Die Technik, die wir heute vorstellen, ermöglicht die Analyse der Aktivität von Rückenmarksneuronen als Ergebnis des intrinsischen neuronalen Faktors und des Einflusses der umgebenden Astrozyten. Diese Technik erzeugt zuverlässig sowohl menschliche Neuronen als auch menschliche Astrozyten, die rückenmarksspezifisch sind und ein funktionelles Leistungsmaß verwenden, das für die Reproduzierbarkeit skaliert werden kann. Die Technik, die wir vorstellen, ermöglicht es, Rückenmarksneuronen spezifische Krankheiten wie amyotrophe Lateralsklerose zu untersuchen, indem Neuronen von Patienten mit sporadischen oder genetischen Erkrankungen verwendet werden.
Untersuchen Sie zunächst die menschlichen iPSC-Platten auf ausreichend dichte Kolonien, so dass das Zentrum der Kolonien verstreute weiße Flächen aufweist. Um dann mit dem Verpacken der Zellen zu beginnen, zeichnen Sie mit einem Marker Gitterlinien auf die untere Außenfläche der Platten, um eine genaue Abdeckung der gesamten Platte zu ermöglichen. Verwenden Sie ein Phasenkontrastmikroskop mit 10-facher Vergrößerung in einer Kulturhaube, um differenzierte Kolonien durch manuelles Abkratzen mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze zu entfernen.
Als nächstes spülen Sie die Platten zweimal mit PBS. Und dann fügen Sie fünf Milliliter Gewebedissoziationsprotease hinzu, die bei 37 Grad Celsius vorgewärmt sind. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für vier bis sieben Minuten, bis sich die Ränder der Kolonien aufrunden, bevor Sie die Kolonien von der Platte heben.
Die Dissoziationsprotease vorsichtig absaugen und die Platte zweimal vorsichtig mit PBS abspülen, ohne die Kolonien zu entfernen. Fünf Milliliter vorgewärmtes humanes iPSC-Medium in die Kulturplatte geben. Dann zerkratzen Sie die gesamte Platte mit einer Spitze einer Fünf-Milliliter-Pipette mit einer Hin- und Herbewegung von oben nach unten und heben Sie die Kolonien an, während Sie sie in kleinere Zellaggregate zerlegen.
Zur Differenzierung von humanen iPS-Zellen in neuronale Vorläuferzellen. Sobald menschliches iPSC eine Monoschicht bildet und zu 90% konfluent wird, beginnen Sie mit der Differenzierung, wie im Manuskript beschrieben. Am 12. Tag, nach der Trypsinbehandlung, wenn die Zellen nicht in Suspension sind, löst man die Zellen mechanisch ab, indem man neuronales Induktionsmedium aus einer 1000-Mikroliter-Pipettenspitze mit einer kreisförmigen Bewegung auf die Zellen ausstößt, um die gesamte Oberfläche zu bedecken.
Wenn die neuronalen Vorläuferzellkulturen eingefroren wurden, tauen Sie sie auf. Nach dem Austausch des Mediums und der PBS-Spülung, wie im Manuskript beschrieben, wird das Medium mit einem Differenzierungsmedium für Motoneuronen gewechselt, das 0,02 mikromolare Cytosinarabinosid enthält, und dann die Zellen 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid inkubiert, wenn gliale Vorläuferzellen als einzelne proliferierende flache Zellen unter postmitotischen Motoneuron-Vorläuferzellen auftauchen. aggregiert in Zellclustern. Später wurde ein Medienaustausch durchgeführt, wie im Manuskript angegeben.
Beginnen Sie am Tag der Beschichtung oder davor mit der Beschichtung der 24-Well-MEA-Platten, indem Sie PLO zuerst in Wasser oder PBS verdünnen. Fügen Sie dann 15 bis 20 Mikroliter PLO zu jeder Vertiefung hinzu und bilden Sie einen Tropfen in der Mitte der Vertiefung, der den Elektrodenbereich abdeckt, um sicherzustellen, dass die Elektroden nicht mit der Pipettenspitze beschädigt werden. Geben Sie Wasser in die Kammern um die Brunnen herum und sorgen Sie für ausreichende Luftfeuchtigkeit.
Und PLO bei 37 Grad Celsius für ein bis zwei Stunden inkubieren. Saugen Sie dann mit einer Mikropipettenspitze aus Kunststoff so viel PLO wie möglich ab, ohne die Elektroden zu berühren. Als nächstes waschen Sie den Brunnen dreimal mit 250 Mikroliter Wasser.
Entfernen Sie mit einer Pipettenspitze so viel Wasser wie möglich und lassen Sie die Oberfläche mit entferntem Deckel trocknen. Als nächstes fügen Sie 15 bis 20 Mikroliter verdünntes Laminin hinzu, um jedes Elektrodenarray abzudecken. Nachdem Sie Wasser in die Feuchtigkeitsfächer gegeben und den Deckel ausgetauscht haben, inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für mindestens zwei Stunden bis über Nacht.
Am Tag der Beschichtung, nachdem Sie die Motoneuronen und Astrozytenkulturen einmal mit PBS gespült haben, fügen Sie 0,05% Trypsin hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für etwa fünf Minuten, um die Zellen zu heben. Sammeln Sie Zellen in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen, das Trypsin-Inhibitor enthält. Und waschen Sie Platten mit Medium oder Basis, um sicherzustellen, dass alle Zellen gesammelt werden.
Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrierung. Anschließend werden Motoneuronen und Astrozyten mit einer 1000-Mikroliter-Pipette mit einem Co-Kulturmedium, das 20 Mikromolare ROCK-Inhibitoren enthält, resuspendiert, um einen Milliliter einer Einzelzellsuspension zu erzeugen. Zählen Sie mit einem Hämozytometer die Motoneuronen und Astrozyten.
Und während des Zählens, behielt man die Zellsuspensionen und legte sie in ein Styroporgestell bei vier Grad Celsius. Zentrifugieren Sie einen Milliliter beider Zellsuspensionen bei 300-fachem G für fünf Minuten. Berechnen Sie das gewünschte Volumen und resuspendieren Sie die Pellets.
Kombinieren Sie das erforderliche Volumen an Neuronen- und Astrozytensuspensionen in gleichen Verhältnissen und mischen Sie vorsichtig durch zweimaliges Pipettieren, um gründlich zu kombinieren. Entfernen Sie dann Laminin aus jeder Vertiefung der Platte und übertragen Sie 10 Mikroliter der endgültigen kombinierten Zellsuspension in jede Vertiefung, wodurch ein kleiner Tropfen entsteht, der das Elektrodenarray bedeckt. Inkubieren Sie die Platten mit einem ungestörten Zelltröpfchen bei 37 Grad Celsius für 20 bis 30 Minuten, um erste Anhaftungen auf den Platten zu bilden.
Dann pipettieren Sie 250 Mikroliter warmes Co-Culture-Medium, das ROCK-Inhibitor enthält, auf die Wand jedes Wells und pipettieren Sie das gleiche Volumen an die gegenüberliegende Wand jedes Wells und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 24 bis 36 Stunden. Untersuchen Sie am nächsten Tag die Platten auf Trümmer oder tote Zellen. Tauschen Sie das Medium bei Bedarf gegen ein frisches Co-Kulturmedium aus, das einen ROCK-Inhibitor enthält.
Andernfalls führen Sie ab dem zweiten Tag der Kokultur zweimal pro Woche einen Austausch des halben Mediums mit einem Co-Kulturmedium ohne ROCK-Inhibitor durch. Um die Aufzeichnung durchzuführen, beginnen Sie so schnell wie möglich nach dem ersten Tag der Co-Kultur, indem Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius und Kohlendioxid auf 5% einstellen. Zeichnen Sie die Basisaktivität jeden zweiten Tag oder wöchentlich über ein bis 15 Minuten auf, abhängig vom Versuchsdesign.
Um die vorübergehenden elektrophysiologischen Wirkungen von Verbindungen zu untersuchen, die entweder auf Neuronen oder Astrozyten abzielen, entfernen Sie den Plattendeckel, halten Sie den Maschinendeckel jedoch geschlossen und zeichnen Sie die Basisaktivität für mindestens eine Minute auf. Öffnen Sie den Maschinendeckel manuell, ohne die elektrophysiologische Aufzeichnung zu unterbrechen, und tauschen Sie 25 Mikroliter Medium mit dem entsprechenden Medikamentenvehikel aus. Schließen Sie dann den Deckel manuell und zeichnen Sie bei Bedarf für weitere Minuten auf.
Testen Sie in ähnlicher Weise die Droge von Interesse. In diesem Protokoll wurden hiPS-Zellen beibehalten und als nicht-konfluente Kolonien durchquert. Die Neurogenese wurde durch duale SMAD-Hemmung durch Inaktivierung von BMP- und TGF-beta-Signalwegen initiiert.
Die resultierenden neuroepithelialen Stammzellen teilten sich und erzeugten ein mehrschichtiges Epithel. Die frühe Exposition gegenüber neuronalen Wachstumsfaktoren und einem gliogenen ciliären neurotrophen Faktor erzeugte eine gemischte Population von Vorläuferzellen. Neuronen entstanden spontan aus dieser gemischten Population.
Der gliogene Schalter induzierte die Astrozytendifferenzierung durch Aktivierung des JAK-STAT-Signalwegs. Die Rückenmarksidentität von mit Notch-Inhibitoren behandelten und differenzierten Motoneuronenzellen wurde durch hohe Cholin-Acetyltransferase-Expressionsniveaus unterstützt. Am 90. Tag nach der In-vitro-Kultur zeigten die menschlichen iPSC-Astrozyten einen reifenden Phänotyp, der durch S100-beta- und GFAP-Expression angezeigt wurde, während ihre regionale Rückenmarksidentität durch die Expression von Falken zuvor unterstützt wurde.
Co-kultivierte Zellen ordneten sich spontan neu an, wobei Astrozyten eine Fütterungsschicht an der Unterseite und Neuronen bildeten, die Netzwerke an der Spitze miteinander verbanden. Neuronen aggregierten in großen Zellclustern, wenn sie allein kultiviert wurden, während die Co-Kultur von menschlichen iPSC-Motoneuronen mit menschlichen iPSC-Astrozyten zu gleichmäßig verteilten Monoschichten führte. Humane iPSC-Astrozyten verstärkten die elektrophysiologische Reifung menschlicher iPSC-Motoneuronen, was sich in höheren Spiking- und Bursting-Aktivitäten in den Kokulturen zeigte.
Unserer Erfahrung nach sind die Stammzellkultur und die frühe NPC-Differenzierung am schwierigsten und anfälligsten für technische Fehler. In diesem Stadium dürfen die Techniken nicht mit Konsistenz und Genauigkeit mit wenig Spielraum für die Fehlersuche durchgeführt werden. Die hier beschriebenen Kokulturtechniken können auch in anderen zelltypspezifischen Modellen verwendet werden.
