Diese Forschung wurde durch die NIH 4R00HL094708-03 unterstützt, MCW Forschungsausschuss New Faculty Award, und der Kern-Stiftung (Startfonds) an der Medizinischen Hochschule von Wisconsin (RLG); Research Grants Council of Hong Kong Theme-Based Research Scheme T13-706 / 11 (KRB); U01 HL099776, CIRM TR3-05556, CIRM DR2A-05394 und AHA Gegründet Investigator Award (JCW); AHA Postdoctoral Fellowship 12POST12050254 (PWB). Wir danken Hoffnung Campbell an der Durchflusszytometrie Kern des Blut Research Institute of Wisconsin für die Unterstützung bei der Datenerhebung und die sorgfältige Durchsicht des Manuskripts.

1. Lösung und Medienvorbereitung <ol><li> hESC Qualifizierte Matrixbeschichtung Stammlösung <ol><li> Langsam tauen hESC qualifizierte Matrix (5 ml) auf Eis bei 4 ° C über Nacht. Verzichten Aliquots in vorgekühlte 1,5 ml sterile Mikrozentrifugenröhrchen und sofort bei -20 ° C lagern. HINWEIS: Das Volumen des aliquoten auf viel variieren und liegt typischerweise im Bereich von 270 bis 350 ul. Hersteller liefert Details über Volumen von aliquoten erforderlich, um eine Konzentration auf 1x Verdünnung in 25 ml zu erreichen, wie in Schritt 2.1 beschrieben. </li></ol></li><li> HPSC Medienstammlösungen <ol><li> Verwenden von ultrareinem Wasser als Verdünnungsmittel, sofern nicht anders angegeben. Sterilisieren alle Komponenten mit einem 0,22 um Filter. Bewahren Sie die folgenden Lösungen wie Groß bei 4 ° C: Natriumbicarbonat (75 mg / ml); Zitronensäure (10 mM, pH = 3). </li><li> Sterilisieren alle Komponenten unter Verwendung von 0,2 um Spritzenfilter und speichern jeweils als Aliquots bei -20 ° C: Rho-Kinase (ROCK)-Inhibitor Y-27632 (10mM in DPBS, 100 ul Aliquot); L-Ascorbinsäure-2-phosphat (64 mg / ml, 500 ul Aliquote); Natriumselenit (70 ug / ml, 100 ul Aliquote); Transferrin (50 mg / ml, 107 ul Aliquote); Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2; 200 ng / ul in DPBS, 250 ul Aliquot); transforming growth factor beta 1 (TGFß1, 100 ng / ul in kaltem 10 mM Zitronensäure, 10 ul Aliquot). </li></ol></li><li> HPSC Medien E8 Lösung Zusammensetzung <ol><li> Planen Medien mit Aliquots in Schritt 1.2 hergestellt: DMEM / F12 (mit L-Glutamin und HEPES, 500 ml), Natriumbicarbonat (3,62 ml; endgültig: 543 ug / ml), L-Ascorbinsäure-2-phosphat (500 ul; endgültigen : 64 ug / ml), Natriumselenit (100 ul; endgültig: 140 ng / ml), Transferrin (107 ul; endgültig: 10,7 ug / ml), Insulin (1 ml; endgültig: 20 ug / ml), FGF2 (250 ul; Finale: 100 ng / ml), TGFß1 (10 ul; Finale: 2 ng / ml). </li><li> Vereinen alle Komponenten, Filter zu sterilisieren und bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen. </li></ol></li><li> HPSC Medien E8 mit ROCK-Inhibitor <ol><li> Fügen Sie 15 ul ROCK-Hemmstoff, um 12 ml E8 Medien wie oben hergestellt und gut mischen. Sicherzustellen, dass die Endkonzentration 10 uM nach Zugabe der Zellen / Medium in Schritt 3.7. </li></ol></li><li> Stammlösungen von Wnt-Modulatoren <ol><li> Bewahren Sie die folgenden Aliquots bei -20 ° C. CHIR 99021 (6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5​-methyl-1 H -imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethy​l]amino]-3-pyridinecarbonitrile; 10 mM in DMSO, 15 ul Aliquot). IWR-1-(4-(1,3,3a, 4,7,7a-Hexahydro-1,3-Dioxo-4,7-methano-2H-isoindol-2-yl)-N-8-Chinolinyl-benzamid; 10 mM in DMSO, 6 ul Aliquot). </li></ol></li><li> Differenzierung Medien <ol><li> Vorbereitung Differenzierungsmedium # 1 mit RPMI 1640 (mit L-Glutamin) mit 2% B27 Supplement minus Insulin. </li><li> Vorbereitung Differenzierungsmedium # 2 mit RPMI 1640 (mit L-Glutamin) mit 2% B27 Supplement plus Insulin und 2% FBS. </li></ol></li><li> Zellwaschlösung foder Zellkultur <ol><li> Verwenden Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS) ohne Calcium oder Magnesium. </li></ol></li><li> Zellwaschlösung für die Durchflusszytometrie <ol><li> Verwenden phosphatgepufferter Salzlösung (PBS ohne Calcium oder Magnesium) mit 1% FBS. Bei 4 ° C lagern. </li></ol></li><li> Zellinstandhaltungslösungen für die Durchflusszytometrie <ol><li> Verwenden ausgeglichener Hank-Salzlösung (HBSS; ohne Calcium oder Magnesium) mit 5% FBS. Bei 4 ° C lagern. </li></ol></li><li> Fixierung Lösungen für die Durchflusszytometrie <ol><li> Verwenden Cytofix Puffer als Fixierungslösung für TNNI3 und IRX4 Antikörper. </li><li> Verwenden Sie 4% Paraformaldehyd in 1x PBS (machen frisch) als Fixierungslösung für TNNT2 und MLC2a Antikörper. </li><li> Verwenden 70% Methanol / 30% Aceton als Fixierungslösung für MLC2v Antikörper. </li><li> Speichern Sie alle Lösungen bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Permeabilisierung Lösungen für die Durchflusszytometrie <ol><li> Verwenden Phosflow Perm Buffer III als Permeabilisierung Lösung foder TNNI3 und IRX4 Antikörper. Lagerung bei Raumtemperatur (25 ° C). </li><li> Verwenden Sie 0,2% Triton X-100 in 1x PBS als Permeabilisierung Lösung für TNNT2, MLC2v und MLC2a