse werden mit warmem Wasser nach dem Aufbringen der Enthaarungscreme gewaschen und mit RT Papiertüchern getaucht. </li><li> Während anästhesiert, scannen Sie den gesamten Körper jeder Maus ein kleines Tier optische Abbildungssystem verwendet wird. Scannen Sie alle Mäuse in einer Kohorte zu jedem Zeitpunkt. Verwenden Sie die folgenden zwei Schritt - Protokoll (2A): <ol><li> fluoreszenzmarkierten (RFP) Tumorzellen in Schritt 1 zu beobachten, führen Multispektraldaten Erwerb insgesamt 5 Bilder Filter mit Anregung von 440 nm zu sammeln, 460 nm, 480 nm, 520 nm und 540 nm und einem Emissionsfilter von 600 nm. Verwenden Sie die folgenden Erfassungsparameter: eine Standardbelichtung von 15 Sekunden, 2 x 2 - Binning, FOV von 160 mm und f Stopp von 1,1. </li><li> In Schritt 2 das ganze Tier zu beobachten, ein Reflexionsbild unter Verwendung eines offenen Anregungsfilter (weißes Licht), ein offenes Emissionsfilter, eine Standardbelichtung von 0,2 sec mit 2 x 2-Binning und ein FOV von 16 cm erwerben. Hinweis: Die tatsächliche Aufnahmezeit ist ~ 1 min. </li></ol></li></ol> 3. Maus Dissection und Image Acquisition <ol><li> Wenn die Live - Darstellung das Vorhandensein von umfangreichen Intraperitonealtest Krankheit oder Tiere zeigen Akkumulation von Aszites zeigt (wie von Blähungen belegt), Verlust oder Gewinn an Körpergewicht von mehr als 20%, Lethargie oder andere Anzeichen von Leiden, einschläfern jede Maus mit CO 2 Narkose durch zervikale Dislokation gefolgt. </li><li> Schneiden Sie die Haut nach vorne entlang der ventralen Mittellinie der Maus, mit einer Spitz DISSECTIOn Schere, von der Oberseite der Oberschenkel an der Unterseite des Brustkorbs. Größte Vorsicht walten lassen nur die Hautschicht zu durchschneiden (Abbildung 2Bi). Vorsichtig trennen die Haut von Peritonealgewebe, sicher die Bauchwand nicht durchstoßen zu sein. </li><li> Mit einer Spitz Dissektion Schere, geschnitten seitlich sowohl entlang der Unterseite des Brustkorbs und der Oberseite der Oberschenkel zu schaffen zwei Hautlappen (2B ii, iii). </li><li> Platzieren Sie jede Maus auf ihrer Bauchseite (Bauchhöhle nach unten gerichtet) mit den Hautlappen aufgerissen und scannen jede Maus mit ihren Organen in situ unter Verwendung des Kleintier optische Abbildungssystem (3A, B). <ol><li> Verwenden Sie die gleichen Bildaufnahmeparameter wie in 2.4.1.-2.4.2 beschrieben. </li></ol></li><li> Halten Sie die Maus Sezieren durch Extrahieren einzelner Peritonealdialyse Organe, einschließlich Leber, omentum / Bauchspeicheldrüse, Magen, Zwerchfell, Dünndarm, Dickdarm, links und rechts Peritoneum, Ovarien, kidneys, Gekröse und Fettpolster. <ol><li> Beachten Sie, aufzuzählen, und sichtbare Tumoren an jedem Organ aufzunehmen. Verwenden eine Dicke, den Durchmesser jedes Tumors zu messen. </li><li> Bezeichnen Tumoren weniger als 2 mm im Durchmesser so klein, zwischen 2 und 5 mm als Medium und größer als 5 mm so groß. </li></ol></li><li> Platzieren Sie die Organe auf der organ Scanvorlage (4) , die eine vorbestimmte Position für jedes Organ identifiziert. Verwenden Sie PBS die Organe feucht zu halten. </li><li> Scannen Sie jedes Blatt von Organen das kleine Tier optische Abbildungssystem (3C, D). <ol><li> Verwenden Sie die gleichen Bildaufnahmeparameter wie in Schritt 2.4 beschrieben. </li></ol></li><li> Nach dem Scannen Platz Organe in 10% Formaldehyd nachfolgende Verarbeitung für die Histologie zu ermöglichen. </li></ol> 4. Quantifizierung der Tumorlast in the Fluoreszenzbilder <ol><li> Um die Menge der Autofluoreszenz in jedem Multispektraldaten Scan zu reduzieren, entmischen zuerst die Dateien Software zur Verfügung, mit dem Kleintierbildgebung System. <ol><li> Laden Sie zuerst das RFP: In - vivo - Spektral-Datei, gefolgt von der Autofluor: In Vivo Red - Datei im Unmixed Images Fenster und wählen Sie entmischen. </li></ol></li><li> Exportieren Sie die .bip-Dateien als 16-Bit-Tiff (unskaliert) Format. </li><li> Verwenden Sie ImageJ Software (ex vivo Organe und dann die volle Maus Körper mit Organen in situ). <ol><li> Verwenden Sie Datei&gt; Öffnen Sie die 16 - Bit - TIFF - Dateien der Organscanvorlagendateien