Name: manufacture and drug delivery applications of silk nanoparticles
Uploaded: 2016-10-08T15:00:00.000+00:00
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This research was supported by a Marie Curie FP7 Career Integration Grant 334134 within the seventh European Union Framework Program.

1. Herstellung eines Reverse-Engineering Silk - Lösung von Bombyx mori Cocoons HINWEIS: Diese Methode basiert auf Protokolle an anderer Stelle 12,27 beschrieben. <ol><li> Schneiden 5 g getrocknetes Kokons mit einer Schere in 5 mm x 5 mm große Stücke. Entfernen Sie alle verschmutzte Schichten. </li><li> Man wiegt 4,24 g Natriumcarbonat und fügen Sie diese sorgfältig zu 2 l destilliertem Wasser kocht. HINWEIS: Dies ergibt eine 0,02 M Natriumcarbonat-Lösung. </li><li> Fügen Sie die geschnittenen Kokon Stücke zum Kochen Natriumcarbonatlösung und kochen für 60 min die Seidenfasern zu DEGUM. Rühren Sie die Seide gelegentlich homogene Probenverarbeitung zu gewährleisten. </li><li> Entfernen Sie die entschleimt Seide und waschen mit 1 l destilliertem Wasser für 20 min; Wiederholung der Waschstufe mindestens 3 mal. </li><li> Entfernen Sie die gewaschener Seide und drücken Sie es gut um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, und dann lösen / ziehen die Seide von Hand. Legen Sie die ungebundene Seide in einem Abzug über Nacht trocknen an der Luft. Dies ergibt typischerweise 3,6 g entschleimt silk Fasern. </li><li> Am nächsten Tag wiegen 5 g luftgetrocknete entschleimt Seidenfasern und packen die Seide fest in den Boden eines 50 ml-Becher. </li><li> Eine frische 9,3 M LiBr-Lösung. Man löst die Seidenfasern in LiBr mit einer 1 g Seide bis 4 ml LiBr-Verhältnis. Decken Sie die Seide LiBr Probe mit Aluminiumfolie Verdunstung verhindern und damit die Seide zu lösen vollständig bei 60 ° C. Dieser Schritt dauert 4 Stunden und wird von gelegentlichem Rühren unterstützt. </li><li> Benetzen eine Dialysekassette (Molekulargewicht cut-off von 3.500 Da) in Wasser für 5 min. Injizieren Sie 15 ml der Seide LiBr-Lösung in die 15 ml Dialysekassette und die Verwendung einer Nadel und Spritze Luftblasen zu entfernen. </li><li> Dialysieren gegen 1 l destilliertes Wasser und das Wasser wechseln bei 1, 3 und 6 Stunden (dh 3 Änderungen am ersten Tag) und wieder am nächsten Morgen und am Abend (dh 2 Änderungen am zweiten Tag) und wieder am nächsten Morgen (dh 1 Änderung am dritten Tag). </li><li> Sammeln Sie die Seide solutiauf von der Dialysekassette und Zentrifuge die Lösung 20 min bei 5 ° C bei 9.500 x g. Gewinnen Sie den Überstand und wiederholen Sie diesen Zentrifugierprozesses zweimal. </li><li> Bestimmen Sie das Gewicht eines leeren Wiegeschiffchen (W1) und 1 ml der Seiden Lösung. Nehmen Sie das Gewicht wieder (W2) und dann die Probe trocken durch das Wiegeschiffchen bei 60 ºC über Nacht verlassen. Als nächstes wird das gesamte Trockengewicht (W3) (getrocknet Seide und Wiegeschiffchen) bestimmen. Die Konzentration der Seidenlösung (w / v) beträgt:% = (W3-W1 / W2-W1) x 100. </li></ol> 2. Herstellung von Seide Nanopartikel aus Reverse-Engineering Silk-Lösung <ol><li> Fügen eine 5% (w / v) Seiden Lösung tropfenweise zu Aceton während eine&gt; 75% aufrechterhalten (v / v) Acetonlösung. Beispielsweise fügen 9 ml einer 5% (w / v) Seiden Lösung tropfenweise (10 &amp; mgr; l / Drop mit einer Geschwindigkeit von 50 Tropfen / min) auf 34 ml Aceton. </li><li> Zentrifugieren der Niederschlag bei 48.000 xg für 2 h bei 4 ° C. </li><li> Den Überstand aspirieren und resuspendieren pellet in destilliertem Wasser, indem man zuerst das Pellet mit einem Spatel Verdrängen und dann Zugabe von 20 ml destilliertem Wasser. Verwenden Sie Pipettenspitzen des Pellets aus dem Spachtel zu entfernen. Nach Vortexen für 20 Sekunden durch zwei Beschallungszyklen gefolgt für eine Ultraschallsonde bei 30% Amplitude unter Verwendung von 30 sec, oben das Zentrifugenröhrchen, um die Kapazität mit destilliertem Wasser. </li><li> Wiederholen Sie die Zentrifugation und Resuspension Schritt mindestens zweimal. </li><li> Das Pellet in 6 ml destilliertem Wasser, wie bei 4 ° C bis zur Verwendung in 2.3 und speichern beschrieben. Für Zellkulturstudien, Seide Nanopartikel Aktien können Gamma sein 17 bestrahlt. </li></ol> 3. Bestimmung der Silk Nanoparticle Concentration <ol><li> Zentrifuge Seiden Nanopartikel bei 48.000 xg für 2 h bei 4 ° C. </li><li> Sammle alle Nanopartikel in 3 ml destilliertem Wasser, gefolgt von zwei Beschallungszyklen bei 30% Amplitude für 30 sec. </li><li> Teilen Sie die 3 ml Lager aus Seide Nanopartikel in 2 ml und 1 ml-Portionen und Transfer in prE-wog 2-ml-Röhrchen. Notieren Sie die Gesamtgewicht der 2 ml Probe. Bewahren Sie die 1 ml Menge bei 4 ° C bis zur Verwendung; Diese 1 ml-Probe wird verwendet, um eine Kalibrierungskurve zu erzeugen. </li><li> Schnellfrost und dann lyophilisieren die 2 ml Seide Nanopartikel Menge in einem Gefriertrockner über Nacht. Nach Gefriertrocknung, reweigh die 2-ml-Röhrchen und berechnen die Menge an Seide Nanopartikel (mg), die ursprünglich in der 2-ml-Probe war. </li><li> Verdünnen Sie die 1 ml Seide Nanopartikel Lager mit destilliertem Wasser zu erzeugen, einen 5-Punkt-Kalibrierungskurve (0,04-7 mg / ml). Stellen Sie sicher, dass die Proben nicht das Absorptionsmaximum überschreiten. </li><li> Bestimmen Sie die Absorption jeder Standardverdünnung bei 600 nm. Dies wird am besten mit einem 96-Well-Platte-Setup. Plot der Absorption gegen die Konzentration (mg / ml) für die Standardkurve. Dann verwenden Sie diese Standardkurve routinemäßig die Konzentration von Seide Nanopartikel in Suspensionen zu bestimmen. </li></ol> 4. Herstellung von Doxorubicin-beladenen Nanopartikeln Silk <ol><li&gt; Vorbereitung der Doxorubicin-Lösung <ol><li> Man löst 1,2 mg Doxorubicin HCl in 8 ml destilliertem Wasser. </li><li> Machen Sie bis zu 10 ml mit destilliertem Wasser ein Arbeits Bestand von 116 ug / ml zu erhalten (0,2 mmol / ml). </li></ol></li><li> Herstellung von Doxorubicin-beladenen Nanopartikeln Silk <ol><li> Mix 2 ml von 0,2 &amp; mgr; mol / ml Doxorubicin-Lösung mit 200 &amp; mgr; l von 10, 30 oder 50 mg / ml von Seiden Nanopartikel in einem 2 ml Röhrchen. </li><li> Inkubieren Sie die Seide-Doxorubicin Suspension bei Raumtemperatur (25 ° C) über Nacht auf einem Rotationsmischer. </li><li> Als nächstes Zentrifuge die Seide-Doxorubicin Suspension bei 194.000 × g für 30 min. Waschen Sie die Doxorubicin beladenen Nanopartikel Seide mit destilliertem Wasser und wiederholen Sie den Vorgang noch zweimal. </li><li> Pool den Überstand und beachten Sie das Gesamtvolumen (in diesem Beispiel verwendet wird, um die Verkapselungswirksamkeit zu bestimmen). </li><li> Resuspendieren der Doxorubicin beladenen Nanopartikel Seide in destilliertem Wasser, vor Licht schützen und lagern bei 4 ° C until Einsatz. </li></ol></li><li> Bestimmung der Encapsulation Efficiency and Drug Loading <ol><li> Jeweils 200 &amp; mgr; l des Überstandes aus Schritt 4.2.4 in einer schwarzen Mikrotiterplatte. </li><li> Verwenden Sie ein Fluoreszenz-Mikroplattenlese Doxorubicin-assoziierte Fluoreszenz bei einer festen Photomultiplier Einstellung zu messen. </li><li> Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 485 nm und die Emissionswellenlänge auf 590 nm und die Fluoreszenzwerte aufzuzeichnen. </li><li> Generieren Sie eine Doxorubicin Kalibrierungskurve. Sicherzustellen Messungen sind mit gleichen Instrumenteneinstellungen erfasst (dh mit einer festen Photomultiplier - Einstellung). Unter Verwendung der Kalibrierungskurve, die Berechnung der Doxorubicin-Konzentration in der kombinierten Überstand. Wiederholen Sie diese Messung in drei unabhängigen Experimenten. </li><li> Verwenden der Gleichung (1) Einkapselungseffizienz zu bestimmen: <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/54669/54669equation1.jpg" /></li></ol></li></ol> 5. Charakterisierung von Silk NanoTeilchen <ol><li> Beurteilung der Größe und Zeta-Potential von frisch hergestellt und gelagert Silk Nanopartikel. <ol><li> Store Seiden Nanopartikel in destilliertem Wasser bei 4 ° C und 25 ° C. </li><li> Messen Sie die Größe und Zeta-Potential der Seide Nanopartikel an den Tagen 0, 14 und 28 unter Verwendung der dynamischen Lichtstreuung (DLS). Stellen Brechungsindizes auf 1,33 für destilliertes Wasser und 1,60 für Protein 17. Berechnen Partikelgrößen mit der Benutzeroberfläche Software. </li></ol></li><li> Morphologische Bewertung der Silk-Nanopartikeln durch Rasterelektronenmikroskopie (SEM). <ol><li> Legen Sie eine Kohlenstoff Haftscheibe auf eine SEM-Stub und befestigen Sie anschließend einen Siliziumwafer. </li><li> Verdünnte Seiden Nanopartikel bis zu einer Konzentration von 1 mg / ml. Je 10 ul der Probe auf einen