Antikörper. Bei 4 ° C lagern. </li></ol></li><li> Blocking Solution <ol><li> Verwenden 10% Ziegenserum in PBS 1x. Machen frisch und lagern bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li></ol></li></ol> 2. Plattenbeschichtung <ol><li> Langsam tauen 1 Aliquot hESC qualifizierte Matrix bei 4 ° C für 30 min in den 25 ml gekühltes DMEM / F12 und gut mischen in sterilisierten Gewebekultur Haube unmittelbar vor der Beschichtung 6-Well-Platten. </li><li> 1 ml pro Vertiefung einer 6-Well-Platte unter sterilen Gewebekulturhaube (1 Aliquot der hESC qualifizierte Matrix ist die ausreicht, um vier 6-Well-Platten). </li><li> Ermöglichen hESC qualifizierte Matrix für 30 min bei Raumtemperatur unter der Haube gesetzt. Saugen Sie das überschüssige hESC qualifizierte Matrix und 2 ml E8 Medien mit ROCK-Inhibitor in jede Vertiefung. Verwendung Platten sofort, oder wenn desired, Lagerung bei 4 ° C unmittelbar nach der Beschichtung für bis zu 1 Woche und ins Gleichgewicht zu Raumtemperatur für 30 min vor der Verwendung. </li></ol> 3. Passagierung und Wartung von undifferenzierten hPSCs in Monolayer-Kultur <ol><li> Pflegen hPSCs in Monolayer-Kultur in 6-Well-Platten und alle Schritte unter einem sterilen Gewebekultur Kapuze. </li><li> Verwenden HPSC Linien, die gut etabliert sind (&gt; P20) und weisen eine homogene Morphologie ohne die Anwesenheit von Zellen mit einem neuronalen, epithelial- oder Fibroblasten-ähnliche Morphologie. Stellen Sie sicher, Zellen vermehren robust, und im Durchschnitt Durchgang alle drei Tage bei 75% Konfluenz, wenn bei 0,75 x 10 6 pro Vertiefung. </li><li> Passage hPSCs mit Dissoziation in die Einzelzellebene mindestens 5x vor der Differenzierung beginnen, um eine maximale Effizienz zu gewährleisten Differenzierung. Um den Durchgang hPSCs absaugen E8 Medien und waschen Sie die Zellen zweimal mit 4 ml 1x DPBS (auf Raumtemperatur vorgewärmt). 1 ml der Zelltrennungsment-Lösung (auf Raumtemperatur vorgewärmt) in jede Vertiefung und lassen Sie das auch ungestört für 3-7 min, bis die Zellgrenzen beginnen, Round-up. </li><li> Verwenden Sie einen Watte-steckt Glaspipette mit Lampe, um Zellen zu entfernen und Transfer in einem 15 ml konischen Röhrchen mit 1 ml DMEM / F12 Medien (um die Zellablösung Lösung inaktivieren). </li><li> Entfernen Sie 10 ul Aliquot der Zelllösung und mit 10 ul Trypanblau in einem Mikrozentrifugenröhrchen mischen. Zählen von Zellen (beispielsweise automatisiert oder manuell Zählkammer), während der Rest Zellen werden durch Zentrifugation bei 130 × g für 5 min bei Raumtemperatur gesammelt. Über dieses Protokoll, erwarten 70-80% Lebensfähigkeit mit Hilfe eines automatisierten Hämozytometers und Vorwärtsgehen, Grund alle Zellzahlen auf die Gesamtzellzahl. </li><li> Aspirat Medien und Zellpellet in DMEM / F12 bis zu einer Endkonzentration von 0,75 × 10 6 Zellen pro 500 ul. </li><li> Fügen Sie 500 ul der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte, wo jeder gut contains 2 ml E8 Medien mit ROCK-Inhibitor, in Schritt 2.3 vorbereitet. Verlassen Platte auf der Arbeitsplatte, sanft in einer Front-to-Back-und Side-to-Side Bewegung gleichmäßig zu verteilen Zellen bewegen sich über den Brunnen. Rück Zellen in 5% CO 2, 37 ° C Inkubator. </li><li> Ab 24 Stunden nach der Passage, ersetzen Medien täglich mit 2 ml / Vertiefung E8 ohne ROCK-Inhibitor. Aussaatdichte zu optimieren, um 100% Zusammenfluss vor der Differenzierung beginnen zu erzielen. Saatgut 0,75 x 10 6 Zellen / 4 Tage vor der Differenzierung beginnen, aber für jede Zelllinie zu optimieren, wie gebraucht. </li></ol> 4. Cardiomyocyte Induktion von hPSCs durch selektive Modulation des Wnt Pathway <ol><li> Aktualisieren Medien (2 ml / Vertiefung) täglich während 0-7 Tagen, und jeden zweiten Tag für Tag 8. </li><li> Am Tag 0 beginnen Differenzierung durch Ersetzen E8 Medien mit Differenzierungsmedium # 1. Mit 1,2 ul CHIR (6 uM final) in jede Vertiefung. Wiederholen an Tag 1. </li><li> An den Tagen 2-3, ersetzen Sie mit frischem differenzierung Medien # 1. </li><li> Am Tag 4, ersetzen Sie mit frischem Differenzierung Medien # 1. 1 ul IWR-1 (5 uM final) in jede Vertiefung. Wiederholen Sie am Tag 5. </li><li> An den Tagen 6-7, ersetzen Sie mit frischem Differenzierung Medien # 1. </li><li> Am Tag 8 ersetzen mit frischen Differenzierung Medien # 2. </li><li> Weiterhin mit Differenzierung Medien # 2 jeden zweiten Tag für gewünschte Zeit der Kultur zu ersetzen. </li><li> Wenn gewünscht, Gang Kardiomyozyten mit der Zellablösung Lösung folgenden Schritte in 3,3-3,6 umrissen, aber Ersetzen Medien mit Differenzierung Medien # 2. Während Passagieren, distanzieren Kardiomyozyten in kleine Gruppen von 3-10 ~ Zellen. Samen bei ~ 6 x 10 5 Zellen pro Well mit hES qualifizierte Matrix beschichteten Wells und Differenzierung Medien # 2. </li></ol> 5. Sammlung von Zellen für die Durchflusszytometrie <ol><li> Führen alle weiteren Aspekte der Schritte auf dem Labortisch (dh nicht