in ImageJ zu öffnen. </li><li> Unter Bild&gt; Anpassen&gt; Helligkeit / Kontrast, wählen Sie den Minimalwert angezeigt auf 0 zu setzen und die maximal angezeigte Wert auf 35.353 und dann unterBild&gt; Lookup - Tabellen, wählen Sie Red Hot. Hinweis: Verschiedene Tiermodelle werden verschiedene Helligkeitsstufen erfordern, aber es ist wichtig, um die Helligkeit übereinstimmend.Alle einer gegebenen Studie zu halten. </li><li> Mit dem Freihand - Auswahl - Werkzeug zeichnen Sie eine Region Freiform von Interesse Auswahl (ROI) um jedes Organ und verwenden Sie das Messwerkzeug (STRG + M) , um die Oberfläche des jeweiligen Organs zu berechnen; notieren Sie die Oberfläche jedes Organ in einer Tabelle. </li><li> Mit der ROI um jedes Organ gezeichnet, klicken Sie rechts in der ROI Duplikate und wählen Sie nur die Orgel aufzunehmen. </li><li> Während bei den einzelnen Organ suchen, unter Bild&gt; Anpassen&gt; Schwellenwert, wählen Sie auf einen niedrigeren Schwellenwert von + 1200 und einem oberen Schwellenwert von + 1700 die Schwelle des Bildes zu setzen onl zu wähleny die meisten hell fluoreszieren Regionen und überprüfen dunklen Hintergrund zu wählen; wählen Sie OK. Hinweis: Die Bilder manuelle Manipulation der Schwellen Schiebern in ImageJ erfordern kann, so daß die zuvor hellsten Bereiche für den Analyseschritt ausgewählt sind, wie oben gezeigt. Verschiedene Krankheitsmodelle werden unterschiedliche Schwelleneinschränkungen erfordern, aber es ist wichtig, dass die Schwellenwerte im Einklang während einer bestimmten Studie zu halten. </li><li> Unter Analysieren&gt; Partikel analysieren, ändern Sie die Größe (Pixel ^ 2) bis 10-Unendlichkeit, wählen zu zeigen: Outlines, überprüfen nur &quot;Ergebnis anzeigen&quot; auszuwählen , und klicken Sie auf OK sowohl die Bereiche und rohen integrierten Dichten dieser hellen Bereichen zu messen, als Tumoren. </li><li> Notieren Sie sich die Werte der Oberfläche und die Raw Integrierte Dichte jeder Auswahl Tumor in der angezeigten <strong&gt; Ergebnisse Tabelle in derselben Kalkulationstabelle die Organoberfläche Bereiche enthält. </li><li> Unter Analysieren&gt; Tools&gt; Kalibrierung Bar, eine Kalibrierungsskala bar auf die Bilder der Organe hinzufügen. Hinweis: In diesem Beispiel wurde dies durch eine Änderung der Lage nach oben rechts, die Füllfarbe auf Schwarz, die Farbe des Labels auf Weiß, die Anzahl der Etiketten bis 5, die Dezimalstellen auf 0, um die Schriftgröße 12 und der Zoom gemacht Faktor 4,0 und ermöglicht Bold Text. </li><li> Unter Datei&gt; Speichern unter ..., speichern Sie die Montage als Tiff und .Jpeg. </li><li> Verwenden Sie Datei&gt; Öffnen Sie die JPEG - Datei der Organe zu öffnen und dann unter Einfügen&gt; Textfeld </strong&gt;, Orgel Etiketten hinzufügen, indem Sie ein Textfeld unter jeder der drei Reihen von Organen zu schaffen. </li><li> Verwenden Sie Datei&gt; Öffnen jedes der 16 Bit zu öffnen TIFF - Dateien der Ganzkörper - Scans in ImageJ in der Reihenfolge der Maus Nummer. </li><li> Unter Bild&gt; Anpassen&gt; Helligkeit / Kontrast, wählen Sie das Minimum, angezeigte Wert auf 0 und der maximale Anzeigewert + 35353 und dann unter Bild&gt; Lookup - Tabellen, wählen Sie Red Hot. </li><li> Unter Datei&gt; Speichern unter ..., speichern Sie die Montage als a. Tiff und .Jpeg. </li></ol></li></ol> 5. Datenanalyse <ol><li> Fügen Sie die Tumorauswahlbereiche und rohen integrierten Dichten jeweils für jedes Organ jeder Maus und notieren Sie die Gesamtfläche Organtumor für jede Maus. </li><li> Normalisieren der aufgezeichneten Bereich und rohe integrated Dichtewerte für die Größe des jeweiligen Organs durch den gesamten Tumor und Gesamt roh integrierte Dichtewerte dividiert durch die entsprechende Organoberfläche (Tabelle 1). </li><li> Berechnen und zeichnen Sie den Mittelwert der beiden normalisierte Tumoroberflächenbereiche und die normalisierte Roh integrierte Dichtewerte (5A, B). </li><li> Vergleichen dieser Mittelwerte zu denjenigen erhalten durch visuelles Zählen der Tumoren, die während der Inspektion jedes Organ für metastatischen Läsionen mit dem bloßen Auge sichtbar waren. </li></ol>