Siliziumwafer, gefrieren die Probe bei -80 ° C und über Nacht lyophilisieren eine Gefriertrocknungssystem gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Bestreichen Sie die Probe mit einer Goldschicht von bis zu 20 nm dickmit einem niedrigen Vakuum-Sputter-Beschichtungsvorrichtung. HINWEIS: Die Einstellungen des Geräts variieren zwischen den Modellen. Das Modell hier verwendet wird, ist voll automatisiert und arbeitet nur mit der Dicke. </li><li> Bildproben mit einem Rasterelektronenmikroskop bei 5 kV und einer 40.000-fachen Vergrößerung. </li></ol></li></ol> 6. In - vitro - Zytotoxizität von Kontrolle und-Doxorubicin beladen Silk Nanopartikel <ol><li> Die Lebensfähigkeit der Zellen nach Exposition mit Silk Nanopartikel. <ol><li> Kultur MDA-MB-231-Zellen in RPMI 1640 mit 10% v / v FBS. Platten Zellen auf Gewebskultur - Polystyrol behandelt und bei 37 ° C in einem befeuchteten 5% CO 2 -Atmosphäre inkubiert. alle 2-3 Tage Subkultur Routinemäßig bei 80% Konfluenz. </li><li> Platte MDA-MB-231 - Zellen in einer Dichte von 2 x 10 4 Zellen / cm 2 in 96-Well - Platten. Lassen Sie die Zellen über Nacht zu erholen. </li><li> In (i) 0,001 bis 1 &amp; mgr; g frei diffusionsfähig Doxorubicin, (ii) von 0,001 bis 0,5 mg Seide Nanopartikel und 0,1 mg Seide Nanopartikelbeladen mit 0,001 bis 1 &amp; mgr; g Doxorubicin in 96-Well-Platten (Endvolumen 100 ul pro Vertiefung). </li><li> Bestimmen , die Lebensfähigkeit der Zellen und die halbmaximale inhibitorische Konzentration (IC 50) durch Zugabe von (3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT von 5 mg / ml in PBS) bei 72 h. Inkubieren 5 Stunden, abtropfen lassen Sie sorgfältig die Vertiefungen mit einer Pipette und die Formazan mit 100 ul Dimethylsulfoxid aufzulösen. die Absorption bei 560 nm messen. diese Messung in drei unabhängigen Experimenten wiederholen. HINWEIS: Die Absorptionswerte von unbehandelten Kontrollen dienen als Referenzwert für 100% der Lebensfähigkeit der Zellen. </li></ol></li><li> SEM von Zellen Exposed Silk Nanopartikel. <ol><li> Seed MDA-MB-231 Zellen auf sterilen Glasdeckgläschen in einer Dichte von 2 x 10 4 Zellen / cm 2. Lassen Sie die Zellen über Nacht zu erholen. Belichten der Zellen zu den gewünschten Behandlungsbedingungen für 72 Stunden. </li><li> Fixieren die Zellen mit 2% v / v Glutaraldehyd in PBS für 30 min, wasche mit digestillt Wasser zweimal, dehydrieren mit einer Ethanol - Serie und kritischen Punkt die Proben trocknen, wie an anderer Stelle 28 ausführlich beschrieben. </li><li> Sputter-Beschichtung der Proben mit einer Goldschicht von bis zu 20 nm Dicke mit einem niedrigen Vakuum-Sputter-Beschichtungsvorrichtung. HINWEIS: Die Einstellungen des Geräts variieren zwischen den Modellen. Das Modell hier verwendet wird, ist voll automatisiert und arbeitet nur mit der Dicke. </li><li> Bild die Proben durch SEM eine Elektronenbeschleunigung von 5 kV und 700-facher Vergrößerung verwendet wird. </li></ol></li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+silk+processing+in+insects+and+spiders.">Mechanism of silk processing in insects and spiders.</a> Nature. 424 (6952), 1057-1061 (2003).</li><li>Yhr Bae, ., Park, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+drug+delivery+to+tumors:+myths,+reality+and+possibility.">Targeted drug delivery to tumors: myths, reality and possibility.</a> J. Control. Release. 153 (3), 198-205 (2011).</li><li>Lammel, A., Schwab, M., Hofer, M., Winter, G., Scheibel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+spider+silk+particles+as+drug+delivery+vehicles.">Recombinant spider silk particles as drug delivery vehicles.</a> Biomaterials. 32 (8), 2233-2240 (2011).</li><li>Holliday, D. L., Speirs, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+the+right+cell+line+for+breast+cancer+research.">Choosing the right cell line for breast cancer research.</a> Breast. Cancer. Res. 13, 215 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Verschiedene Methoden stehen zur Verfügung Seide Nanopartikel zu erzeugen, einschließlich Polyvinylalkohol 20 Mischen, Spray 21 Trocknen, Aussalzen 22, Kapillare microdot 23 Druck, überkritischem CO 2 Fällung 24 und Nanopräzipitation 16,25 ( zusammengefasst in Bezug 26). Allerdings Nanopräzipitation aufgrund seiner Gesamt Einfachheit ist die beliebteste Technik für Seide Nanopartikel zu erzeugen. Daher war das Ziel dieser Stud...