steril) 5-9. </li><li> Absaugen und waschen Wachstumsmedien Zellen zweimal mit 1x PBS.1 ml der Zellablösung Lösung (auf Raumtemperatur vorgewärmt) in jede Vertiefung und lassen Sie ungestört für 3-7 min, bis die Zellgrenzen beginnen, Round-up. Verwenden Sie einen Watte-steckt Borosilikatglas Einweg 9 &quot;Pipette mit Lampe, um Zellen zu entfernen und Transfer in einem 15 ml konischen Röhrchen auf Eis. </li><li> Im gesamten Rest des Protokolls aufrechtzuerhalten Zellen auf Eis und führen Zentrifugation bei 200 × g für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Sammeln die Zellen durch Zentrifugation und saugen Lösung. Die Zellen in 10 ml Zellwaschlösung unter Verwendung einer 10 ml-Pipette mit serologischen wiederholt Verreiben um Zellklumpen zu gewährleisten werden in einzelne Zellen dispergiert. Zählen von Zellen, wie in Schritt 3.5, während verbleibende Zellen werden durch Zentrifugation gesammelt. </li><li> Die Zellen in Zellwaschlösung kümmert komplett zu zerlegen und Zellpellet aliquoten 1 x 10 6 Zellen pro Runde Unterrohr. Sammeln die Zellen durch Zentrifugation und saugen Lösung. </li></ol> 6. Fixierung undPermeabilisierung der Zellen für die intrazelluläre Antigen Färbung <ol><li> 100 l Fixierungslösung zu Zellpellet. Fügen Lösung tropfenweise unter ständigem leichtem Vortexen und dann auf Eis für 15 min eingestellt. </li><li> 3 ml Zellwaschlösung. Sammeln die Zellen durch Zentrifugation und saugen Lösung. </li><li> 100 l Permeabilisierung Lösung für Zellpellet. Fügen Lösung tropfenweise unter ständigem leichtem Vortexen dann auf Eis für 30 min eingestellt. Fixierung und Permeabilisierung verwenden Bedingungen wie für jeden Antikörper in Tabelle 1 dargestellt. </li><li> 3 ml Zellwaschlösung. Sammeln die Zellen durch Zentrifugation und saugen Lösung. Wiederholen für insgesamt zwei Waschungen nach Permeabilisierung. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> Primärer Antikörper (Clone) </td><td rowspan="2"> Immunogen / Epitop erkannt </td><td rowspan="2"> Istotype Steuer </td><td colspan= &quot;2&quot;&gt; Menge an primärem Antikörper pro 1 x 10 6 Zellen in 100 ul </td><td rowspan="2"> Fixierungslösung </td><td rowspan="2"> Permeabilisierung Lösung </td><td rowspan="2"> Sekundären Antikörper </td><td rowspan="2"> Menge an sekundärem Antikörper / 1 x 10 6 Zellen in 100 ul </td></tr><tr><td> Für Prozent positive Messungen </td><td> Antigen-Quantifizierung </td></tr><tr><td> TNNI3 (284 (19C7) </td><td> ISASRKLQL (Human) </td><td> Mouse IgG2b </td><td> 1,0 ug </td><td> 3.0 ug </td><td> BD Cytofix </td><td> BD Phosflow Dauerwelle III </td><td> Ziege-Anti-Maus-IgG2b-Alexa488 </td><td> 600 ng </td></tr><tr><td> TNNT2 (1C11) </td><td> In voller Länge gereinigten nativen menschlichen Protein Troponin T. </td><td> Maus IgG1 </td><td> 1,0 ug </td><td> 2.0 ug </td><td> 4% PFAin 1% PBS </td><td> 0,2% Triton X-100 in 1% PBS </td><td> Ziege-anti-Maus-IgG1 - Alexa 488 </td><td> 600 ng </td></tr><tr><td> MLC2v (330G5) </td><td> FDPEGKG </td><td> Maus-IgG2a </td><td> 2.0 ug </td><td> 3.0 ug </td><td> 70% Methanol / 30% Aceton </td><td> 0,2% Triton X-100 in 1% PBS </td><td> Ziege-Anti-Maus-IgG2a - Alexa 647 </td><td> 600 ng </td></tr><tr><td> MLC2a (4E7) </td><td> voller Länge humanen rekombinanten Protein des menschlichen MYL7 in E. hergestellt coli </td><td> Maus IgG1 </td><td> 0,5 ug </td><td> 3.0 ug </td><td> 4% PFA in 1% PBS </td><td> 0,2% Triton X-100 in 1% PBS </td><td> Ziege-anti-Maus-IgG1 - Alexa 488 </td><td> 600 ng </td></tr><tr><td> IRX4 </td><td> LQEHRKNP YPTKGEKI MLAIITKM TLTQVST </td><td> Kaninchen-IgG </td><td> 0,5 ug </td><td> 0,5 ug </td><td> BD Cytofix </td><td> BD Phosflow Dauerwelle III </td><td> Ziege-Anti-raBBIT IgG-PE </td><td> 600 ng </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Antikörperkonzentrationen. Aufgeführt sind der primäre Antikörper, Klon (wenn monoklonalen), optimierte Konzentrationen und Fixierung und Permeabilisierung Bedingungen für jeden primären und sekundären Antikörpers für die Durchfluss verwendet Zytometrie analysiert. Antikörperstammkonzentrationen können unter den Anbietern des gleichen Klons variieren Endkonzentrationen jedes Antikörpers pro 1 x 10 6 Zellen in einem festgelegten Testvolumen, anstatt Verdünnungen vorgesehen sind. Das Immunogen verwendet, um die Antikörper zu generieren, oder Epitop durch Antikörper erkannt, wie vom Hersteller vorgesehen ist, wird aufgeführt, aber nicht experimentell verifiziert hier. 7. Antikörper-Färbung <ol><li> Für jedes Experiment, sind eine ungefärbte Kontrolle pro Fixierung / Permeabilisierung Zustand und die entsprechende Isotyp-Kontrolle für jede Primärantikörpers verwendet. Sind nicht-Kardiomyozyten Zelltypen als Negativkontrollen (Beispiel pluripotenten Stammzellen oder Fibroblasten). Verwenden Isotypkontrollen in der gleichen Konzentration wie die entsprechenden primären Antikörper (siehe Tabelle 1). </li><li> Die Zellen in 100 