<ol>
	<li>Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+development+and+metastasis.">Ovarian cancer development and metastasis.</a> American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).</li><li>Halkia, E., Spiliotis, J., Sugarbaker, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+management+of+peritoneal+metastases+from+ovarian+cancer.">Diagnosis and management of peritoneal metastases from ovarian cancer.</a> Gastroenterology Research and Practice. 2012, 541842-541854 (2012).</li><li>Barbolina, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+ovarian+cancer+metastasis.">Microenvironmental regulation of ovarian cancer metastasis.</a> Cancer Treatment and Research. 149, 319-334 (2009).</li><li>Lengyel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+ovarian+cancer+experimental+models.">Epithelial ovarian cancer experimental models.</a> Oncogene. 33 (28), 3619-3633 (2014).</li><li>Harter, P., duBois, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+surgery+in+ovarian+cancer+with+special+emphasis+on+cytoreductive+surgery+for+recurrence.">The role of surgery in ovarian cancer with special emphasis on cytoreductive surgery for recurrence.</a> Current Opinion in Oncology. 17 (5), 505-514 (2005).</li><li>Bristow, R. E., Puri, I., Chi, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoreductive+surgery+for+recurrent+ovarian+cancer:+a+meta-analysis.">Cytoreductive surgery for recurrent ovarian cancer: a meta-analysis.</a> Gynecologic Oncology. 112 (1), 265-274 (2009).</li><li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+metastatic+cancer+with+fluorescent+proteins.">In vivo imaging of metastatic cancer with fluorescent proteins.</a> Cell Death and Differentiation. 9, 786-789 (2002).</li><li>Sweeney, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+kinetics+of+tumor-cell+clearance+in+living+animals.">Visualizing the kinetics of tumor-cell clearance in living animals.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 96, 12044-12049 (1999).</li><li>Chishima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+invasion+and+micrometastasis+visualized+in+live+tissue+by+green+fluorescent+protein+expression.">Cancer invasion and micrometastasis visualized in live tissue by green fluorescent protein expression.</a> Cancer Research. 57, 2042-2047 (1997).</li><li>Bouvet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+optical+imaging+of+primary+tumor+growth+and+multiple+metastatic+events+in+a+pancreatic+cancer+orthotopic+model.">Real-time optical imaging of primary tumor growth and multiple metastatic events in a pancreatic cancer orthotopic model.</a> Cancer Research. 62, 1534-1540 (2002).</li><li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Multiples+Uses+of+Fluorescent+Proteins+to+Visualize+Cancer+in+vivo.">The Multiples Uses of Fluorescent Proteins to Visualize Cancer in vivo.</a> Nature Reviews. 5, 796-806 (2005).</li><li>Roby, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+syngeneic+mouse+model+for+events+related+to+ovarian+cancer.">Development of a syngeneic mouse model for events related to ovarian cancer.</a> Carcinogenesis. 21 (4), 585-591 (2000).</li><li>Rampurwala, M., Ravoori, M. K., Wei, W., Johnson, V. E., Vikram, R., Kundra, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+quantification+of+intraperitoneal+tumors+by+in+vivo+computed+tomography+using+negative+contrast+enhancement+strategy+in+a+mouse+model+of+ovarian+cancer.">Visualization and quantification of intraperitoneal tumors by in vivo computed tomography using negative contrast enhancement strategy in a mouse model of ovarian cancer.</a> Translational Oncology. 2 (2), 96-106 (2009).</li><li>Kim, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+and+antivascular+effects+of+AVE8062+in+ovarian+carcinoma.">Antitumor and antivascular effects of AVE8062 in ovarian carcinoma.</a> Cancer Research. 67, 9337-9345 (2007).</li><li>Picchio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+ovarian+carcinoma:+usefulness+of+[(18)F]FDG-PET+in+combination+with+CT+for+lesion+detection+after+primary+treatment.">Advanced ovarian carcinoma: usefulness of [(18)F]FDG-PET in combination with CT for lesion detection after primary treatment.</a> Quarterly Journal of Nuclear Medicine. 47, 77-84 (2003).</li></ol>