Nano-Größe Drug-Delivery-Systeme werden oft verwendet, Wirkstofffreisetzung zu steuern und eine vielfältige Reihe von therapeutischen Nutzlasten zu liefern - zum Beispiel Proteine, Peptide und kleine Molekulargewicht Drogen - Zellen und Gewebe zu zielen. Diese therapeutischen Nutzlasten werden oft in verschiedene makromolekulares Arzneimittelträger eingearbeitet, wie Liposome, wasserlösliche Polymere (einschließlich Dendrimere) und Mikro- und Nanopartikel 1. Nanopartikel ( in der Regel in einem Größenbereich von 1 nm bis 1000 nm) werden als potenzielle Wirkstoffträger weit erforscht, vor allem für Anti - Krebs - Medikamentenabgabe 2. Die erfolgreiche Einführung von Abraxane (120 nm großen Albumin-basierte Nanopartikel mit Paclitaxel beladen) in der klinischen Routine 3 hat das Feld katalysiert, so dass noch viele weitere Nanopartikel für Drug Delivery jetzt betreten klinischen Studien 4. Solide Tumoren zeigen in der Regel schlechte Lymphdrainage und haben undichte Blutgefäße, was bedeutet, dass nanoparticles von bis zu 200 nm passiv zu diesen Tumoren nach intravenöser Verabreichung gezielt werden. Dieses passive Targeting Phänomen ist die erhöhte Permeabilität und Retention (EPR) Effekt genannt und wurde erstmals 1986 5 angegeben. Der EPR - Effekt zu einer 50- bis 100-fache Erhöhung der Arzneimittelkonzentrationen im Tumor - Mikroumgebung für eine bestimmte Medikamentendosis führen kann , wenn die Droge Nutzlast ist ein hochmolekulares Wirkstoffträger-Ansatz, anstatt die freie Arzneimittel ohne Träger geliefert. Drug beladene Nanopartikel für Anti - Krebs - Medikamentenabgabe entwickelt haben den Tumor - Mikroumgebung zu erreichen und oft muss eine bestimmte intrazelluläre Kompartiment, in der Regel durch endocytic Aufnahme eingeben, für das Medikament seine gewünschten therapeutischen Effekt 3 zu erzielen. Nanopartikel die für intrazelluläre Arzneimittelabgabe auszunutzen Endozytose als Gateway in die Zelle als auch einen Weg Arzneimittelresistenzmechanismen zu überwinden. Die Wirkstofffreisetzung von Nanopartikeln wird häufig speziell entwickelt, um oCCur in Lysosomen (dh lysosomotropes Arzneimittelabgabe) 6 , wobei der pH - Wert Ansprechverhalten des Nanopartikel - Träger (lysosomalen pH ca. 4,5) als Auslöser für die Wirkstofffreisetzung oder lysosomale Enzyme, die die Nutzlast von dem Träger 7 befreien dienen kann. Viele unterschiedliche Klassen von Materialien können verwendet werden Nanopartikel zu erzeugen (beispielsweise Metallen und vielen organischen und anorganischen Materialien). Allerdings Biopolymere sind , sich als attraktive Materialien aufgrund ihrer bekannten Biokompatibilität, die biologische Abbaubarkeit und geringe Toxizität 8. Viele Biopolymere werden erforscht, einschließlich Albumin, Alginat, Chitosan und Seide. Von diesen Seide hat sich als vielversprechende Anwärter für die Entwicklung in Systeme 9 Arzneimittelabgabe entstanden. Seiden verschiedener Typen werden durch eine Anzahl von Arthropoden hergestellt, einschließlich Spinnen (zB Nephila clavipes) und Seidenraupen (zB Bombyx mori). Silkworm Seide wird weit mehr exten verwendetlich als Spinnenseide, weil die Seidenraupe ist vollständig domestiziert und seine Seide stellt somit ein reproduzierbares Ausgangsmaterial. Silkworm Seide ist ein Food and Drug Administration (FDA) genehmigt Material für den menschlichen Gebrauch, insbesondere als Nahtmaterial; es verfügt über eine robuste Sicherheitsstandard bei Menschen und bekannt ist , 10 in vivo abzubauen. Der Abbauprofil von Seide kann fein abgestimmt werden von Stunden (niedrige kristalline Seide) zu 12 Monaten oder mehr (hohe kristalline Seide) zu reichen. Seidenabbauprodukte nicht toxisch sind und in dem Körper 10 metabolisiert. Die Seide Struktur verleiht die Fähigkeit , 11 kleine molekulare Verbindungen und hochmolekularen Proteinwirkstoffen zu binden, ist es ein gutes Material für die kontrollierte Wirkstofffreisetzung zu machen. Protein Medikamente (zB Antikörper) sind anfällig für Denaturierung, Aggregation, proteolytische Spaltung und Clearance durch das Immunsystem. Allerdings Seide stabilisiert therapeutische Proteine ​​aufgrund der Pufferkapazität seiner nanokristallinem WiederRegionen und ihre Fähigkeit , Wassergehalt im Nanobereich 11 anzupassen. Diese einzigartigen Eigenschaften bieten physischen Schutz und reduzieren Nutzlast Mobilität 11 und sind in der Regel nicht mit anderen (Bio-) Polymeren gesehen. Viele Antikrebsarzneimittelabgabesysteme, zum Beispiel Seidenbasis Hydrogelen 12, Folien 13-15 und Nanopartikel 16,17 haben nun diese Funktionen (besprochen in Referenzen 18,19) zu nutzen , entwickelt Hier Seide Nanopartikel wurden durch Bestimmung ihrer Größe und Ladung über einen längeren Zeitrahmen aus. Doxorubicin, eine klinisch relevante Anti-Krebs-Medikament, wurde als Modell Medikament zur Wirkstoffbeladung und Zytotoxizitätsuntersuchungen in triple negativen menschlichen Brustkrebszellen mit Wirkstoff beladenen Nanopartikel Seide behandelt verwendet.

