NIH gewährt R01 HL085369, HL067322, HL082729, EB008999

1. Vorbereitung <ol><li> Bereiten Sie frisch zubereitete Tyrodes &quot;-Lösung (in mM, 128.2 NaCl, 1,3 CaCl 2, 4,7 KCl, 1,19 NaH 2 PO 4, 1,05 MgCl 2, 20,0 NaHCO 3, und 11,1 Glucose). Zur Beschleunigung der täglichen Zubereitung von Lösungen, bereiten zwei Stammlösungen im Voraus und speichern Sie sie bei +4 ° C Kühlschrank: (1) Lager I (in g/2L, 374,6 NaCl, 9,56 CaCl 2, 17,52 KCl, 8.21 NaH 2 PO 4 , 10,67 MgCl 2) und (2) Lager II (in g/2L, 84,01 NaHCO 3). Um 2L von Tyrodes &quot;-Lösung genügt für einen Versuch nehmen 1840mL VE-Wasser und mischen in das 80 ml Lager I, 80ml von Lager II und 4g Glukose. </li><li> Stammlösungen von Farbstoffen und Entkoppler: (1) Erregung und Kontraktion Entkoppler blebbistatin Stammlösung (Tocris Bioscience, 2mg/mL Lösung in DMSO), (2) Spannung Farbstoff di-4-ANEPPS Stammlösung (Invitrogen, 1mg/ml Lösung in DMSO), (3) Spannung Farbstoff RH 237-Stammlösung (Invitrogen, 1.25mg/ml Lösung in DMSO), (4) Calcium-Indikator Rhod-2AM Stammlösung (Invitrogen, 1mg/ml Lösung in DMSO). Ein einzelnes Kaninchen Experiment erfordert etwa 30 ul der di-4-ANEPPS Stammlösung, 30 ul des RH237 Stammlösung und 200 ul der Rhod-2AM Stammlösung. Um zu vermeiden, wiederholtes Einfrieren und Auftauen, speichern wir 100 ul Aliquots von di-4-ANEPPS bei -20 ° C. Andere Farbstoffe sind auch bei -20 ° C gelagert Bewahren Sie die gelösten blebbistatin in +4 ° C Kühlschrank. </li><li> Vor der Ernte das Herz, Transfer Tyrodes &quot;-Lösung in die 2L Flasche und legen Sie sie in ein Wasserbad (Fisher Scientific), die die Temperatur der Lösung hält bei 37 ° C. 5% CO 2 - Die Lösung wird mit 95% O 2 mit Sauerstoff versorgt. Der pH-Wert ist um 7.35 gepflegt ± 0,05 durch Anpassung der Sauerstoffversorgung Ebene. Die Lösung ist in der Langendorff Perfusion System zirkuliert und wird durch ein Nylonnetz (Porengröße: 11μm, Millipore) gefiltert in die Perfusion Zeile vor der Kanüle gelegt. </li><li> Bereiten Überwachungsgeräte vor der Ernte das Herz. Ein Druckwandler (WPI) wird verwendet, um den Aortendruck während des Experiments zu überwachen. Baseline der Druckaufnehmer wird angepasst, um mmHg Null, wenn das Herz nicht auf die Perfusion System angeschlossen. Pseudo-EKG-Elektroden sind in der Kammer zur Angleichung Ableitung I, II und III der Einthoven Dreieck EKG gestellt. </li></ol> 2. Ernte und Perfusion des Kaninchenherzen <ol><li> Fix das Kaninchen in das Kaninchen restrainer. Euthanize das Kaninchen durch eine intravenöse Injektion von Natrium-Pentobarbital (50 mg / kg) mit 2000 U Heparin. Wenn das Kaninchen völlig eingeschläfert, die durch die Abwesenheit von Schmerz-Reflex bestimmt wird, ist der Brusthöhle schnell geöffnet und das Herz und die Lunge herausgeschnitten. </li><li> Machen Sie einen Schnitt am oberen Ende der aufsteigenden Aorta, bevor alle Zweige des Aortenbogens. Spülen Sie die Luft aus der aufsteigenden Aorta und dann schnell kanülieren das Herz einer 16-Gauge Kanüle, die zuvor zu einer Blase Trapper, die sehr wichtig für die Reinhaltung von Luft aus der Koronarien verbunden ist. Sobald das Herz retrograd in einem nicht-rezirkulierenden Langendorff Perfusion System perfundiert, um einen Schnitt zu den Herzbeutel schnell zu öffnen. </li><li> Entfernen Sie die Lungen-, Luftröhren-, Fett-und Bindegewebe, während das Blut durch die Perfusion gespült. </li><li> Sehr wichtig! Ein Silikon-Schlauch (~ 3cm lang und 2 mm Durchmesser) wird durch eine Lungenvene und Mitralklappe in den linken Ventrikel (LV) eingefügt und dort während des Experiments. Dieses Rohr gibt die Lösung, die in der LV gefangen ist. Ohne Umlauf Stunden während der Langedorff-Perfusion Experiment in einer mechanisch immobilisiert Herz, ist es wahrscheinlich zu schweren Ischämie in der LV Hohlraum führen und Herzrhythmusstörungen zu produzieren. </li><li> Bewegen Sie das Herz mit der Kanüle der Rückführung Langendorff-Perfusion mit der optischen Abbildung Apparat. </li></ol> 3. Experimente mit dem Panoramic Optical Mapping System <ol><li> Legen Sie das Herz in eine maßgeschneiderte Sechseck Kammer und verbinden Sie die Kanüle auf die Perfusion System. Pflegen Sie die Aortendruck bei 60 ± 5 mmHg durch Anpassung der Strömungsgeschwindigkeit des Perfusionspumpe. Monitor führen I pseudo-EKG. Pflegen Sie die pH-Wert bei etwa 7,35 ± 0,05. </li><li> Schalten