Dieser Artikel ist Teil einer Sonderausgabe über Multimodal Pre-Clinical Imaging, gesponsert von Bruker Biospin.

Im Gegensatz zu Studien mit menschlichen Eierstockkrebszellen verwendet, die bei immunsupprimierten Mäusen durchgeführt werden müssen, beschrieben das Protokoll nutzt oben immunokompetente C57 / BL6-Mäusen und syngenen Maus Eierstockkrebszellen. Während diese Einschätzung der möglichen Rolle von Immun Infiltrate in der Tumorprogression und Metastasierung ermöglicht, macht das Vorhandensein von dunklen Haaren auf der Bauchoberfläche Bildgebung weniger empfindlich. Verwendung eines Haarentfernungs Haare vor der Bilderzeugung verbessert die Bildaufnahme zu entfernen, ist jedoch zeitaufwendig, insbesondere für Experimente erfordern Längs Bildgebung. Hairless &#39;nackten&#39; Mäuse können in diesem Protokoll verwendet werden und erfordern keine Enthaarungsmittel basierte Haarentfernung. Weiterhin Nacktmäusen fehlt ein funktionierendes Immunsystem, so kann auch das Wachstum von menschlichen Eierstockkrebszellen in Experimenten zur Beurteilung verwendet werden, wobei der Beitrag des Immunsystems nicht unter Analyse ist. Es sollte auch, dass die Tiefe der intraper bemerkt werden,itoneal Tumoren stellt auch technische Herausforderungen, als optische Fluoreszenzbildgebung in der Regel nicht Tumoren in einer Tiefe mm größer als 5 zu erkennen. Darüber hinaus bieten die Prävalenz von Ascitesflüssigkeit und das Vorhandensein von Aszites-Tumorzellen zusätzliche Komplikationen. Wir haben bei der Bildung von Ascitesflüssigkeit signifikante Maus zu Maus Variabilität beobachtet, selbst wenn sie mit der gleichen Zelllinie injiziert. Also in Gegenwart von Aszites, ist dieses Verfahren bevorzugt, Endpunktanalyse der organspezifischen Tumorlast anstatt Routine Längsabbildungsprogressions. Im aktuellen Fall, dramatische Veränderungen in Tumorbelastung wurden zwischen den beispielsweise Mäusen festgestellt, so dass Kohorten von vier bis fünf Mäuse wird in der Regel für die statistische Analyse ausreichen. Im Falle von weniger dramatische Unterschiede in der Tumorlast, werden zusätzliche Versuchspersonen benötigt werden statistische Aussagekraft zu erreichen. Während die hierin deutlich in Tumorvolumen, optische Fluoreszenzabbildung gezeigten Beispielen unterscheiden können verwendet werden,viel kleinere Unterschiede in organspezifischer Tumorlast erkennen, insbesondere im Vergleich zu Gewicht- oder caliper basierten Messungen an kleinen Läsionen (nicht gezeigt) .Resolution und Empfindlichkeit mit Zelllinie und Abbildungssystem variieren. Im vorliegenden Fall kann metastatic Implantate so klein wie 400 &amp; mgr; m im Durchmesser aufgelöst und quantifiziert werden. Alternative Methoden , einschließlich kontrastverstärkten Computertomographie (CT), Magnetresonanz (MR) -Abbildung und Positronen - Emissions - Tomographie (PET) wurden zur Längsabbildungs ​​14,15 beschrieben. Modalities kombinierte anatomische und funktionelle Bildgebung einschließlich sind ebenfalls in der Entwicklung 16. In Bezug auf dieses vorgeschlagene Verfahren zur Quantifizierung der Tumorlast, ist zu beachten, dass die Bestimmung der Fluoreszenzschwellenwerte [Schritt 4.3.5.] Auf der Intensität der Fluoreszenz in den Bildern zu sehen organ basiert [Schritt 4.3.2.] und wird durch den Benutzer gewählt, um nur die meisten fluoreszierenden Bereiche relative auf den Rest des Organs. Variierende Schwellenwerte wurden in der Analyse verwendet, bevor die endgültigen Schwellenwerte in dieser Studie verwendet bestimmen. Sobald sie bestimmt wurden diese gleichen Schwellenwerte für jedes Organ verwendet analysiert, um Konsistenz bei der Quantifizierung von zu gewährleisten, was durch den Forscher getan metastatischen Gewebe durch die anfängliche visuelle Analyse erachtet wird. Die Bestimmung dieser Schwellenwerte ist ein kritischer Schritt in dem Verfahren und möglicherweise von einem Projekt zum anderen durch die einzelnen Forscher ermittelten variieren. In diesem Fall wurde eine große untere Schwelle verwendet, um nur die höchste Intensitätsfluoreszenzsignale zu erfassen. Durch die Verwendung dieser gleichen Schwellenwert für jedes Organ analysiert, bieten die Analyse und die Ergebnisse vergleichende quantitative Ergebnisse im Rahmen dieser Gruppe von Mäusen. Während dieses Verfahren bei der Quantifizierung der absoluten Werte der Tumorfläche begrenzt ist, ermöglicht es die Fähigkeit Forscher relativen normalisierten Tumorlast unter den gleichen a vergleichen,nd verschiedenen Organen innerhalb Kohorten von Mäusen. Es sollte beachtet werden, dass dieser Ansatz die Quantifizierung von Tumoren enthält, die nicht mit bloßem Auge. Der einzigartige metastasierendem Mechanismus der EOC Ergebnisse in weit intraperitoneale Karzinomatose verbreitet mehreren Geweben und Organen beteiligt, wodurch eine optimale onkologischer Chirurgie technisch anspruchsvoll. Als komplette Zytoreduktion positiv mit Gesamtüberleben korreliert, so folgt, dass die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien intraperitonealen Metastasierung zu bekämpfen gerechtfertigt ist. Bewertung der therapeutischen Wirksamkeit ist jedoch abhängig von der genauen Quantifizierung der Tumorlast, einschließlich der Bewertung der organspezifische Metastasierung. Mit Hilfe der optischen Bildgebung von RFP-markierten Tumorzellen in situ für Orgel Autofluoreszenz korrigiert, kombiniert mit einer sorgfältigen Ex - vivo - Organ - Bildgebung, haben wir einen Ansatz entwickelt , um intraperitoneale organspezifischen Tumorlast zu quantifizieren. Interessanterweise zeigen unsere Analysendass bevorzugte Stellen von Metastasen in diesem Modell, wie von Tumorlast / Fläche definiert, sind ähnlich denen bei Frauen mit Eierstockkrebs (Omentum, Eierstock-, Darm-, Mesenterium) 2,4,5 gefunden. Daher sollte dieser Ansatz bei der Bewertung der experimentellen Therapie Zukunft Nutzen haben entworfen metastasierten Erkrankung zum Ziel.