<table><tbody><tr><td>Acetone</td><td>VWR International, Radnor, PA, USA</td><td>20066.33</td><td></td></tr><tr><td>Automated Critical Point Dryer</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>EM CPD300</td><td></td></tr><tr><td>Balancing</td><td>Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland</td><td>NewClassic MS</td><td></td></tr><tr><td>Black polystyrene microplate, 96 well</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>3991</td><td></td></tr><tr><td>Capillary cell (DTS 1070)</td><td>Malvern Instrument, Worcestershire, UK</td><td>DTS107</td><td></td></tr><tr><td>Carbon adhesive disc</td><td>Agar Scientific, Essex, UK</td><td>G3347N</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Hermle Labortechnik, Wehingen, Germany</td><td>Z323K</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter, Brea, CA, USA</td><td>Avanti J-E, Rotor: J20</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter, Brea, CA, USA</td><td>Optima L-70K, Rotor: 50.2 Ti, Adaptor 303392</td><td></td></tr><tr><td>Coater, low vacuum</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>EM ACE200</td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes, polystyrene, disposable</td><td>Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>FB55147</td><td></td></tr><tr><td>Doxorubixin&amp;nbsp;</td><td>LC Laboratories, Boston, MA, USA</td><td>D4000</td><td></td></tr><tr><td>Electronic pipetting, Easypet&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>FE-SEM</td><td>Hitachi High-Technologies, Krefeld, Germany</td><td>SU6600</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Freeze dryer</td><td>Martin Christ, Osterode, Germany</td><td>Epsilon 2-4</td><td></td></tr><tr><td>Heat inactivated Bombyx mori silk cocoons</td><td>Tajima Shoji, Kanagawa, Japan</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Hotplate with Stirrer</td><td>Bibby Scientific, Stanffordshire, UK</td><td>US 152</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Memmert, Schwabach, Germany</td><td>INB 200</td><td></td></tr><tr><td>Insulin, human recombinant, zinc solution</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>Lithium bromide</td><td>Acros Organics, Geel, Belgium</td><td>AC199870025</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>ATCC, Manassas, VA, U.S.A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette and tips</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>Molecular devices, Sunnyvale, CA, USA</td><td>SpectraMax M5</td><td></td></tr><tr><td>Oak Ridge High-Speed Centrifuge Tubes, 50 ml</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Open-Top Thickwall Polycarbonate tube, 4 ml</td><td>Beckman Coulter, Brea, CA, USA</td><td>355645</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes, 5 ml</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicon wafers</td><td>Agar Scientific, Essex, UK</td><td>G3391</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer Dialysis cassettes, 3.5K MWCO, 15 ml</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>87724</td><td></td></tr><tr><td>Sodium carbonate anhydrous</td><td>Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>S/2840/62</td><td></td></tr><tr><td>Specimen stubs for SEM</td><td>Agar Scientific, Essex, UK</td><td>G301</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonic homogenizer</td><td>Bandelin, Berlin, Germany</td><td>Sonoplus HD 2070</td><td></td></tr><tr><td>UV transparent microplate, 96 well</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>3635</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>IKA, Staufen, Germany</td><td>Genius 3</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer</td><td>Malvern Instrument, Worcestershire, UK</td><td>Nano ZS</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Software version 7.11</td><td></td><td>DLS software</td><td></td></tr><tr><td>Micro Modulyo</td><td>&amp;nbsp;Thermo Fisher</td><td>230</td><td>Freeze drying system&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

