Hybridisierung von Bakterienzellen mit einer Oligonukleotidsonde, die mit einem Fluorophor markiert ist, mittels Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH)

Nehmen Sie zunächst in Paraformaldehyd fixierte Bakterienzellen. Die Zellen werden bei 14.000 x g 10 Minuten lang zentrifugiert. Entfernen Sie dann den Überstand.

Das Pellet in 100 Mikrolitern 96%igem Ethanol in analytischer Qualität resuspendieren und eine Minute lang bei Raumtemperatur inkubieren. Wiederholen Sie die Zentrifugation fünf Minuten lang, entfernen Sie dann das Ethanol und trocknen Sie das Zellpellet an der Luft. Hybridisieren Sie nun die Zellen in einer Lösung, die fluoreszenzmarkiertes Oligonukleotid enthält, für drei Stunden bei 46 bis Grad Celsius.

Unmittelbar nach der Hybridisierung zentrifugieren Sie die Proben in einem auf 46 Grad Celsius vorgeheizten Rotor für 15 Minuten bei der maximal zulässigen Temperatur. Anschließend waschen Sie die Proben in einem Puffer mit geeigneter Strenge 15 Minuten lang bei 48 Grad Celsius. Nach dem Zentrifugieren der Probe werden die Zellen erneut mit 500 Mikrolitern eiskaltem PBS gewaschen.

Suspendieren Sie sie in 20 Mikrolitern PBS und lagern Sie sie bis zur weiteren Verwendung bei vier Grad Celsius.