ul Blockierungslösung mit einer Pipette auf P200 Zellen zu zerlegen. Satz Proben auf Eis für 25 min unter leichtem Schütteln. </li><li> Ohne Entfernen der Blockierungslösung, fügen primären Antikörper oder Isotypenkontrolle pro Richtlinien in Tabelle 1. Inkubation 45 min auf Eis unter leichtem Schütteln. </li><li> 3 ml Zellwaschlösung. Sammeln die Zellen durch Zentrifugation und saugen Lösung. Wiederholen für insgesamt zwei Waschungen nach der primären Antikörpermarkierung. </li><li> Wenn ein Fluorophor-konjugierte primäre Antikörper verwendet wird, auf 8,1 fort. Wenn ein nicht-konjugierten primären Antikörper verwendet wird (wie bei allen hier beschriebenen Marker), führen die Markierung mit sekundären Antikörper, der an ein Fluorophor konjugiert ist, wie folgt. </li><li> Die Zellen in 100 ul Blockierungslösung mit einer Pipette auf P200 DISAggregate Zellen. </li><li> Fügen sekundären Antikörper pro Richtlinien in Tabelle 1. Inkubation 30 min auf Eis unter leichtem Schütteln. </li><li> 3 ml Zellwaschlösung. Sammeln die Zellen durch Zentrifugation und saugen Lösung. Wiederholen für insgesamt zwei Waschungen nach der sekundären Antikörpermarkierung. </li></ol> 8. Vorbereitung der Zellen für die Durchflusszytometrie <ol><li> Die Zellen in 400 ul Zellwartungslösung mit einer Pipette auf P1000 Zellen zu zerlegen. </li><li> Bereiten Sie eine Zelle Sieb Kappe auf einem Rundrohr Vorbenetzung mit 50 ul Zellwartungslösung. Röhrchen auf Eis gesetzt. Verwenden Sie die Zelle Siebkappe zu Zellaggregaten Verstopfen der Durchflusszytometer zu verhindern. </li><li> Übertragen Zell Lösung Siebkappe Zelle und erlauben Zellsuspension durch Schwerkraft abfließen. Tippen Sie auf dem Boden des Röhrchens vorsichtig auf Tisch wie nötig, so dass die Zellen in Röhrchen gesammelt und so schnell wie möglich wieder auf Eis gesetzt. Rinse-Sieb mit 250 ul Zell Wartung sosung, um eine maximale Verwertung der Zellen zu gewährleisten. </li><li> Pflegen Zellen auf Eis und vor Licht schützen, bis sie durch Durchflusszytometrie analysiert. </li></ol> 9. Durchflusszytometrie Detaillierte Erfassung Einstellungen werden unter Instrumente variieren. Grundparameter für eine optimale Datenerfassung berücksichtigen sind unten beschrieben. <ol><li> Für eine optimale Stabilität Strom, sicherzustellen, dass die Düsengröße überschreitet 5-6x der Durchmesser der Zelle analysiert wird. Hinweis: Dies kann unter Instrumente variieren, aber ist ein wichtiger Aspekt sowohl für Analysegeräte und Auswahl geeigneter Düsengröße für die Zellsortierung. Der durchschnittliche Durchmesser der Tag 10 Kardiomyozyten ist 11 um (im Bereich 8-14 um); So ein Standard-150 um Probeninjektionsrohr auf einem Analysegerät funktioniert gut. </li><li> Unmittelbar vor der Datenanalyse, Wirbel jedes Rohr kurz auf Zellaggregate zu zerstreuen. </li><li> Optimierung der vorderen und Seitenstreuspannungseinstellungen für jeden Zelltyp, basierend aufungefärbten Kontrolle für jede Fixierung / Permeabilisierung Zustand, in dem Experiment, dass die Bevölkerung von Interesse sind die auf Umfang und zentriert (2A) verwendet. <ol><li> Pflegen Sie diese Einstellungen über einen einzigen Versuch und konsistent von Experiment zu auf dem gleichen Instrument auszuprobieren, wie signifikante Verschiebungen können mögliche Probleme mit dem Durchflusszytometer oder Probenvorbereitung anzugeben. </li></ol></li><li> Für jedes Fluorophor, analysieren die Isotyp-Kontrolle und stellen geeignete Laserspannung, um die Mindestintensität erforderlich, um ein Fluoreszenz-Histogramm, das den linken und rechten Kanten der Spitze zeigt erhalten bestimmen. Pflegen Sie die Einstellungen für die einzelnen Laser Isotypenkontrolle beim Erwerb von Daten auf entsprechende Antikörper-gefärbten Proben. HINWEIS: Signaldrift tritt häufig im Laufe der Zeit auf dem gleichen Instrument. Es ist kritisch, Lasereinstellungen zu Beginn jedes Experiments auf der Basis der entsprechenden Isotyp-Kontrolle einzustellen. </li><li> Sammeln ein Minimum von10.000 Veranstaltungen. 50.000 Veranstaltungen werden bevorzugt. </li><li> Für statistische Analysen, Tor die Lebendzellpopulation um Verschmutzungen (2A) auszuschließen. Bestimmen Prozent positive Zellen innerhalb der Gated Bevölkerung auf Basis von Markerplatzierung, die ≤2% ermöglicht Beitrag von Isotypenkontrolle, wie in Abbildung 2B, C gezeigt. </li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Kritisch für den Erfolg der Differenzierungsprotokoll ist die Verwendung von hochwertigen Kulturen hPSCs das auf Einzelzellebene für mindestens fünf Passagen vor Beginn der Differenzierung agiert wurden. Ähnliche Differenzierung Effizienzen werden routinemäßig unter verschiedenen HPSC Linien beobachtet, wenn sie 100% konfluent zu Beginn der Differenzierung, unabhängig von Zelllinie. Suboptimalen Leistungsfähigkeit beobachtet, wenn die Konfluenz der Zellen zu Beginn der Differenzierung ≤95% oder&gt; 100%. Daher...