manufacture and drug delivery applications of silk nanoparticles

Seide ist ein vielversprechender Biopolymer für biomedizinische und pharmazeutische Anwendungen aufgrund ihrer hervorragenden mechanischen Eigenschaften, Biokompatibilität und biologische Abbaubarkeit sowie ihre Fähigkeit zu schützen und anschließend freizugeben seine Nutzlast in Antwort auf ein Trigger. Während Seide kann in verschiedenen Materialformaten formuliert werden, Seide Nanopartikel sind, sich als viel versprechende Wirkstoffabgabesysteme. Daher deckt dieser Artikel die Verfahren für Reverse-Engineering-Seidenkokons eine regenerierte Seiden Lösung zu erhalten, die verwendet werden können, stabile Seide Nanopartikel zu erzeugen. Diese Nanopartikel werden anschließend charakterisiert, Wirkstoff beladen und als potenzielle Anti-Krebs-Arzneimittel-Abgabesystem erforscht. Kurz gesagt, Seide Kokons ersten Rückwärts durch Seide Auflösung von degumming die Kokons, gefolgt entwickelt und reinigen, um eine wässrige Lösung Seide zu erhalten. Als nächstes wird die regenerierte Seiden Lösung Nanopräzipitation zogen Seide Nanopartikel zu erhalten - eine einfache, aber leistungsfähige Methodedass erzeugt einheitliche Nanopartikel. Die Seiden Nanopartikel zeichnen sich dadurch nach ihrer Größe, das Zetapotenzial, die Morphologie und Stabilität in wässrigen Medien, sowie ihre Fähigkeit, ein chemotherapeutisches Nutzlast und töten menschlichen Brustkrebszellen einzuschließen. Insgesamt ergibt die beschriebene Methodik einheitliche Seiden Nanopartikel, die leicht für eine Vielzahl von Anwendungen untersucht werden können, einschließlich ihrer Verwendung als potentielles Nano.

Die Daten wurden statistisch als detailliert zuvor 17 analysiert. Die t-Test nach Student wurde für die Probenpaare und Einwegvarianzanalyse (ANOVA), gefolgt von Bonferroni-Mehrfachvergleichs post-hoc-Test für mehrere Proben verwendet. Ein Sternchen bezeichnet eine statistische Signifikanz wie folgt: * P &lt;0,05 und ** p &lt;0,001. Alle Daten sind als Mittelwerte ± Standardabweichung (SD) und die Zahlen in Klammern geben die Anzahl der unabhängigen Experimenten dargestell...

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Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Nanopartikel sind, sich als viel versprechende Wirkstoffabgabesysteme für ein breites Spektrum von Indikationen. Hier beschreiben wir eine einfache , aber leistungsfähige Methode Seide Nanopartikel mit Reverse Engineering Bombyx mori Seide herzustellen. Diese Seide Nanopartikel können leicht mit einem therapeutischen Nutzlast beladen werden und anschließend für Drug-Delivery-Anwendungen untersucht.

Herstellung und Drug-Delivery-Anwendungen von Silk Nanopartikel

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

manufacture-and-drug-delivery-applications-of-silk-nanoparticles

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.7K Aufrufe.  University of Strathclyde.  Nanopartikel sind, sich als viel versprechende Wirkstoffabgabesysteme für ein breites Spektrum von Indikationen. Hier beschreiben wir eine einfache , aber leistungsfähige Methode Seide Nanopartikel mit Reverse Engineering Bombyx mori Seide herzustellen. Diese Seide Nanopartikel können leicht mit einem therapeutischen Nutzlast beladen werden und anschließend für Drug-Delivery-Anwendungen untersucht. 

Serie: Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Silk films are promising protein-based biomaterials that can be fabricated with high fidelity and economically within a research laboratory environment 1,2 . These materials are desirable because they possess highly controllable dimensional and material characteristics, are biocompatible and promote cell adhesion, can be modified through topographic patterning or by chemically altering the surface, and can be used as a depot for biologically active molecules for drug delivery related applications 3-8 . In addition, silk films are relatively straightforward to custom design, can be designed to dissolve within minutes or degrade over years in vitro or in vivo, and are produce with the added benefit of being transparent in nature and therefore highly suitable for imaging applications 9-13. The culture system methodology presented here represents a scalable approach for rapid assessments of cell-silk film surface interactions. Of particular interest is the use of surface patterned silk films to study differences in cell proliferation and responses of cells for alignment 12,14 . The seeded cultures were cultured on both micro-patterned and flat silk film substrates, and then assessed through time-lapse phase-contrast imaging, scanning electron microscopy, and biochemical assessment of metabolic activity and nucleic acid content. In summary, the silk film in vitro culture system offers a customizable experimental setup suitable to the study of cell-surface interactions on a biomaterial substrate, which can then be optimized and then translated to in vivo models. Observations using the culture system presented here are currently being used to aid in applications ranging from basic cell interactions to medical device design, and thus are relevant to a broad range of biomedical fields.

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Silk films are a novel class of biomaterials readily customizable for an array of biomedical applications. The presented silk film culture system is highly adaptable to a variety of in vitro analyses. This system represents a biomaterial design platform offering in vitro optimization before direct translation to in vivo models.

Silk Film Culture-System für In-vitro- Analyse und Design-Biomaterial

Silk films are promising protein-based biomaterials that can be fabricated with high fidelity and economically within a research laboratory environment ...

