Nehmen Sie zu Beginn die FN-Seidenfläschchen aus dem Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius und legen Sie sie für den Transport in Trockeneis. Bringen Sie die Fläschchen in eine biologische Sicherheitswerkbank und legen Sie sie in ein Gestell für Mikrozentrifugenröhrchen. Pipettieren Sie nach dem Auftauen 550 Mikroliter Seidenlösung in jede zweite Vertiefung einer 48-Well-Platte.
Lege den Deckel auf die Platte und lege sie in eine sterile Box. Transportieren Sie die Box vorsichtig aus der biologischen Sicherheitswerkbank und lassen Sie sie über Nacht unter Umgebungsbedingungen stehen. Bringen Sie am nächsten Tag die Box mit der Platte mit den FN-Seidenmembranen und den sterilen Einlagen in die biologische Sicherheitswerkbank.
Heben Sie die Platte vorsichtig aus der Schachtel, öffnen Sie den Deckel der Platte und überprüfen Sie visuell die Membranbildung, indem Sie die Trübung in den Vertiefungen beobachten. Nehmen Sie mit einer sterilen Pinzette einen Einsatz auf und führen Sie ihn auf die Membran, bis die Griffe die Oberseite der Vertiefung berühren. Sobald alle Einsätze abgesenkt sind, setzen Sie den Deckel auf die Platte und legen Sie die Platte wieder in die sterile Box.
Lassen Sie die Membranen zwei Stunden lang an den Einsätzen haften. Nehmen Sie anschließend die Platte aus der Box und öffnen Sie den Deckel. Entfernen Sie den Einsatz mit einer sterilen Pinzette aus der Vertiefung.
Füllen Sie den Einsatz mit 100 Mikrolitern DMEM/F12 für die basale Aussaat oder 200 Mikroliter für die apikale Aussaat. Übertragen Sie den Einsatz in eine leere Vertiefung einer 24-Well-Platte und füllen Sie die Vertiefung mit einem Milliliter DMEM/F12. Nach der Entnahme der gewünschten Anzahl menschlicher Keratinozyten werden mit einer P200-Pipette 20 bis 50 Mikroliter Zellsuspension aspiriert.
Richten Sie die Pipettenspitze auf die Mitte der Membran und drücken Sie langsam auf den Pipettenkolben, so dass der Tropfen mit dem Nährmedium im Inneren des Einsatzes in Kontakt kommt. Sobald alle Membranen übertragen sind, bewegen Sie die Platte in einem Achtermuster, um die Zellen gleichmäßig über die Membranen zu verteilen. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.
Heben Sie die Einsätze mit einer Pinzette aus der 24-Well-Platte und lassen Sie das Kulturmedium in den Wells. Drehen Sie dann den Einsatz so um, dass die Basalseite nach oben zeigt. Legen Sie den umgedrehten Einsatz in die Petrischale.
Aspirieren Sie 20 Mikroliter der resuspendierten Suspension der humanen Keratinozytenzellen mit einer P200-Pipette. Richten Sie die Pipettenspitze auf die Mitte der Membran und drücken Sie langsam auf den Pipettenkolben, um ein Tröpfchen zu bilden, das auf die Membran fällt. Lege den Deckel auf die Petrischale.
Übertragen Sie die Petrischale und die mediumhaltige 24-Well-Platte für 30 Minuten in den Inkubator. Nach der Inkubation bringen Sie die 24-Well-Platte und die Petrischale in die biologische Sicherheitswerkbank. Nehmen Sie mit einer Pinzette einen Einsatz und drehen Sie ihn so um, dass die apikale Seite der Membran nach oben und die Basalseite nach unten zeigt.
Geben Sie mit einer P200-Pipette 200 Mikroliter Nährmedium in den Einsatz. Setzen Sie den Einsatz wieder in eine vorgefüllte Vertiefung der 24-Well-Platte ein. Kultivieren Sie die Einsätze bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.
Keratinozyten, die auf der FN-Seidenmembran kultiviert wurden, bedeckten die Oberfläche gleichmäßig und zeigten am ersten Tag eine Kopfsteinpflastermorphologie. Keratinozyten bildeten am dritten Tag eine konfluente Schicht, was auf eine Epithelfunktion hinweist, und bildeten ein Netzwerk von Tight Junctions, was darauf hindeutet, dass sie physiologische Epithelfunktionen übernahmen. Nach drei Tagen wurde eine hohe Zellviabilität in den FN-Seidenmembranen beobachtet, ohne signifikanten Unterschied in der Viabilität zwischen Zentrum und Peripherie.
Das FN-Seidenmembransystem unterstützte eine ähnliche oder bessere Lebensfähigkeit der Keratinozyten als kommerzielle PET-Membransysteme.
