DNA-Fingerabdrücke sind ein gängiges Werkzeug in den Biowissenschaften und werden in Vaterschaftstests sowie forensischen oder phylogenetischen Studien angewendet. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Studenten die Grundprinzipien des DNA-Fingerabdrucks in Laborkursen zu vermitteln. Es basiert auf dem menschlichen D1S80-Locus, einer variablen Anzahl von Tandem-Wiederholungsregionen, deren Länge sich allele zwischen Individuen unterscheiden können.
DNA-Extraktion, PCR, Gelelektrophorese und anschließende Analyse können schwierig durchzuführen sein, insbesondere wenn sie zum ersten Mal durchgeführt werden. Die visuelle Demonstration aller Schritte ermöglicht es den Zuschauern, die allgemeine Praxis, Details und Vorsichtsmaßnahmen zu beobachten, die bei der Durchführung dieses sehr robusten Protokolls getroffen werden müssen. Um DNA aus Epithelzellen der bukkalen Schleimhaut zu extrahieren, beginnen Sie mit der Ernte der Zellen mit einem sterilen Mundabstrich.
Verwenden Sie einen Tupfer, um 30 bis 40 Sekunden lang kräftig auf der Innenseite der Wange zu reiben. Legen Sie die Spitze des Auffangtupfers in das markierte sterile Mikrozentrifugenröhrchen und brechen Sie die Länge des Kunststoffs ab, die über den Rand hinausgeht, und schließen Sie das Röhrchen. Einen Heizblock auf 65 Grad Celsius vorheizen und alle benötigten Puffer und Lösungen vorbereiten.
Fügen Sie 500 Mikroliter Lyselösung in den Tupfer hinzu, stellen Sie sicher, dass die Probe vollständig in die Lyselösung eingetaucht ist und die Probe für mindestens fünf Sekunden wirbelt. Inkubieren Sie die Probe für 10 Minuten bei 65 Grad Celsius und wirbeln Sie gelegentlich. Entfernen Sie nach der Inkubation den Tupfer, indem Sie ihn gegen die Röhrchenwand drücken, um ein maximales Probenvolumen zu erhalten.
Fügen Sie 100 Mikroliter Denaturierungspuffer hinzu, um die Zellen zu lysieren, und mischen Sie gründlich, indem Sie das Röhrchen invertieren, bis ein weißer Niederschlag sichtbar wird. Fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und dann die Probe fünf Minuten lang bei 17.950 G zentrifugieren.450 Mikroliter des Überstands in ein sauberes, 1,5 Milliliter mikrozentrifugierendes Röhrchen geben. Dann fügen Sie 450 Mikroliter iso 2-Propanol hinzu und mischen Sie gründlich, indem Sie die Röhre invertieren, um die DNA auszufällt.
Fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und fünf Minuten zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und kehren Sie das Röhrchen auf einem sauberen Papiertuch um und trocknen Sie das Pellet. Waschen Sie die DNA mit 500 Mikrolitern 70% Ethanol, zentrifugieren Sie kurz für eine Minute und entsorgen Sie den Überstand.
Um das Pellet vollständig zu trocknen, inkubieren Sie die Probe fünf Minuten lang bei 65 Grad Celsius in einem Heizblock. Fügen Sie schließlich 30 Mikroliter Elutionspuffer hinzu und inkubieren Sie sie 10 Minuten bei 65 Grad Celsius, um das DNA-System zu inaktivieren. Bereiten Sie die Mastermischung vor, indem Sie den grünen PCR-Puffer, DNTPs, Primer, Wasser und Polymerase in das Mikrozentrifugenröhrchen geben.
Beschriften Sie die PCR-Röhrchen mit Probennummern und aliquoten 45 Mikrolitern des PCR-Master-Mixes auf jeder PCR-Röhrchen. Als nächstes fügen Sie fünf Mikroliter DNA hinzu oder, für die Kontrolle ohne Vorlage, Fügen Sie Wasser hinzu. Schließen Sie die PCR-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie kurz.
Legen Sie die Röhren in den Thermocycler und starten Sie das PCR-Programm. Wenn das Programm abgeschlossen ist, lagern Sie die Proben bei vier Grad Celsius bis zur weiteren Verarbeitung. Bereiten Sie ein 1,5% iges Agarosegel vor, indem Sie 1 1/2 Gramm Agarosepulver wiegen und mit 100 Millilitern TAE-Pufferlösung in einer Flasche mischen.