Forschung

Biotechnik

Designing Silk-silk Protein Alloy Materials for Biomedical Applications

Fibrous proteins display different sequences and structures that have been used for various applications in biomedical fields such as biosensors, nanomedicine, tissue regeneration, and drug delivery. Designing materials based on the molecular-scale interactions between these proteins will help generate new multifunctional protein alloy biomaterials with tunable properties. Such alloy material systems also provide advantages in comparison to traditional synthetic polymers due to the materials biodegradability, biocompatibility, and tenability in the body. This article used the protein blends of wild tussah silk (Antheraea pernyi) and domestic mulberry silk (Bombyx mori) as an example to provide useful protocols regarding these topics, including how to predict protein-protein interactions by computational methods, how to produce protein alloy solutions, how to verify alloy systems by thermal analysis, and how to fabricate variable alloy materials including optical materials with diffraction gratings, electric materials with circuits coatings, and pharmaceutical materials for drug release and delivery. These methods can provide important information for designing the next generation multifunctional biomaterials based on different protein alloys.

Blending is an efficient approach to generate biomaterials with a broad range of properties and combined features. By predicting the molecular interactions between different natural silk proteins, new silk-silk protein alloy platforms with tunable mechanical resiliency, electrical response, optical transparency, chemical processability, biodegradability, or thermal stability can be designed.

Gestaltung Silk-Seidenprotein-Legierungen für biomedizinische Anwendungen

Fibrous proteins display different sequences and structures that have been used for various applications in biomedical fields such as biosensors, ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the successful implementation of siRNA therapy requires the use of delivery platforms that can overcome the major challenges of siRNA delivery, such as enzymatic degradation, low intracellular uptake and lysosomal entrapment. Here, a protocol for the preparation and use of a biocompatible and effective siRNA delivery system is presented. This platform consists of polyethylenimine (PEI) and arginine (Arg)-grafted porous silicon microparticles, which can be loaded with siRNA by performing a simple mixing step. The silicon particles are gradually degraded over time, thereby triggering the formation of Arg-PEI/siRNA nanoparticles. This delivery vehicle provides a means for protecting and internalizing siRNA, without causing cytotoxicity. The major steps of polycation functionalization, particle characterization, and siRNA loading are outlined in detail. In addition, the procedures for determining particle uptake, cytotoxicity, and transfection efficacy are also described.

Delivery remains the main challenge for the therapeutic implementation of small interfering RNA (siRNA). This protocol involves the use of a multifunctional and biocompatible siRNA delivery platform, consisting of arginine and polyethylenimine grafted porous silicon microparticles.

Poröses Silizium Mikropartikel für die Lieferung von siRNA-Therapeutika

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Reactive Inkjet Printing and Propulsion Analysis of Silk-based Self-propelled Micro-stirrers

In this study, a protocol for using reactive inkjet printing to fabricate enzymatically propelled silk swimmers with well-defined shapes is reported. The resulting devices are an example of self-propelled objects capable of generating motion without external actuation and have potential applications in medicine and environmental sciences for a variety of purposes ranging from micro-stirring, targeted therapeutic delivery, to water remediation (e.g., cleaning oil spills). This method employs reactive inkjet printing to generate well-defined small-scale solid silk structures by converting water soluble regenerated silk fibroin (silk I) to insoluble silk fibroin (silk II). These structures are also selectively doped in specific regions with the enzyme catalase in order to produce motion via bubble generation and detachment. The number of layers printed determines the three-dimensional (3D) structure of the device, and so here the effect of this parameter on the propulsive trajectories is reported. The results demonstrate the ability to tune the motion by varying the dimensions of the printed structures.

This protocol demonstrates the ability to utilize reactive inkjet printing to print self-motile biocompatible and environmentally friendly micro-stirrers for use in biomedical and environmental applications.

Reaktive Inkjet-Druck-und Antriebsanalyse von seidenbasierten, selbstfahrenden Mikro-Rührern

In this study, a protocol for using reactive inkjet printing to fabricate enzymatically propelled silk swimmers with well-defined shapes is reported. The ...

Chemie

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

Feste Lipidnanopartikel (SLN) für die intrazelluläre Targeting-Anwendungen

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Production of siRNA-Loaded Lipid Nanoparticles using a Microfluidic Device

The development of functional lipid nanoparticles (LNPs) is one of the major challenges in the field of drug delivery systems (DDS). Recently, LNP-based RNA delivery systems, namely, RNA-loaded LNPs have attracted attention for RNA therapy. In particular, mRNA-loaded LNP vaccines were approved to prevent COVID-19, thereby leading to the paradigm shift toward the development of next-generation nanomedicines. For the LNP-based nanomedicines, the LNP size is a significant factor in controlling the LNP biodistribution and LNP performance. Therefore, a precise LNP size control technique is indispensable for the LNP production process. Here, we report a protocol for size controlled LNP production using a microfluidic device, named iLiNP. siRNA loaded LNPs are also produced using the iLiNP device and evaluated by in vitro experiment. Representative results are shown for the LNP size, including siRNA-loaded LNPs, Z-potential, siRNA encapsulation efficiency, cytotoxicity, and target gene silencing activity.

Microfluidic-based lipid nanoparticle (LNP) production methods have attracted attention in drug delivery systems (DDSs), including RNA delivery. This protocol describes the fabrication, LNP (siRNA-loaded LNP) production, and LNP evaluation processes using our original microfluidic device named iLiNP.