Die Erzeugung von Kardiomyozyten aus hPSCs, einschließlich hESC und hiPSC, kann als ein in vitro-Modell der sehr frühen menschlichen Entwicklungsprozesse Herz funktionieren, die einen Einblick in Stadien nicht anders für mechanistische Studien zugänglich. Dieses Modellsystem bietet einzigartige Möglichkeiten, um die molekularen Signalwege, die Herzlinie Engagement und das Schicksal der Zelle steuern Spezifikation zu studieren. In den letzten Jahren hat die Fähigkeit, kardiomyogenen Zellen effizient zu erzeugen aus hPSCs stark verbessert 1-15. Jedoch unter Protokolle gibt es Zellinie Variation in Bezug auf den Wirkungsgrad bei der Erzeugung von Herzmuskel Zellen und Zeitpunkt, zu dem die Zellen exprimieren Kammer spezifische Marker (zB Ventrikel und Vorhof). Idealerweise sollte für zukünftige Anwendungen dieses Modellsystems, homogener Populationen von Zellen funktionell definiert sind erwünscht. Im Gegensatz zu bisherigen Methoden, die hier beschriebene Kardiomyozytendifferenzierung Protokoll nicht ce erfordernll Aggregation oder die Zugabe von Activin A oder Bone morphogenetic protein 4 (BMP4) und robust erzeugt Kulturen sehr positiv für TNNI3, TNNT2, IRX4, MLC2v und MLC2a Tag 10 Zellen in allen bisher getesteten humanen embryonalen Stammzellen und hiPSC Linien. Die Strategie ist technisch einfach zu realisieren, insbesondere im Vergleich zu dreidimensionalen Kulturen Massenkultur oder Embryoidkörperbildung basierte Strategien 4-9 und wurde vor kurzem in einer Studie, die ein kleines Molekül mit selektiver Toxizität gegen hPSCs beschreibt (Boheler et al. ) 65. Merkmale dieses Protokoll enthalten Differenzierung hPSCs in Monolayer-Kultur mit einer einzigen Schicht einer hESC qualifizierte Matrix (Matrigel), vollständig definierten Medien mit kleinen Molekülen, um Wnt-Signal (ähnlich, aber unterscheidet sich von 1,2,7,13) modulieren, und optimiert Durchflusszytometrie Färbemethoden für die Bewertung der Effizienz und Differenzierung Zellidentität. Zusammenfassend Vorteile dieses Protokoll im Vergleich zu früheren Berichten sind die Kosten-Wirksamfreundlicher Genehmigung von Eness, Reproduzierbarkeit und der hohen Effizienz für die Erzeugung Kardiomyozyten unter mehreren HPSC Linien, einschließlich hESC und hiPSC Linien. Durchflusszytometrie ist ein leistungsstarkes Analyse-Tool zur Bewertung der Qualität von Zellen in Kultur und Bestimmung Subpopulation Homogenität, und mit der richtigen experimentellen Design, können quantitative Messungen liefern. Wie bei allen Antikörpern basierenden Strategien genaue Interpretation der experimentellen Ergebnisse, müssen Teile des Assaydesign einschließlich Antikörperkonzentration und der Fixierung und Permeabilisierung Bedingungen (bei intrazelluläre Targeting-Antigene) werden sorgfältig für jeden Antikörper getestet suboptimalen Bedingungen Leistungsfähigkeit der Antikörper signifikant beeinflussen Bindung und daher die Interpretation der Ergebnisse. Wichtiger ist, wenn die Quantifizierung erforderlich ist, sind monoklonale Antikörper wesentlich, da polyklonale Antikörper können mehrere Epitope erkennen, und sind anfällig für Batch-to-Batch-Variante. Derzeit ist eine Vielzahl von Antikörpern (polyclonal und monoklonal) und Färbungsprotokolle sind für die Bewertung der in vitro Differenzierung beschrieben worden ist, macht es schwierig, die Effizienz der Kardiomyogenese unter 1,2,9,11-Protokolle zu vergleichen. Aus diesem Grund werden monoklonale Antikörper verwendet, wenn verfügbar für alle Durchflusszytometrie analysiert. In Zukunft ist zu erwarten, dass die Standardisierung dieser Färbeprotokollen, insbesondere im Hinblick auf die Quantifizierung, sollte besser zu ermöglichen Vergleich unter Differenzierungsstrategien. Die Wahl der Marker und ihre entsprechenden Antikörper, verwendet, um die Reinheit des in vitro Kardiomyogenese beurteilen variiert unter Berichte. TNNT2 wurde als Indikator für die Zellen an der Herzmuskel Schicksal gebunden und wird routinemäßig verwendet, um die Effizienz der Herzdifferenzierungsprotokollen zu bewerten. Allerdings TNNT2 wird auch in der Skelettmuskulatur während der frühen Entwicklung Küken und Ratten 16,17 ausgedrückt und in humanen glatten Muskelzellen 18 vorhanden ist </sup&gt;. Somit ist TNNT2 nicht notwendigerweise eine spezifische Markierung des menschlichen Kardiomyogenese in vitro. MLC2v und MLC2a routinemäßig als Surrogatmarker der ventrikulären und atrialen Subtypen verwendet wurden. Herausforderungen mit sich auf MLC2v und MLC2a zu Kardiomyozyten Subtyp im Zusammenhang mit der in vitro Differenzierung bestimmen ergeben sich jedoch aus der Tatsache, dass diese Genprodukte nicht auf einen bestimmten Herzkammer während der Entwicklung durch Erwachsenen beschränken, Herzrohr. In das Nagetier geschleift Herz, MLC2a mRNA vorherrschende in den Trakt Bereich Vorhof / Zufluss und MLC2v mRNA überwiegt in den ventrikulären / Ausflusstrakt Regionen. In der geloopten Herzen, sind Co-Expression von MLC2a und MLC2v mRNAs in den Einflusstrakt, AV-Kanal, und der Ausflusstrakt 19,20 beobachtet. Von 3 Tagen nach der Geburt wird MLC2v mRNA an den Ventrikel eingeschränkt und 10 Tage nach der Geburt wird MLC2a an die Vorhöfe des neonatalen Rattenherz 19 beschränkt. Daher InterpretationDaten hinsichtlich Kardiomyogenese Effizienz und Subtyp Identität nicht nur prüfen, das Vorhandensein und die Menge der Referenzmarker Ebenen, sondern muss die Entwicklungsphase (n), für die die Zeitpunkte der Differenzierung, die analysiert werden, entsprechen berücksichtigen. Dies ist besonders wichtig, wenn man, dass die Phase der Reifung kardiomyogenen Zellen durch in vitro Differenzierung von hPSCs erzeugt ähnelt am ehesten denen von embryonalen / fetalen Entwicklung 21-25. So, die sich auf räumliche Expression eines Markers in der postnatalen Herz kann nicht für die Beurteilung der HPSC-abgeleiteten Zellen, zumindest in einigen Fällen sinnvoll sein. In dem Bemühen um die Entwicklung spezifischer Kriterien zur Definition Kardiomyozyten Identität in vitro zu erleichtern, wird TNNI3 als ein wertvoller Marker zur Bewertung Kardiomyogenese in vitro, wie sie zum Herzmuskel gesamten Embryogenese bei Küken und Zebrafisch 15,20 beschränkt seinund ist in der menschlichen fetalen Skelettmuskel 26 fehlen. Während TNNI1 in der menschlichen fetalen Herzens vorhanden ist, ist TNNI3 in normalen erwachsenen Herzen 27,28 die einzige Isoform TNNI vorhanden. In Bezug auf Kardiomyozyten Subtyp Identität, IRX4 29-31 ist eine informative Marker von Zellen mit einer ventrikulären Schicksal. Auf der Proteinebene wurde IRX4 kürzlich gezeigt, an den Ventrikel von linearen Herzrohres durch neonatale Stufen der Maus 32 beschränkt werden. Dementsprechend optimiert Färbeprotokollen zur Analyse TNNI3 und IRX4 durch Durchflusszytometrie beschrieben. Nach unserer Kenntnis ist dies die erste Beschreibung eines Verfahrens zur effizienten Antikörper-basierte Färbung und Analyse IRX4 in Human Kardiomyozyten durch Durchflusszytometrie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="922">
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:431px;">Name of Reagent / Equipment</td>
			<td style="width:152px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:231px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Cell Culture</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">BD Matrigel, hESC-qualified matrix</td>
			<td style="width:152px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:111px;">354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Accutase cell detachment solution</td>
			<td style="width:152px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td style="width:111px;">7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:431px;">Dubelcco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO, Hybri-Max, sterile-filtered)</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">53817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Citric acid</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">C2404-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Y-27632 dihydrochloride selective p160ROCK inhibitor</td>
			<td style="width:152px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:111px;">1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">L-ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">A8960-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Sodium selenite</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">S5261-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Transferrin (Optiferrin &#8211; Defined, Animal-free, Recombinant Human)</td>
			<td style="width:152px;">Invitria</td>
			<td style="width:111px;">777TRF029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Fibroblast growth factor 2 (FGF2)</td>
			<td style="width:152px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:111px;">4144-TC-01M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Transforming growth factor beta 1 (TGF&#946;1)</td>