Erhitzen Sie die Agarosemischung vorsichtig in einer Mikrowelle und schwenken Sie die Mischung dazwischen, bis sich die Agarose vollständig aufgelöst hat. Beachten Sie, dass Es zu Kochverzögerungen kommen kann. Nach einem kurzen Abkühlen der Agarosemischung zwei Mikroliter Pecgrün hinzufügen.
Gießen Sie das Gel und verwenden Sie einen Kamm mit genügend Vertiefungen für die Proben. Nach vollständiger Polymerisation des Agarosegels laden Sie die Vertiefungen mit 10 Mikrolitern jeder der PCR-Proben und fügen den flankierenden Vertiefungen einen Molekulargewichtsstandard hinzu. Lassen Sie das Gel mit 150 Volt für ca. 40 Minuten laufen.
Um die PCR-Produkte zu visualisieren, stellen Sie das Gel mit ultraviolettem Licht ab. Für die Analyse der verstärkten D1S80-Allele legen Sie ein Lineal neben den Molekulargewichtsstandard, beginnend an den Vertiefungen auf dem Fotogelbild. Messen Sie den Abstand für jedes Band des Gewichtsstandards und notieren Sie die Längen in einem Tabellenberechnungsprogramm.
Als nächstes bestimmen Sie den Logarithmus jeder Fragmentgröße des Gewichtsstandards. Fügen Sie ein Streudiagramm mit log-transformierten, gewichtsüblichen Fragmentgrößen und den gemessenen Abständen zu Ihrem Gel ein. Passen Sie eine Trendlinie an und zeigen Sie die Regressionsgleichung und den R-Quadrat-Wert an.
Fügen Sie in einer neuen Tabelle die Messabstände von den PCR-Ampliconen zu den Vertiefungen ein. Um die Größe dieser Amplicons zu bestimmen, verwenden Sie die Regressionsgleichung aus der linearen Regression und berechnen Sie den Antilog, um die Fragmentgrößen in Basenpaaren aus den Amplicons zu erhalten. Ordnen Sie abschließend jedem gemessenen Amplicon die Wiederholungseinheiten von 16 Basenpaaren zu.
Die Extraktion von DNA und die Amplifikation des D1S80-Locus war für alle untersuchten Individuen erfolgreich, und die No-Template-Kontrolle in Lane 10 zeigte keine Amplicons. Aus der Fragmentlängenanalyse wurden die Individuen als homozygot oder heterozygot mit zwei Allelen klassifiziert. Die Anzahl der Wiederholungseinheiten der Tandemwiederholungen war eindeutig zuordenbar und kann nun zur weiteren Analyse dienen.
Hier beschreiben wir eine einfache und kostengünstige Methode zur Implementierung von molekularem Fingerabdruck in der praktischen Ausbildung. Der gesamte Vorgang kann innerhalb eines einzigen Arbeitstages abgeschlossen werden und besteht aus vier verschiedenen Schritten. Im ersten Schritt wird die DNA-Vorlage erstellt.
Bukkale Epithelzellen werden durch Tupferproben entnommen. Mundabstriche sind ein zuverlässiges Werkzeug, um eine ausreichende Quantität und Qualität der Zellen für die DNA-Extraktion bereitzustellen. Darüber hinaus verwendet das DNA-Extraktionsprotokoll keine organischen Lösungsmittel, was in Den laborischen Kursen im Grundstudium von Vorteil ist.
Schritt eins kann in 90 Minuten oder weniger abgeschlossen werden. Im zweiten Schritt wird der D1S80-Locus mittels PCR verstärkt. Die hier vorgestellten PCR-Bedingungen sind auch bei schlechter Qualität der DNA-Schablone robust.
Dieser Schritt kann in 2 1/2 Stunden abgeschlossen werden. Die PCR-Produkte werden dann mittels Agarosegelelektrophorese analysiert. Die Agarose-Gelelektrophorese hat viele Vorteile gegenüber anderen Techniken, wie die Vermeidung gefährlicher Komponenten und eine einfache Präparationstechnik.
Diese Analyse kann in 90 Minuten abgeschlossen werden. Nach der Elektrophorese können die Ergebnisse der Fragmentlänge innerhalb von 90 Minuten durch lineare Regressionsanalyse analysiert werden, entweder mit einem Tabellenberechnungsprogramm oder mit einem einfachen Taschenrechner. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die vorgestellte Fingerprinting-Methode in praktischen Praktika verwendet werden kann, um die Verwendung molekularer Marker und ihre Anwendung in der biologischen Wissenschaft zu lehren.