Herstellung von siRNA-beladenen Lipid-Nanopartikeln mit einem mikrofluidischen Gerät

The development of functional lipid nanoparticles (LNPs) is one of the major challenges in the field of drug delivery systems (DDS). Recently, LNP-based ...

Biochemie

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical methods for manipulating and monitoring the activity of neurons in vivo. These types of experiments rely on two main components: 1) implantable devices that provide optical access to the brain, and 2) light-sensitive proteins that change neuronal excitability or provide a readout of neuronal activity. There are a number of ways to express light-sensitive proteins, but stereotaxic injection of viral vectors is currently the most flexible approach because expression can be controlled with genetic, anatomical, and temporal precision. Despite the great utility of viral vectors, delivering the virus to the site of optical implants poses numerous challenges. Stereotaxic virus injections are demanding surgeries that increase surgical time, increase the cost of studies, and pose a risk to the animal's health. The surrounding tissue can be physically damaged by the injection syringe, and by immunogenic inflammation caused by the abrupt delivery of a bolus of high-titer virus. Aligning injections with optical implants is especially difficult when targeting small regions deep in the brain. To overcome these challenges, we describe a method for coating multiple types of optical implants with films composed of silk fibroin and Adeno-associated viral (AAV) vectors. Fibroin, a polymer derived from the cocoon of Bombyx mori, can encapsulate and protect biomolecules and can be processed into forms ranging from soluble films to ceramics. When implanted into the brain, silk/AAV coatings release virus at the interface between optical elements and the surrounding brain, driving expression precisely where it is needed. This method is easily implemented and promises to greatly facilitate in vivo studies of neural circuit function.

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

Here, we present a method for delivering viral expression vectors into the brain using silk fibroin films. This method allows targeted delivery of expression vectors using silk/AAV coated optical fibers, tapered optical fibers, and cranial windows.

In Vivo Gezielte Expression von optogenetische Proteinen mit Seide/AAV Filme

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical ...

Neurowissenschaften

<meta charset="utf8"></head><body>Bildung und Befestigung von FN-Seidenmembranen an Inserts von Zellkulturen

Nanofibrillar Basement Membrane Mimic Made of Recombinant Functionalized Spider Silk in Custom-Made Tissue Culture Inserts

Replicating tissue barriers&#160;is critical for generating relevant in vitro models for evaluating novel therapeutics. Today, this is commonly done using tissue culture inserts with a plastic membrane, which generates an apical and a basal side. Besides providing support for the cells, these membranes come far from emulating their native counterpart, the basement membrane, which is a nanofibrillar, protein-based matrix. In this work, we show a simple way to considerably improve the biological relevance of the tissue culture inserts by replacing the plastic membrane with one made from a pure recombinant functionalized spider silk protein. The silk membrane forms through self-assembly and will spontaneously adhere to a membrane-free tissue culture insert, where it can provide support for cells. Custom-designed tissue culture inserts can be printed using a standard 3D printer, following the instructions provided in the protocol, or commercial ones can be purchased and used instead. This protocol shows how the culture system with silk membranes in inserts is set up and, subsequently, how the same cell culturing techniques that are used with traditional, commercially available inserts can be implemented.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Verbesserung von In vitro Zellkulturmodellen mit rekombinanten funktionalisierten Spinnenseidenmembranen

Tissue culture inserts with plastic membranes are the golden standard in cell culture labs as permeable supports to establish cell layers and models of barrier tissues. Herein, we present a simple method to replace the plastic membrane with a more biologically relevant membrane made from a recombinant functionalized spider silk protein.

Nanofibrilläre Basalmembran-Imitation aus rekombinant funktionalisierter Spinnenseide in maßgefertigten Gewebekultureinsätzen

Replicating tissue barriers&#160;is critical for generating relevant in vitro models for evaluating novel therapeutics. Today, this is commonly done using ...

Herstellung und Drug-Delivery-Anwendungen von Silk Nanopartikel

Zusammenfassung

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Silk Film Culture-System für In-vitro- Analyse und Design-Biomaterial

Gestaltung Silk-Seidenprotein-Legierungen für biomedizinische Anwendungen

Poröses Silizium Mikropartikel für die Lieferung von siRNA-Therapeutika

Reaktive Inkjet-Druck-und Antriebsanalyse von seidenbasierten, selbstfahrenden Mikro-Rührern

Feste Lipidnanopartikel (SLN) für die intrazelluläre Targeting-Anwendungen

Herstellung von siRNA-beladenen Lipid-Nanopartikeln mit einem mikrofluidischen Gerät

In Vivo Gezielte Expression von optogenetische Proteinen mit Seide/AAV Filme

Nanofibrilläre Basalmembran-Imitation aus rekombinant funktionalisierter Spinnenseide in maßgefertigten Gewebekultureinsätzen

Nanofibrilläre Basalmembran-Imitation aus rekombinant funktionalisierter Spinnenseide in maßgefertigten Gewebekultureinsätzen

Nanofibrilläre Basalmembran-Imitation aus rekombinant funktionalisierter Spinnenseide in maßgefertigten Gewebekultureinsätzen