Epithelialen Ovarialkarzinom (EOC) ist die häufigste Todesursache von gynäkologischen Krebserkrankung, mit einem geschätzten 21.290 Neuerkrankungen in den USA im Jahr 2015 und schätzungsweise 14.180 Todesfälle 1. Die überwiegende Mehrheit (&gt; 75%) der Frauen mit Spätstadium der Krankheit diagnostiziert (Stadium III oder IV) durch diffuse Intraperitonealtest Metastasierung und schlechter Prognose charakterisiert. Wiederauftreten der Krankheit in der Bauchhöhle folgenden First-Line - Chemotherapie ist auch üblich , und stellt eine der Hauptursachen für die Sterblichkeit 2,3. EOC metastasiert durch einen einzigartigen Mechanismus sowohl direkte Verlängerung aus dem Primärtumor zu benachbarten Peritonealdialyse Organe sowie durch die Dissoziation oder vergießen von Zellen aus der primären Tumoroberfläche als einzelne Zellen oder mehrzelligen Aggregate beteiligt sind. Die Zellen werden in die Bauchhöhle Schuppen, wobei sie Ablösung induzierte Apoptose 4 widerstehen. Anhaftungen von Peritonealdialyse Aszites ist weit verbreitet, wie Schuppen Tumorzellen Peritonealdialyse Lymphdrainage und t blockierenumors produzieren Wachstumsfaktoren, die die vaskuläre Permeabilität zu verändern. Ein Teil der Schuppen Tumorzellen heften sich an die Oberfläche von Peritoneal Organe und Strukturen , einschließlich Darm, Leber, Omentum und Mesenterium, woraufhin sie mehrere weit verbreitet Sekundärläsionen 3,5 herzustellen verankern und sich vermehren. Hämatogener Metastasierung ist selten. So klinische Management besteht üblicherweise aus onkologischer Chirurgie einschließlich &quot;optimalen debulking&quot;, definiert als Resektion aller sichtbaren Tumors (egal wie klein). Komplette Zytoreduktion ist mit einem deutlichen Anstieg der Gesamtüberlebenszeit 6,7 zugeordnet und mit der Herausforderung der Identifizierung und Beseitigung von Läsionen &lt;0,5 cm verbunden. als auch bei der Identifizierung von prognostischer Biomarker und Erprobung neuer Chemotherapien oder Kombinationstherapie Ansätze Kleintiermodellen haben Nutzen bei Ovarialkarzinom Forschung bewiesen in unserem Verständnis der Krankheitsprogression zu verbessern. Als primäreWebsite von Eierstockkrebsinzidenz und Metastasierung ist die Bauchhöhle, orthotopen Modelle von EOC Metastasierung die Analyse und Charakterisierung von intraperitoneale Krankheit betreffen. Obwohl es in der Fähigkeit, Bildtumorzellen jüngsten Verbesserungen gewesen, auch auf Einzelzellebene, gibt es immer noch erhebliche Schwierigkeiten in der metastasierten Tumorbelastung von EOC zu quantifizieren. Diese Herausforderungen entstehen durch die Anzahl, Größe und anatomische Lage der Metastasen. Weiterhin besteht ein Bedarf nach Etikettenkrebszellen, um sie von normalen Wirtszellen zu unterscheiden. Frühere Studien haben Antikörper-basierten Markierungsprotokolle oder Transfektion von Tumorzellen mit Luciferase 8,9 verwendet. Direkte Fluoreszenzmarkierung von Krebszellen wurde erstmals 1997 von 10 Chishima und Mitarbeitern berichtet. Fluoreszierende Markierungen erfordern keine Zugabe von exogenem Substrat und liefern vorzügliches Tumorzellspezifität, bieten ein wirksameres Mittel Krebsmetastase 11,12 verfolgen </sup&gt;. Wir beschreiben hier eine optische Bildgebungsverfahren für die quantitative Analyse von Metastasen eine syngene orthotoper Xenograftmodell von rot fluoreszierendes Protein (RFP) umfasste mit -markierte murine ID8 Ovarkrebszellen 13 und immunkompetenten C57 / BL6 - Mäusen. Wir zeigen , ein neues Verfahren der relativen Quantifizierung der Tumorlast in vivo Vereinigen und ex vivo - Bildgebung mit Entfernung von Gewebe Autofluoreszenz. Dieser Ansatz hat einen potentiellen Nutzen in Studien entwickelt, um die Wirkung von spezifischen genetischen, epigenetischen oder Mikroumweltänderungen und / oder Behandlungsmethoden für organspezifische Metastasierung des Ovarialkarzinoms zu bewerten.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium</td><td>Corning</td><td>10-014-CM</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>penicillin/streptomycin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement</td><td>Sigma</td><td>I-1884</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Xtreme small animal imaging system</td><td>Bruker Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bruker Multispectral software</td><td>Bruker Corp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lentiviral particles with Red fluorescent protein</td><td>GenTarget, Inc.</td><td>LVP023</td><td></td></tr><tr><td>trypsin for cell culture</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>depilatory cream (such as Nair Hair Remover Lotion)</td><td>purchases from drugstore&amp;nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software&amp;nbsp;</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/&amp;nbsp;</td><td></td><td>free download</td></tr><tr><td>dissecting tools (forceps)</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>&amp;nbsp;RS 5130</td><td></td></tr><tr><td>dissecting tools (Scissors)</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS 5910</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitation of intra-peritoneal ovarian cancer metastasis

