Nehmen Sie zunächst 100 Milligramm frisches Gewebe oder 20 Milligramm luftgetrocknetes Gewebe und geben Sie es in ein Zwei-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Legen Sie zwei fünf Millimeter große Edelstahlperlen in das Zentrifugenröhrchen und geben Sie es für 60 Sekunden in eine Hochdurchsatz-Gewebeschleifmaschine, die mit 60 Hertz arbeitet. Für die DNA-Extraktion geben Sie 800 Mikroliter vorgekühlten nuklearen Isolationspuffer in die Probe und legen Sie sie fünf Minuten lang auf einen Vortex-Mischer.
Geben Sie die Probe dann in eine Zentrifuge und schleudern Sie sie 10 Minuten lang bei 13.780 g. Nach dem Zentrifugieren den Überstand vorsichtig entfernen. Geben Sie anschließend 600 Mikroliter Puffer P1 in die Probe, gefolgt von fünf Mikrolitern RNase A.
Nach dem Vortexen inkubieren Sie die Proben 1,5 Stunden lang in einem Wasserbad bei 65 Grad Celsius und drehen die Röhrchen während der Inkubation zwei- bis dreimal um. Fügen Sie dann 200 Mikroliter Puffer P2 hinzu. Gründlich mischen. Und legen Sie die Probe 15 Minuten lang auf Eis.
Danach bei 13.780 g 10 Minuten zentrifugieren. Der Überstand wird vorsichtig auf eine Filtersäule AF abgesaugt und zwei Minuten lang bei 13.780 g zentrifugiert. Das untere Filtrat wird in ein neues 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt.
Nach der Berechnung des Volumens des Filtrats wird das 1,5-fache des Volumens von Puffer P3 zur Probe gegeben und sofort geschüttelt, um die Probe zu mischen. Geben Sie 650 Mikroliter der vorbereiteten Mischung in eine Absorptionssäule und inkubieren Sie fünf Minuten lang. Dann zentrifugieren Sie bei 13.780 g für 30 bis 60 Sekunden.
Geben Sie das erhaltene Filtrat wieder in die Absorptionssäule. Zentrifugieren Sie und entsorgen Sie die Abfallflüssigkeit. Waschen Sie die Säule zweimal mit 600 Mikrolitern Spüllösung WB. Entsorgen Sie nach dem Zentrifugieren die Abfallflüssigkeit und legen Sie die Absorptionssäule in ein leeres Auffangröhrchen.
Nachdem Sie die Probe zwei Minuten lang bei 13.780 g zentrifugiert haben, lassen Sie sie bei Raumtemperatur, um das restliche Ethanol zu verdampfen. Übertragen Sie die Absorptionssäule in ein sauberes 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und geben Sie 45 Mikroliter sterilisiertes, auf 65 Grad Celsius vorgewärmtes deionisiertes Wasser in die Mitte der Adsorptionsmembran. Fünf Minuten später zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 13.780 g für zwei Minuten bei Raumtemperatur.
Verwenden Sie dann ein Spektralphotometer. Bestimmen Sie die DNA-Konzentration in der gefilterten Lösung. Die Absorptionsverhältnisse von OD260 bis OD280 reichten von 1,8 bis 1,84, und die DNA-Menge überstieg 100 Nanogramm pro Mikroliter, was eine gute Qualität der extrahierten DNA bestätigt.