			<td style="width:152px;">Peprotech</td>
			<td style="width:111px;">100-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">DMEM/F12 with L-Glutamine and 15 mM HEPES</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Insulin</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">I9278-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">CHIR-99021 HCl</td>
			<td style="width:152px;">Sellekchem</td>
			<td style="width:111px;">S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">IWR-1</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">I0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">RPMI 1640 with L-Glutamine</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">B-27 Supplement Minus Insulin</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">B-27 Supplement (with Insulin)</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">10437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Flow cytometry reagents</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Phosphate buffered saline (10X)</td>
			<td style="width:152px;">Quality Biological Inc.</td>
			<td style="width:111px;">119-069-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:431px;">Hank&#39;s balanced salt solution without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">BD Cytofix</td>
			<td style="width:152px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:111px;">554655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">BD Phosflow perm buffer III</td>
			<td style="width:152px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:111px;">558050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">16% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:152px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:111px;">28906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Methanol</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">179957-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Acetone</td>
			<td style="width:152px;">Mallenckrodt Chemicals&#160;</td>
			<td style="width:111px;">2440-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:152px;">Amresco</td>
			<td style="width:111px;">M236-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Goat serum</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Materials</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">5 ml round bottom polystyrene tube (without cap)</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">352008</td>
			<td>for preparation of cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">5 ml round bottom polystyrene tube (with 35 &#181;M cell strainer snap cap)</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">352235</td>
			<td>for preparation of cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">2 ml rubber bulbs</td>
			<td style="width:152px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:111px;">03-448-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">9&#34; borosilicate unplugged glass Pasteur pipets</td>
			<td style="width:152px;">BioExpress</td>
			<td style="width:111px;">P-2904-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">0.65 mL microcentrifuge tubes, graduated, green</td>
			<td style="width:152px;">GeneMate</td>
			<td style="width:111px;">C-3259-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">1.5 mL microcentrifuge tubes, graduated, red</td>
			<td style="width:152px;">GeneMate</td>
			<td style="width:111px;">C-3260-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">TC20 automated cell counter</td>
			<td style="width:152px;">BioRad</td>
			<td>145-0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Counting slides for TC20</td>
			<td style="width:152px;">BioRad</td>
			<td style="width:111px;">145-0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">6 well flat bottom tissue-culture treated plate</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">20 mL syringes</td>
			<td style="width:152px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:111px;">300613</td>
			<td>For filter sterilization of aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Sterile syringe filters, 0.2 &#181;m polyethersulfone</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:111px;">28145-501</td>
			<td>For filter sterilization of aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">250 mL filter system, 0.22 &#181;m polyethersulfone, sterilizing, low binding&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">431096</td>
			<td>For filter sterilization of bulk media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">500 mL filter system, 0.22 &#181;m polyethersulfone, sterilizing, low binding&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">431097</td>
			<td>For filter sterilization of bulk media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Antibodies and Isotype Controls</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7))</td>
			<td style="width:152px;">Abcam</td>
			<td>ab19615</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-TNNT2 (clone: 1C11)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MA1-16687</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5)</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>310111</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB131661</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-IRX4&#160;&#160;</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>BS-9464R</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG1&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td>A21121</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG2a</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td>A21241</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG2b</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td>A21141</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Phycoerythrin(PE) Goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:152px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:111px;">F0110</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Mouse IgG1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557273</td>
			<td>Isotype Control</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Mouse IgG2a</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>16-4724-81</td>
			<td>Isotype Control</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Rabbit IgG-PE</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>IC105P</td>
			<td>Isotype Control</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">TaqMan Probesets for qRT-PCR</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">ACTB</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01060665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Brachyury T</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00610080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">CASQ2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00154286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">IRX4</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01100809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">ISL1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00158126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MESP1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01001283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYH11 (SMMHC)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00224610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">MYH6</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01101425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYL2 (MLC2v)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00166405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYL7 (MLC2a)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01085598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYOG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01072232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">NKX2.5</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00231763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">NPPA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01081097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">POU5F1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs04260367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">SOX17</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>HS00751752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNI1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00913333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNI2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00268536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNI3</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>HS00165957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNT2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00165960</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry

Es ist dringend notwendig, um Ansätze für die Reparatur der geschädigten Herz, die Entdeckung neuer therapeutischer Medikamente, die nicht über toxische Wirkungen auf das Herz, und die Verbesserung der Strategien, um genau zu modellieren Herzkrankheit zu entwickeln. Das Potenzial der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) Technik zur Nutzung zu Herzmuskel &quot;in einer Schale&quot; für diese Anwendungen zu generieren weiterhin hohe Begeisterung zu erzeugen. In den letzten Jahren hat die Fähigkeit, kardiomyogenen Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) effizient zu erzeugen stark verbessert, bietet uns neue Möglichkeiten sehr frühen Stadien der menschlichen Herzentwicklung modelliert nicht zugänglich. Im Gegensatz zu vielen früheren Verfahren, die hier beschrieben Kardiomyozytendifferenzierung Protokoll keine Zellaggregation oder die Zugabe von Activin A oder BMP4 erfordern und robust erzeugt Kulturen von Zellen, die stark positiv für Herz-Troponin I und T (TNNI3, TNNT2) iroquois- Klasse homeodomain ProteinIRX-4 (IRX4), Myosin regulatorische leichte Kette 2, ventrikuläre / Herzmuskel-Isoform (MLC2v) und Myosin regulatorische leichte Kette 2, Vorhof Isoform (MLC2a) am Tag 10 in allen menschlichen embryonalen Stammzellen (hES) und hiPSC Linien getestet Datum. Zellen können agiert und für mehr als 90 Tage in Kultur gehalten werden. Die Strategie ist technisch einfach zu realisieren und kostengünstig. Charakterisierung von Kardiomyozyten aus pluripotenten Zellen abgeleitet sind oft die Analyse von Referenz-Markierungen sowohl auf der mRNA-und Proteinebene. Zur Proteinanalyse, Durchflusszytometrie ist ein leistungsfähiges analytisches Werkzeug für die Beurteilung der Qualität der Zellen in Kultur und Bestimmen Subpopulation Homogenität. Allerdings können technische Variation in der Probenvorbereitung erheblich beeinträchtigen die Qualität der Durchflusszytometrie Daten. So sollte die Standardisierung von Färbeprotokollen Vergleiche zwischen verschiedenen Differenzierungsstrategien erleichtern. Dementsprechend optimiert Färbeprotokollen zur Analyse IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3 und TNNT2 durch Durchflusszytometrie beschrieben.