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States. Mortality is due to diagnosis of 75% of women with late stage disease, when metastasis is already present. EOC is characterized by diffuse and widely disseminated intra-peritoneal metastasis. Cells shed from the primary tumor anchor in the mesothelium that lines the peritoneal cavity as well as in the omentum, resulting in multi-focal metastasis, often in the presence of peritoneal ascites. Efforts in our laboratory are directed at a more detailed understanding of factors that regulate EOC metastatic success. However, quantifying metastatic tumor burden represents a significant technical challenge due to the large number, small size and broad distribution of lesions throughout the peritoneum. Herein we describe a method for analysis of EOC metastasis using cells labeled with red fluorescent protein (RFP) coupled with in vivo multispectral imaging. Following intra-peritoneal injection of RFP-labelled tumor cells, mice are imaged weekly until time of sacrifice. At this time, the peritoneal cavity is surgically exposed and organs are imaged in situ. Dissected organs are then placed on a labeled transparent template and imaged ex vivo. Removal of tissue auto-fluorescence during image processing using multispectral unmixing enables accurate quantitation of relative tumor burden. This method has utility in a variety of applications including therapeutic studies to evaluate compounds that may inhibit metastasis and thereby improve overall survival.

Der metastasierendem Mechanismus des Ovarialkarzinoms durch hochdiffusem Intraperitonealtest Metastasierung gekennzeichnet, bestehend aus zahlreichen Läsionen unterschiedlicher Größe, darunter mehrere kleine (&lt;2 mm) Läsionen. Somit ist die Verwendung von RFP-markierten Tumorzellen (Abbildung 1) und optische Bildgebung stellt eine alternative Methode zur manuellen Zählung und Messung der Größe der Läsion. Die Entwicklung von Tumorbelastung im Laufe der Zeit kann der Mäuse und die Messung der Bauchumfang von wöchentlich bestimmt werden , mit einem Gewicht von möglichen Vorhandensein von Aszites zu messen. In vivo optische Bildgebung liefert einen komplementären Ansatz der Tumorlast (Abbildung 2) zu beurteilen. Eierstockkrebs metastasiert auf mehrere Standorte in der Bauchhöhle und molekularen Treiber von ortsspezifischen Metastasierung sind derzeit nicht bekannt. Neben der Ermittlung des Gesamttumorlast, nach der Tötung sorgfältige Präparation durchgeführt werden ortsspezifische pa zu bewerten und zu quantifizierentterns der Metastasierung. Somit optische Abbildungs ​​peritonealer Organe in situ (3A, B) in Kombination mit ex vivo Beurteilung der einzelnen Organe (3C, D) können nützliche Daten über den Gesamt vs organspezifischen Tumorlast bereitzustellen. Die Scans dargestellt in Abbildung 3 stellen die Ergebnisse des Abtastens der Bauchhöhle und einzelne Organe von Mäusen mit variierenden Grad der Tumorlast. Beispielsweise zeigt 3C die meisten Tumorbelastung in Omentum / Pankreas, der Eierstöcke und Mesenterium von Maus A. Im Vergleich zu den gleichen Organen in Maus - B, ein signifikanter Unterschied in Signal gesehen (Figur 3D). Die Verwendung der organ Scanvorlage (4) hilft bei der Identifizierung von organspezifischen Tumorlast. Die Beobachtung der Differentialtumorbelastung quantitativ sowohl hinsichtlich der Tumorfläche und Tumorsignalintensität (Tabelle 1, Abbildung 5) bestätigt. <p class = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Die Ergebnisse in diesen Figuren und Tabelle eine minimale und maximale Anzeigebereich von 0 bis + 35353 so gezeigt wurden analysiert wie keine falsch-positive Signale zu vermeiden, und Autofluoreszenz durch die Gewebe abgegeben wird. Die unterschiedlichen Grade der Signal in Figur 2 zu sehen und 3 veranschaulichen die Vielzahl von Tumorbelastung , die abgebildet werden kann und quantifiziert unter Verwendung dieses Verfahrens. Die Daten in Tabelle 1 veranschaulicht diesen großen Bereich der Anwendbarkeit sowohl in Tumorfläche und die Signalintensität des Tumors zu quantifizieren. Wenn beispielsweise im Omentum / Pankreas von Maus-A im Vergleich zu dem Maus-B, die normierte Tumor-Oberfläche beträgt 26 mal größer in Maus-A aus als Ferner Maus B., der große Bereich der Signalintensität auch im Omentum ist beispiels / Pankreas von Mäusen A und B; die normalisierte Roh integrierte Dichte von Maus-A ist 56-mal größer als die der Maus B. Diese Ergebnisse die Gültigkeit der Compari demonstrierendie Tumorlast mehrerer Test ng Themen relativ zueinander, sowohl in Bezug auf Tumor Oberfläche und Tumorsignalintensität, diese schnelle Methode, die nicht weiter histologische Analyse erfordert. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53316/53316fig1.jpg" /> Abbildung 1. ID8 Murine Ovarkrebszellen Express RFP. (A) Phase Bild von ID8 - Zellen. (B) Fluoreszenzbild von ID8 Zellen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/53316/53316fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/53316/53316fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53316/53316fig2.jpg" /> Abbildung 2. Live - Optical Imaging von C56 / Bl6 Maus mit intraperitoneale Tumorlast. (A) Enthaarungscreme wurde verwendet , hai zu entfernen<html> r von der Bauchseite der Maus vor dem Scannen. (B) Diagramm anfängliche ventralen Mittellinie und seitliche Einschnitte zeigt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/53316/53316fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/53316/53316fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 3AC" src="/files/ftp_upload/53316/53316fig3AC.jpg" /> <img alt="Abbildung 3BD" src="/files/ftp_upload/53316/53316fig3BD.jpg" /> Abbildung 3. Endpoint - Scanning von intraperitoneale Tumorlast. (A, B) Mäuse werden zunächst mit Organen in situ (Bauchseite nach unten) nach dem Öffnen der Bauchseite der Maus. (C, D) Imaging einzelner Organe abgebildet. Jedes Organ wird seziert, visual Tumorbelastung aufgezeichnet und auf dem Organ Scanvorlage zur Analyse gegeben.target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53316/53316fig4.jpg" /> 4. Organ Scanning - Vorlage Abbildung. Dissected Organe werden auf der Orgel Scanvorlage platziert Positions Identifizierung einzelner Organe während des Scannens aufrechtzuerhalten. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/53316/53316fig5.jpg" /> .. Abbildung 5. Normalized Quantitative Daten für das Omentum / Pancreas, Ovarien und Mesentery Daten analysiert wurden , wie in Protokoll beschrieben und wie in Tabelle 1 gezeigt Maus A bezieht sich auf die Maus in das Panel 3A abgetastet wird ; Maus - B bezieht sich auf die Maus in das Panel 3B gescannt. (A) Normalized Tumorbereich. Fluoreszenzsignal Quantifizierung Analyse dieser drei Organe wurde in Form eines Verhältnisses durchgeführt und quantifiziertder Tumoroberfläche auf ganze Organoberfläche für beide Mäuse. (B) normalisierten Roh integrierte Dichte. Fluoreszenzsignal Quantifizierungsanalyse dieser drei Organe wurde in Bezug auf ein Verhältnis von rohem integrierten Dichte ganze Organoberflächenbereich für beide Mäusen durchgeführt und quantifiziert. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="513"><colgroup><col /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:64px;"></td><td colspan="3" style="width:449px;"> Omentum / Pancreas </td></tr><tr height="81"><td height="81" style="height:81px;width:64px;"></td><td style="width:129px;"> Normierte Tumorfläche </td><td colspan="2" style="width:320px;"> Normalisierten Roh Integrierte Dichte </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:64px;"> Maus A </td><td style="width:129px;"> 0,5346 </td><td colspan="2" style="width:320px;"> 5.11E + 07 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:64px;"> Maus - B </td><td style="width:129px;"> 0,0203 </td><td colspan="2" style="width:320px;"> 8.97E + 05 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:64px;"></td><td colspan="3" style="width:449px;"> Ovarien </td></tr><tr height="81"><td height="81" style="height:81px;width:64px;"></td><td style="width:129px;"> Normierte Tumorfläche </td><td colspan="2" style="width:320px;"> Normalisierten Roh Integrierte Dichte </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:64px;"> Maus A </td><td style="width:129px;"></td><td colspan="2" style="width:320px;"> 4.79E + 07 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:64px;"> Maus - B </td><td style="width:129px;"> 0,0123 </td><td colSpanne = &quot;2&quot; style = &quot;width: 320px;&quot;&gt; 5.62E + 05 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:64px;"></td><td colspan="3" style="width:449px;"> Gekröse </td></tr><tr height="101"><td height="101" style="height:101px;width:64px;"></td><td colspan="2" style="width:193px;"> Normierte Tumorfläche </td><td style="width:256px;"> Normalisierten Roh Integrierte Dichte </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:64px;"> Maus A </td><td colspan="2" style="width:193px;"> 0,2951 </td><td style="width:256px;"> 2.22E + 07 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:64px;"> Maus - B </td><td colspan="2" style="width:193px;"> 0,0098 </td><td style="width:256px;"> 4.15E + 05 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Normalized Tumorfläche und normalisierten RohIntegrierte Dichtewerte im Omentum / Pancreas, Ovarien und Mesentery sowohl Maus A und Maus B. Pfosten Dissektion und Scannen wurde jedes Organ segmentiert und seine Fluoreszenz der Anteil der Tumorbereich zu Gesamtorganoberfläche und die Intensitäten der zur Bestimmung quantifiziert Fluoreszenz für diese Tumorarealen. Omentum / Pankreas, der Eierstöcke und Mesenteriums wurden ausgewählt, da sie die stärksten Fluoreszenzsignale in sowohl der positiven und negativen Kontrollgruppen hatten.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitation of Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metastasis at JoVE.com

Quantitation of Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.

Die Quantifizierung von Intraperitonealtest Ovarian Cancer Metastasis

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States.  Mortality is due to diagnosis of 75% of ...

quantitation-of-intra-peritoneal-ovarian-cancer-metastasis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

10.8K Aufrufe.  University of Notre Dame. Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.

Serie: Quantitation of Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metastasis

