Es ist eine einfache Behandlung, die auf jede Stammzelllinie oder jedes Differenzierungsprotokoll angewendet werden kann, um Zellen zur Differenzierung zu primieren. Alles, was man tun muss, ist DMSO bei 1-2% in das Zellkultur-Wartungsmedium hinzuzufügen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass man das Differenzierungspotenzial pluripotenter Stammzellen in jede Linie der Wahl deutlich erhöhen kann, indem Zellen zur Differenzierung grundiert werden.
Die DMSO-Behandlung erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass sich Zellen von vom Patienten abgeleiteten iPSCs unterscheiden, sodass sie für die Zellersatztherapie, die Krankheitsmodellierung und das Arzneimittelscreening verwendet werden können. Sie kann zu einem frühen Beginn der Regulierung führen, die die Unterproliferation, Differenzierung und Spezifikation während der embryonalen Entwicklung kontrolliert. Wir haben gezeigt, dass die DMSO-Behandlung die Differenzierung in fast 50 menschlichen embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzelllinien verbessert.
Während andere Laboratorien gezeigt haben, dass es vorteilhaft für Stammzellen anderer Arten, wie Maus und Primaten. Einen Tag vor Beginn der Differenzierung DMSO mit einer Konzentration von 1 oder 2% für 24 Stunden in Ihr typisches Wartungsmedium hinzufügen. 24 Stunden nach der DMSO-Behandlung, ersetzen Sie Medium und fahren Sie mit Ihrem üblichen Differenzierungsprotokoll fort.
Wachsen Sie Zellen nach Manuskriptrichtungen. Wenn die Zellen eine geeignete Konfluenz erreichen, dissoziieren Sie sie und bereiten Sie eine Einzelzellsuspension vor. Zählen Sie die lebenden Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatischen Zellzähler, wobei sie einen Lebensfähigkeitsmarker wie Trypanblau verwenden.
Um innerhalb der 24-Stunden-DMSO-Vorbehandlung 80-90%ige Konfluenz zu erreichen, die Zellen auf eine beschichtete Sechs-Bohrplatte mit einer Dichte von 500 000 bis 1 Million Zellen pro Brunnen zu verschichten. Inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator. Dann aspirieren Sie die Medien und ersetzen Sie sie durch eine 1-2%DMSO-Lösung.
Lassen Sie die Zellen 24-28 Stunden vor der Differenzierung inkubieren. Wenn Sie 48 Stunden inkubieren, ersetzen Sie das Medium nach 24 Stunden durch eine frische DMSO-Lösung. Um eine Differenzierung der 3D-Kultur zu erreichen, wachsen und sammeln Sie die Zellen in einer Zellsuspension.
Zählen Sie die lebenden Zellen und verschichten Sie sie in einer unbeschichteten, niedrig anbringenden Sechs-Well-Platte in Stammzellmedien mit ROCK-Hemmer. Typischerweise bilden sich innerhalb von 24 Stunden 3D-Human-Pluripotente Stammzellenkugeln. Lassen Sie die Zellen 24 Stunden bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator brüten.
Bereiten Sie 1-2%DMSO in vorgewärmten Stammzellmedien nach Manuskriptanweisungen vor. Um das Medium nach der Inkubation zu ersetzen, neigen Sie die Platte in einen Winkel von 30 Grad bis 45 Grad und lassen Sie Zellkugeln am Boden des Brunnens absetzen. Die Medien aus den Zellen aussaugen und in der DMSO-Lösung sanft wieder aufhängen.
Lassen Sie die Zellen 24-48 Stunden bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator brüten. Vorbehandlung von Zellen mit DMSO, wie für 2D-Kulturen beschrieben, und bereiten Noggin- und SB431542-Aktienlösungen vor. Bereiten Sie genügend 10%Knockout Serum Ersatz, oder KOSR, in Knockout DMEM für drei bis vier Tage medienverändern.
Bereiten Sie ektodermale Differenzierungsmedien vor, indem Sie Noggin und SB431542 zu vorgewärmten KOSR Knockout DMEM hinzufügen, wie im Manuskript beschrieben. Nach DMSO-Vorbehandlung, aspirieren Medien aus Zellen und fügen Sie zwei Milliliter Differenzierungsmedien zu jedem Brunnen. Lassen Sie die Zellen drei bis vier Tage bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator brüten und ersetzen Sie die Medien täglich durch frische Differenzierungsfaktoren.
Die DMSO-Vorbehandlung führt zu einer vorübergehenden und dosisabhängigen Abnahme der Zellwachstumsrate im Vergleich zu nicht behandelten Zellen. Diese Abnahme der Proliferation ist mit einer Zunahme des Zell-zu-Zell-Kontakts verbunden, der besonders ausgeprägt in den 2%DMSO-behandelten Zellen ist. Wenn die Zellen für prototypische Marker jeder Keimschicht fixiert und gebeizt werden, kann man sehen, dass 2%DMSO-Vorbehandlungzunahmen zu einem erhöhten Anteil differenzierter Keimschichtzellen führen.
SoX17 wurde beispielsweise gebeizt, um Endodermzellen zu visualisieren. Um die Wirkung von DMSO auf die Differenzierung zu Vorläuferzelltypen des zentralnervensystemischen Systems zu untersuchen, könnten vom Menschen induzierte pluripotente Stammzellen entweder in neuronale Vorläuferzellen oder Oligodendrozyten-Vorläuferzellen unterschieden werden. Im Vergleich zu Kontrollzellen erhöht 2%DMSO-Vorbehandlung die Expression des neuronalen Vorläuferzellmarkers Pax6.
In ähnlicher Weise erhöht die Vorbehandlung den Anteil der Zellen, die Oligodendrozyten-Vorläuferzellmarker Olig2 exdrücken. Darüber hinaus verbessert die anfängliche DMSO-Behandlung die funktion der menschlichen embryonalen Stammzellen nach in-vivo-Transplantation. Wenn differenzierte Pankreas-Vorläuferzellen in immundefiziente Mäuse transplantiert werden, kann ihre Funktionalität als Reaktion auf eine Glukose-Herausforderung oder KCl-Stimulation getestet werden.
Verbesserungen in der Zellfunktionalität sind von zwei Wochen bis 16 Wochen nach der Transplantation erkennbar. Die wichtigste Berücksichtigung ist die Zyklus- oder Verdoppelungszeit Ihrer Stammzellen. Die Dauer der DMSO-Behandlung sollte die gleiche sein wie die Zykluszeit der Zellen.
Nach der ersten DMSO-Behandlung kann man verstehen, wie die Zellproliferation und der Zellzyklus in Stammzellen reguliert werden, da die Behandlung dazu beiträgt, den Wachstumsstillstand in der G1-Phase des Zellzyklus zu fördern. Die differenzierten Zellen können verwendet werden, um krankheitsbedingte Mechanismen zu verstehen, zur Kokultivierung mit anderen Zelltypen, in Tumorigenitäts-Assays und in funktionellen Assays oder Transplantationsstudien, um festzustellen, ob die differenzierten Zellen einen Krankheitsphänotyp retten können.
