Bewahren Sie pluripotente Stammzellen oder PSCs in Sechs-Well-Kulturplatten auf und bestätigen Sie die Zelldichte unter einem Mikroskop. Für die Differenzierung von Kardiomyozyten oder CM werden PSCs in eine 96-Well-Kulturplatte in einem PSC-Präparationsmedium eingepflanzt. Im ersten Stadium der kardialen Differenzierung, wenn die PSCs eine Konfluenz von 80 bis 90 % erreichen, wechseln Sie das Medium auf das CM-Differenzierungsmedium mit zwei bis 20 mikromolaren CHIR.
Wechseln Sie nach 24 bis 48 Stunden CHIR-Behandlung das Medium gegen ein frisches CM-Differenzierungsmedium. Ersetzen Sie das Medium im zweiten oder dritten Stadium durch das CM-Differenzierungsmedium, das mit fünf mikromolaren IWR1 in Kultur bis zum fünften Tag ergänzt wird. Wechseln Sie dann das Medium zum CM-Differenzierungsmedium und bewahren Sie es bis zum sechsten bis siebten Tag auf, wenn sich die PSCs zu kardialen Vorläuferzellen (CPC) differenzieren.
Fixieren Sie die Zellen an Tag 10 oder Tag 12 15 Minuten lang mit 4% Paraformaldehyd in PBS bei Raumtemperatur. Behandeln Sie die Zellen zum Zeitpunkt der Färbung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit einer permeabilisierenden Lösung. Die Probe wird über Nacht bei vier Grad Celsius mit einem CTNT-Primärantikörper inkubiert.
Anschließend wird die Probe eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius mit Sekundärantikörpern in PBS behandelt, die 1 %Rinderserumalbumin enthalten. Nach der Entnahme des Sekundärantikörpers aus den Zellen färben Sie die Zellkerne von Hoechst fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Spülen Sie die Zellen dann dreimal mit PBS, bevor Sie 100 Mikroliter PBS pro Vertiefung hinzufügen, um ein Austrocknen zu vermeiden.
Um Hellfeld- und CTNT-Immunfluoreszenzbilder verschiedener Differenzierungsstadien mit einem automatisierten Mikroskop zu sammeln, das lebende Zellkulturen unterstützt, öffnen Sie die Software und erstellen Sie ein neues Versuchsdesign. Wählen Sie ein 5X-Objektiv und ein 2X2-Mischgewebe für die Bildgebung. Fügen Sie im Menü "Kanäle" den TL-Hellfeldkanal für das Hellfeld und die Kanäle AF 488 und H 33 42 für die Immunfluoreszenzbildgebung hinzu.
Ändern Sie den Strahlengang in der Bildgebungseinrichtung. Legen Sie im Menü "Z-Stapel" die Anzahl der Slices und die Intervalle beim Scannen fest. Richten Sie im Fenster "Navigation und Kacheln" die Kachelregionen nach Träger ein, und legen Sie 25 Kacheln in fünf Spalten in fünf Zeilen für ein Feld fest.
Um Bilder aufzunehmen, legen Sie zunächst die Zellkulturplatte in die Probenschale und legen Sie die Schale in das Mikroskop ein. Wenn die Probe aus lebenden Zellen besteht, öffnen Sie das Heizsystem und die Kohlendioxidpumpe, um die geeigneten Bedingungen für die Kultur bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid zu halten. Öffnen Sie das voreingestellte experimentelle Projekt.
Öffnen Sie das Kachelmenü und kalibrieren Sie die Position der Platte manuell. Wählen Sie im Navigations- und Kachelfenster die gewünschten Vertiefungen aus, und klicken Sie auf Erstellen, um Kachelregionen für diese Vertiefungen zu erstellen. Klicken Sie im Kachelmenü auf die Kachelbereiche überprüfen, und führen Sie den Autofokus aus, um alle Wells zu überprüfen.
Korrigieren Sie dann manuell den Fokus jedes Wells. Klicken Sie auf die Schaltfläche Experiment starten und warten Sie auf die automatische Bildgebung. In der Regel dauert es etwa 1,2 Stunden, um eine ganze 96-Well-Kulturplatte zu scannen.
Wählen Sie im Verarbeitungsframework Bildexport, wählen Sie den Dateityp des unkomprimierten TIFF-Formats oder das PNG-Format aus und wenden Sie es an.