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

Background: Ovarian cancer is generally diagnosed at an advanced stage where the case/fatality ratio is high and thus remains the most lethal of all gynecologic malignancies among US women 1,2,3. Serous tumors are the most widespread forms of ovarian cancer and 4,5 the Tg-MISIIR-TAg transgenic represents the only mouse model that spontaneously develops this type of tumors. Tg-MISIIR-TAg mice express SV40 transforming region under control of the Mullerian Inhibitory Substance type II Receptor (MISIIR) gene promoter 6. Additional transgenic lines have been identified that express the SV40 TAg transgene, but do not develop ovarian tumors. Non-tumor prone mice exhibit typical lifespan for C57Bl/6 mice and are fertile. These mice can be used as syngeneic allograft recipients for tumor cells isolated from Tg-MISIIR-TAg-DR26 mice.
Objective: Although tumor imaging is possible 7, early detection of deep tumors is challenging in small living animals. To enable preclinical studies in an immunologically intact animal model for serous ovarian cancer, we describe a syngeneic mouse model for this type of ovarian cancer that permits in vivo imaging, studies of the tumor microenvironment and tumor immune responses.
Methods: We first derived a TAg+ mouse cancer cell line (MOV1) from a spontaneous ovarian tumor harvested in a 26 week-old DR26 Tg-MISIIR-TAg female. Then, we stably transduced MOV1 cells with TurboFP635 Lentivirus mammalian vector that encodes Katushka, a far-red mutant of the red fluorescent protein from sea anemone Entacmaea quadricolor with excitation/emission maxima at 588/635 nm 8,9,10. We orthotopically implanted MOV1Kat in the ovary 11,12,13,14 of non-tumor prone Tg-MISIIR-TAg female mice. Tumor progression was followed by in vivo optical imaging and tumor microenvironment was analyzed by immunohistochemistry.
Results: Orthotopically implanted MOV1Kat cells developed serous ovarian tumors. MOV1Kat tumors could be visualized by in vivo imaging up to three weeks after implantation (fig. 1) and were infiltrated with leukocytes, as observed in human ovarian cancers 15 (fig. 2).
Conclusions: We describe an orthotopic model of ovarian cancer suitable for in vivo imaging of early tumors due to the high pH-stability and photostability of Katushka in deep tissues. We propose the use of this novel syngeneic model of serous ovarian cancer for in vivo imaging studies and monitoring of tumor immune responses and immunotherapies.

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

To study in vivo tumor growth and tumor microenvironment, we used a syngeneic and orthotopic mouse model of ovarian cancer in immunocompetent animals. We transduced a mouse tumor cell line (MOV1) with Katushka fluorescent protein (MOV1KAT) and here we show its orthotopic implantation in ovary and in vivo imaging.

Einem orthotopen Modell des seröse Ovarialkarzinom in immunkompetenten Mäusen für In vivo Tumor Imaging und Überwachung der Tumor Immunantworten

Background: Ovarian cancer is generally diagnosed at an advanced stage where the case/fatality ratio is high and thus remains the most lethal of all ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Surface-enhanced Resonance Raman Scattering Nanoprobe Ratiometry for Detecting Microscopic Ovarian Cancer via Folate Receptor Targeting

Ovarian cancer represents the deadliest gynecologic malignancy. Most patients present at an advanced stage (FIGO stage III or IV), when local metastatic spread has already occurred. However, ovarian cancer has a unique pattern of metastatic spread, in that tumor implants are initially contained within the peritoneal cavity. This feature could enable, in principle, the complete resection of tumor implants with curative intent. Many of these metastatic lesions are microscopic, making them hard to identify and treat. Neutralizing such micrometastases is believed to be a major goal towards eliminating tumor recurrence and achieving long-term survival. Raman imaging with surface enhanced resonance Raman scattering nanoprobes can be used to delineate microscopic tumors with high sensitivity, due to their bright and bioorthogonal spectral signatures. Here, we describe the synthesis of two &#39;flavors&#39; of such nanoprobes: an antibody-functionalized one that targets the folate receptor &#8212; overexpressed in many ovarian cancers &#8212; and a non-targeted control nanoprobe, with&#160;distinct spectra. The nanoprobes are co-administered intraperitoneally to mouse models of metastatic human ovarian adenocarcinoma. All animal studies were approved by the Institutional Animal Care and Use Committee of Memorial Sloan Kettering Cancer Center. The peritoneal cavity of the animals is surgically exposed, washed, and scanned with a Raman microphotospectrometer. Subsequently, the Raman signatures of the two nanoprobes are decoupled using a Classical Least Squares fitting algorithm, and their respective scores divided to provide a ratiometric signal of folate-targeted over untargeted probes. In this way, microscopic metastases are visualized with high specificity. The main benefit of this approach is that the local application into the peritoneal cavity &#8212; which can be done conveniently during the surgical procedure &#8212; can tag tumors without subjecting the patient to systemic nanoparticle exposure. False positive signals stemming from non-specific binding of the nanoprobes onto visceral surfaces can be eliminated by following a ratiometric approach where targeted and non-targeted nanoprobes with distinct Raman signatures are applied as a mixture. The procedure is currently still limited by the lack of a commercial wide-field Raman imaging camera system, which once available will allow for the application of this technique in the operating theater.

Ovarian cancer forms metastases throughout the peritoneal cavity. Here, we present a protocol to make and use folate-receptor targeted surface-enhanced resonance Raman scattering nanoprobes that reveal these lesions with high specificity via ratiometric imaging. The nanoprobes are administered intraperitoneally to living mice, and the derived images correlate well with histology.

Oberfläche-verstärkte Resonanz Raman-Streuung Nanoprobe Ratiometry zur Erkennung von mikroskopischen Eierstockkrebs über Folsäure Rezeptor Targeting

Ovarian cancer represents the deadliest gynecologic malignancy. Most patients present at an advanced stage (FIGO stage III or IV), when local metastatic ...

Krebsforschung

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

The mesothelial clearance assay described here takes advantage of fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy to visualize and quantitatively measure the interactions of ovarian cancer multicellular spheroids and mesothelial cell monolayers. This assay models the early steps of ovarian cancer metastasis.

In-vitro-Assay Mesothelzellen Ausverkauf, dass die Modelle der frühen Schritte der Metastasierung Eierstockkrebs

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Medizin

An Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer using Human Stroma to Promote Metastasis

Ovarian cancer is characterized by early, diffuse metastasis with 70% of women having metastatic disease at the time of diagnosis. While elegant transgenic mouse models of ovarian cancer exist, these mice are expensive and take a long time to develop tumors. Intraperitoneal injection xenograft models lack human stroma and do not accurately model ovarian cancer metastasis. Even patient derived xenografts (PDX) do not fully recapitulate the human stromal microenvironment as serial PDX passages demonstrate significant loss of human stroma. The ability to easily model human ovarian cancer within a physiologically relevant stromal microenvironment is an unmet need. Here, the protocol presents an orthotopic ovarian cancer mouse model using human ovarian cancer cells combined with patient-derived carcinoma-associated mesenchymal stem cells (CA-MSCs). CA-MSCs are stromal progenitor cells, which drive the formation of the stromal microenvironment and support ovarian cancer growth and metastasis. This model develops early and diffuses metastasis mimicking clinical presentation. In this model, luciferase expressing ovarian cancer cells are mixed in a 1:1 ratio with CA-MSCs and injected into the ovarian bursa of NSG mice. Tumor growth and metastasis are followed serially over time using bioluminescence imaging. The resulting tumors grow aggressively and form abdominal metastases by 14 days post injection. Mice experienced significant decreases in body weight as a marker of systemic illness and increased disease burden. By day 30 post injection, mice met endpoint criteria of &gt;10% body weight loss and necropsy confirmed intra-abdominal metastasis in 100% of mice and 60%-80% lung and parenchymal liver metastasis. Collectively, orthotopic engraftment of ovarian cancer cells and stroma cells generates tumors that closely mimic the early and diffuse metastatic behavior of human ovarian cancer. Furthermore, this model provides a tool to study the role of ovarian cancer cell: stroma cell interactions in metastatic progression.