Am Tag 0 wurden die Zellen zu 100% konfluent mit kompakten Morphologie und minimalen Zelltrümmer. An den Tagen 1-2, ist es üblich, den Zelltod signifikant (40-50%) zu beobachten, aber anhaftenden Zellen werden kompakte Morphologie (1A) zu erhalten. Während dieser Zeit ist die Medien orange und trüb. Rosa Medien zeigt übermäßigen Zelltod, und in diesem Fall, bestätigen Sie mit Trypanblau und einzustellen, wenn Zelltod übersteigt 70%. Zellen während der Tage 3-4 erholen und Dichte zu erhöhen. W...

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High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

Der Artikel beschreibt die detaillierte Methode zur menschlichen pluripotenten Stammzellen differenzieren zu Herzmuskelzellen wirksam durch selektives Modulieren des Wnt-Signalwegs, gefolgt von Durchflusszytometrie-Analyse von Referenzmarkierungen, um die Homogenität und Identität der Population abzuschätzen.

High Efficiency Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen zu Kardiomyozyten und Charakterisierung mittels Durchflusszytometrie

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

high-efficiency-differentiation-human-pluripotent-stem-cells-to

Research

JoVE Journal

Biology

30.0K Aufrufe.  Medical College of Wisconsin.  Der Artikel beschreibt die detaillierte Methode zur menschlichen pluripotenten Stammzellen differenzieren zu Herzmuskelzellen wirksam durch selektives Modulieren des Wnt-Signalwegs, gefolgt von Durchflusszytometrie-Analyse von Referenzmarkierungen, um die Homogenität und Identität der Population abzuschätzen. 

Serie: High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

Differenzierung von embryonalen Stammzellen in Oligodendrozyten Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Forschung

Biologie

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Durchflusszytometrie Reinigung der Maus meiotischen Zellen

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

Transfektion und Nucleofecting menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Effiziente Ableitung von Human Cardiac Vorstufen und Kardiomyozyten aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

Generation of Human Cardiomyocytes: Eine Differenzierung Protokoll von Feeder-freien menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Analyse von Zellsuspensionen isoliert von festen Geweben von Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production of all mature blood cells. In recent years cellular metabolism has emerged as a crucial regulator of HSC function and fate. We have previously demonstrated that modulation of mitochondrial metabolism influences HSC fate. Specifically, by chemically uncoupling the electron transport chain we were able to maintain HSC function in culture conditions that normally induce rapid differentiation. However, limiting HSC numbers often precludes the use of standard assays to measure HSC metabolism and therefore predict their function. Here, we report a simple flow cytometry assay that allows reliable measurement of mitochondrial membrane potential and mitochondrial mass in scarce cells such as HSCs. We discuss the isolation of HSCs from mouse bone marrow and measurement of mitochondrial mass and membrane potential post ex vivo culture. As an example, we show the modulation of these parameters in HSCs via treatment with a metabolic modulator. Moreover, we extend the application of this methodology on human peripheral blood-derived T cells and human tumor infiltrating lymphocytes (TILs), showing dramatic differences in their mitochondrial profiles, possibly reflecting different T cell functionality. We believe this assay can be employed in screenings to identify modulators of mitochondrial metabolism in various cell types in different contexts.

Here we describe a reliable method to measure mitochondrial mass and membrane potential in ex vivo cultured hematopoietic stem cells and T cells.

Messung des mitochondrialen Masse- und Membranpotenzials in hämatopoetischen Stammzellen und T-Zellen durch Durchflusszytometrie

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization by Nano-Flow Cytometry

Single particle characterization has become increasingly relevant for research into extracellular vesicles, progressing from bulk analysis techniques and first-generation particle analysis to comprehensive multi-parameter measurements such as nano-flow cytometry (nFCM). nFCM is a form of flow cytometry that utilizes instrumentation specifically designed for nano-particle analysis, allowing for thousands of EVs to be characterized per minute both with and without the use of staining techniques. High resolution side scatter (SS) detection allows for size and concentration to be determined for all biological particles larger than 45 nm, while simultaneous fluorescence (FL) detection identifies the presence of labeled markers and targets of interest. Labeled subpopulations can then be described in quantitative units of particles/mL or as a percentage of the total particles identified by side scatter.
Here, EVs derived from conditioned cell culture media (CCM) are labeled with both a lipid dye, to identify particles with a membrane, and antibodies specific for CD9, CD63, and CD81 as common EV markers. Measurements of comparison material, a concentration standard and a size standard of silica nanospheres, as well as labeled sample material are analyzed in a 1-minute analysis. The software is then used to measure the concentration and size distribution profile of all particles, independent of labeling, before determining the particles that are positive for each of the labels.
Simultaneous SS and FL detection can be utilized flexibly with many different EV sources and labeling targets, both external and internal, describing EV samples in a comprehensive and quantitative manner.

The latest generation of EV characterization tools are capable of single EV analysis across multiple parameters simultaneously. Nano-flow cytometry measures all biological particles larger than 45 nm without labeling and identifies specific characteristics of subpopulations by a variety of fluorescent labeling techniques.

Charakterisierung einzelner extrazellulärer Vesikel-Transmembranproteine mittels Nano-Durchflusszytometrie

Single particle characterization has become increasingly relevant for research into extracellular vesicles, progressing from bulk analysis techniques and ...

Echtzeitmessungen von Calcium- und Kontraktilitätsparametern in hiPSC-CMs

Real-Time Measurements of Calcium and Contractility Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) represent a powerful tool for studying mutation-mediated changes in cardiomyocyte function and defining the effects of stressors and drug interventions. In this study, it is demonstrated that this optics-based system is a powerful tool to assess the functional parameters of hiPSC-CMs in 2D. By using this platform, it is possible to perform paired measurements in a well-preserved temperature environment on different plate layouts. Moreover, this system provides researchers with instant data analysis.
This paper describes a method for measuring the contractility of unmodified hiPSC-CMs. Contraction kinetics are measured at 37 &#176;C based on pixel correlation changes relative to a reference frame taken at relaxation at a 250 Hz sampling frequency. Additionally, simultaneous measurements of intracellular calcium transients can be acquired by loading the cell with a calcium-sensitive fluorophore, such as Fura-2. Using a hyperswitch, ratiometric calcium measurements can be performed on a 50 &#181;m diameter illumination spot, corresponding to the area of the contractility measurements.

Autor im Rampenlicht: Echtzeitmessungen von Kalzium- und Kontraktilitätsparametern in humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten  

Here, an established method is described to perform contractility and calcium measurements in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes using an optics-based platform. This platform enables researchers to study the effect of mutations and the response to various stimuli in a rapid and reproducible manner.

Echtzeitmessungen von Kalzium- und Kontraktilitätsparametern in humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) represent a powerful tool for studying mutation-mediated changes in cardiomyocyte ...