Generieren Sie zunächst virusmarkierte Assembloide unter Verwendung von schicksalsspezifischen Gehirnorganoiden. Um Reagenzien für die MEA-Oberflächenvorbehandlung vorzubereiten, lösen Sie 0,5 Gramm Waschmittelenzympulver in 50 Millilitern entionisiertem Wasser auf. Wirbeln Sie die Mischung gründlich auf, bis sich das Pulver vollständig aufgelöst hat, und sterilisieren Sie die Lösung mit einem sterilen Röhrchen-Obervakuumfilter in der Biosicherheitswerkbank.
Verdünnen Sie 500 Mikroliter des 7%igen Polyethylenimins oder der PEI-Stammlösung mit 49,5 Millilitern 1X Boratpuffer, um eine 0,07%ige PEI-Lösung herzustellen. Um die Lösung zu sterilisieren, filtrieren Sie sie durch eine 0,22-Mikrometer-Filtereinheit in der Biosicherheitswerkbank. Geben Sie anschließend einen Milliliter der 1%igen Detergenzenzymlösung in jede Vertiefung einer sterilen MEA-Platte und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius.
Entfernen Sie dann die Waschmittelenzymlösung aus jeder Vertiefung und waschen Sie die Vertiefungen fünfmal mit 1,5 Millilitern sterilem entionisiertem Wasser pro Vertiefung. Füllen Sie jede Vertiefung mit einem Milliliter Nährmedium zur Vorkonditionierung. Legen Sie die MEA-Platten für zwei Tage in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid.
Entfernen Sie nach der Inkubation das Nährmedium aus den Vertiefungen und fügen Sie 50 Mikroliter 0,07%ige PEI-Lösung hinzu, um die MEA-Elektroden für die Primärbeschichtung abzudecken. Inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Saugen Sie dann die PEI-Lösung vollständig aus jeder Vertiefung an.
Waschen Sie jede Mulde dreimal mit einem Milliliter sterilem entionisiertem Wasser. Trocknen Sie die Platten nach dem Aspirieren des Wassers 15 Minuten bei Raumtemperatur in der Biosicherheitswerkbank bei geöffnetem Deckel. Decken Sie nun den Elektrodenbereich in jeder Vertiefung mit 50 Mikrolitern einer bis 20 Volumen-zu-Volumen-Basalmembranmatrix ab, die in Nährmedien für die Sekundärbeschichtung verdünnt ist.
Legen Sie die MEA-Platten über Nacht wieder in den 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Am nächsten Tag aspirieren Sie die verdünnte Matrixlösung und hinterlassen eine dünne Schicht auf der Oberfläche. Wenn sich eine dicke Schicht bildet, besprühen Sie die Elektrodenkontaktfläche mit einer P1000-Pipettenspitze kräftig mit Nährmedien.
Sammeln Sie dann mit einer P1000-Spitze mit einem breiten Schnitt ein Assembloid aus der Schale und legen Sie es vorsichtig auf die Elektroden in einer Vertiefung, während Sie so wenig Medien wie möglich übertragen. Legen Sie die Platte unter ein Präpariermikroskop in einer Laminar-Flow-Haube und schieben Sie das Assembloid mit einer sterilen P 20-Spitze vorsichtig an die gewünschte Stelle. Verwenden Sie eine P 20-Spitze, um überschüssige Flüssigkeit um das Assembloid herum zu entfernen.
Nehmen Sie nach der Inkubation die Platte aus dem Inkubator. Tragen Sie dann unter einem Präpariermikroskop zwei bis drei kleine Tropfen einer bis 50 in Nährmedien verdünnten Basalmembranmatrix auf die Assembloide auf und stellen Sie die Platte für weitere 30 Minuten in den Inkubator zurück. Geben Sie anschließend vorsichtig drei Tropfen Nährmedium mit einem Präpariermikroskop in die Nähe der Assembloide.
Prüfen Sie am nächsten Tag, ob sich die Assembloide unter einem Präpariermikroskop abgesetzt und stabilisiert haben. Fügen Sie 750 Mikroliter Nährmedien hinzu, um das Gesamtvolumen auf einen Milliliter pro Vertiefung zu bringen, und lassen Sie die Platte mindestens zwei Tage lang ungestört im Inkubator. Entfernen Sie jede Woche vorsichtig 500 Mikroliter Nährmedien aus jeder Vertiefung und geben Sie frische 700 Mikroliter neurophysiologisches Basalmedium in jede Vertiefung.
An Tag 92 wurde eine erhöhte Dauer des Netzwerk-Burstings im Vergleich zu Tag 78 beobachtet, was wahrscheinlich auf die Reifung der Neuronen zurückzuführen ist. Die Zell- und Netzwerkaktivität ließ bis zum 125. Tag langsam nach.