Orthotopic engraftment of ovarian cancer cells mixed with human stromal cells provides a mouse model that exhibits rapid, diffuse metastatic behavior that is characteristic of human ovarian cancer. This model also allows for the study of tumor cell and stromal cell interactions, as well as their role in tumor progression and metastasis.

Ovarian cancer is characterized by early, diffuse metastasis with 70% of women having metastatic disease at the time of diagnosis. While elegant ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

Beurteilung von Eierstockkrebs Sphäroid Bindung und Invasion von Mesothelzellen in Echtzeit

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Murine Model for Non-invasive Imaging to Detect and Monitor Ovarian Cancer Recurrence

Epithelial ovarian cancer is the most lethal gynecologic malignancy in the United States. Although patients initially respond to the current standard of care consisting of surgical debulking and combination chemotherapy consisting of platinum and taxane compounds, almost 90% of patients recur within a few years. In these patients the development of chemoresistant disease limits the efficacy of currently available chemotherapy agents and therefore contributes to the high mortality. To discover novel therapy options that can target recurrent disease, appropriate animal models that closely mimic the clinical profile of patients with recurrent ovarian cancer are required. The challenge in monitoring intra-peritoneal (i.p.) disease limits the use of i.p. models and thus most xenografts are established subcutaneously. We have developed a sensitive optical imaging platform that allows the detection and anatomical location of i.p. tumor mass. The platform includes the use of optical reporters that extend from the visible light range to near infrared, which in combination with 2-dimensional X-ray co-registration can provide anatomical location of molecular signals. Detection is significantly improved by the use of a rotation system that drives the animal to multiple angular positions for 360 degree imaging, allowing the identification of tumors that are not visible in single orientation. This platform provides a unique model to non-invasively monitor tumor growth and evaluate the efficacy of new therapies for the prevention or treatment of recurrent ovarian cancer.

We describe a non-invasive animal imaging platform that allows the detection, quantification, and monitoring of ovarian cancer growth and recurrence. This intra-peritoneal xenograft model mimics the clinical profile of patients with ovarian cancer.

Mausmodell für nicht-invasive Bildgebungs zu erfassen und zu überwachen Eierstockkrebs Rezidiv

Epithelial ovarian cancer is the most lethal gynecologic malignancy in the United States. Although patients initially respond to the current standard of ...

Etablierung eines 3D-Ex-vivo-Modells für die Interaktion zwischen Eierstockkrebs und Omentum

An Ex Vivo Model of Ovarian Cancer Peritoneal Metastasis Using Human Omentum

Ovarian cancer is the deadliest gynecologic malignancy. The omentum plays a key role in providing a supportive microenvironment to metastatic ovarian cancer cells as well as immune modulatory signals that allow tumor tolerance. However, we have limited models that closely mimic the interaction between ovarian cancer cells and adipose-rich tissues. To further understand the cellular and molecular mechanisms by which the omentum provides a pro-tumoral microenvironment, we developed a unique 3D ex vivo model of cancer cell-omentum interaction. Using human omentum, we are able to grow ovarian cancer cells within this adipose-rich microenvironment and monitor the factors responsible for tumor growth and immune regulation. In addition to providing a platform for the study of this adipose-rich tumor microenvironment, the model provides an excellent platform for the development and evaluation of novel therapeutic approaches to target metastatic cancer cells in this niche. The proposed model is easy to generate, inexpensive, and applicable to translational investigations.

Autor im Rampenlicht: Fortschrittliches Ex-vivo-Modell zur Untersuchung der Interaktion zwischen Krebs und Fett in der Mikroumgebung 

This protocol describes the establishment of a three-dimensional (3D) ex vivo model of cancer cell-omentum interaction. The model provides a platform for elucidating pro-tumor mechanisms within the adipose niche and for testing novel therapies.

Ein Ex-vivo-Modell der Peritonealmetastasierung von Eierstockkrebs mit humanem Omentum

Ovarian cancer is the deadliest gynecologic malignancy. The omentum plays a key role in providing a supportive microenvironment to metastatic ovarian ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

In vivo und ex vivo Ansätze für Eierstockkrebs Metastatische Colonization von Milky Punktstrukturen in Peritoneal Fettgewebe Studieren

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Die Quantifizierung von Intraperitonealtest Ovarian Cancer Metastasis

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video

Einem orthotopen Modell des seröse Ovarialkarzinom in immunkompetenten Mäusen für In vivo Tumor Imaging und Überwachung der Tumor Immunantworten

Oberfläche-verstärkte Resonanz Raman-Streuung Nanoprobe Ratiometry zur Erkennung von mikroskopischen Eierstockkrebs über Folsäure Rezeptor Targeting

In-vitro-Assay Mesothelzellen Ausverkauf, dass die Modelle der frühen Schritte der Metastasierung Eierstockkrebs

An Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer using Human Stroma to Promote Metastasis

Beurteilung von Eierstockkrebs Sphäroid Bindung und Invasion von Mesothelzellen in Echtzeit

Mausmodell für nicht-invasive Bildgebungs zu erfassen und zu überwachen Eierstockkrebs Rezidiv

Ein Ex-vivo-Modell der Peritonealmetastasierung von Eierstockkrebs mit humanem Omentum

Ein Ex-vivo-Modell der Peritonealmetastasierung von Eierstockkrebs mit humanem Omentum

Ein Ex-vivo-Modell der Peritonealmetastasierung von Eierstockkrebs mit humanem Omentum

In vivo und ex vivo Ansätze für Eierstockkrebs Metastatische Colonization von Milky Punktstrukturen in Peritoneal Fettgewebe Studieren