Sie das Licht ausgesetzt, weil blebbistatin durch UV-und Low-End-(450-490 nm) 17 von den sichtbaren Teil des Spektrums photoinactivated ist. Langsam injizieren blebbistatin Stammlösung durch den Ansaugstutzen in die Luftblase Trapper über die Kanüle entfernt. Langsam injizieren 0.1ml blebbistatin für jeden Bolus-Injektion. Warten Sie, bis der Druck zu stabilisieren, bevor die nächste Injektion. </li><li> Gently Ort der Stimulation Elektrode auf die Lage speziell auf Ihre experimentelles Design. </li><li> Stellen Sie das Bild des Herzens in das Milchglas in der Bildebene von jedem Foto-Dioden-Array (PDA) befindet sich aus dreigleichmäßig verteilte Winkel um das Herz. Passen Sie die Position der Kanüle und die Abstände zwischen den einzelnen PDA und das Herz, um das Herz in die field-of-view aller drei PDAs fit. Machen Sie ein Foto jedes fokussiertes Bild in das Milchglas. </li><li> Langsam injizieren 10 ~ 20 &amp;mgr; l di-4-ANEPPS Stammlösung durch den Ansaugstutzen in der Luft-Blasenfalle in der Perfusionslösung. Warten Sie 1 ~ 3 Minuten vor der Einnahme von optischen Aufnahmen. </li><li> Für die erste Aufnahme, drehen Sie die grüne LED (keine Anregungsfilter, LED FLOOD, LUMILEDS) auf, nehmen optische Aufnahmen gleichzeitig von drei PDAs mit dem Custom-made-Datenerfassungssystem angeschlossen, 5 und schalten Sie das LED-Licht. Prüfen Sie die Qualität der Signale von verschiedenen Pixel alle drei PDAs. Add 0,1 ~ 0,2 ml blebbistatin Stammlösung wenn Bewegungsartefakte in der optischen Wirkung Potential bemerkt werden. Weitere 5 ul di-4-ANEPPS Stammlösung, wenn das Signal-Rausch-Verhältnis ist gering. </li><li> Beenden Sie die entworfen experimentelle Protokoll für die funktionelle Studie. Re-Fleck das Herz mit zusätzlichen 5μL di-4-ANEPPS Stammlösung, wenn das Signal verschlechtert während der Experimente durch Ausbleichen oder Auswaschen. </li><li> Schalten Sie die Raumbeleuchtung nach Abschluss der funktionellen Studie. Nehmen Sie Bilder des Herzens aus 36 gleichmäßig verteilten Winkeln. Dies wird durch Drehen des Herzens bei einem Schritt von 10 ° mit einer digitalen Kamera auf den Speicherort einer PDA feste erreicht. </li><li> Nehmen Sie das Herz aus der Kammer. Lassen Sie alle Lösungen. Waschen Sie die Perfusion System in der Reihenfolge der DI-Wasser, 70% Reagenz Alkohol, und wieder DI-Wasser. </li><li> Die Datenanalyse umfasst die Rekonstruktion des Herzens Geometrie aus den 36 digitalen Fotos, die Registrierung der das optische Signal auf der Oberfläche der rekonstruierten Geometrie und Quantifizierung der Dauer des Aktionspotentials (APD), Leitgeschwindigkeit (CV), Phase, etc. 6 </li></ol> 4. Experimente mit dem Dual-Mapping System <ol><li> (Weiter nach Teil 2) Platzieren Sie den kanülierten Herzen in ein Glas Kammer (Radnoti) und verbinden Sie die Kanüle auf die Perfusion System. Pin unten das Herz an das Silizium Boden der Kammer an der Herzspitze und Atrien. </li><li> Schalten Sie das Licht ausgesetzt wird. Langsam injizieren blebbistatin Stammlösung (15 ~ 20 min bis 10 um zu erreichen) durch den Ansaugstutzen vor Perfusionskanüle zum Herzen zu immobilisieren. </li><li> Legen Sie eine Kunststoff-Petrischale oder andere Glasscheibe abdecken, oberhalb der epikardialen Oberfläche, um die Bewegung der Lösung Oberfläche zu reduzieren. </li><li> Focus zwei CMOS-Kameras im dualen System zur Kartierung (Ultima-L, SciMedia) zur gleichen Sichtfeld. Emittierte Fluoreszenz wird von einem dichroitischen Spiegel (635 nm-Cutoff, Omega Optical) getrennt und gefiltert durch eine 700nm Langpassfilter (Thorlabs) für Spannungssignale und ein 590/30 nm Bandpassfilter (Omega Optical) für Calcium-Signale. </li><li> Richten Sie den Lichtleiter aus zwei Halogenlampen (Newport Oriel Instruments, Stratford, CT; SciMedia, Costa Mesa, CA) in Richtung des Mapping-Bereich im Hinblick auf eine gleichmäßige Ausleuchtung zu erreichen. Anregung Filter (531/40 nm, Semrock) verwendet werden. </li><li> Stain das Herz mit der Spannung Farbstoff RH 237-Stammlösung (10 ~ 30 ul) durch den Ansaugstutzen. </li><li> Mix der Rhod-2AM (0,2 ml) Stammlösung mit Pluronic F-127 (Invitrogen, 1:1-Mischung). Ultraschallbad für 1 Minute in einem mit Wasser Ultraschallbad. Injizieren Sie die Mischung durch die Blase Trapper-Port. Warten Sie ca. 20 Minuten, damit die de-Veresterung der Rhod-2 AM, bevor Kartierung beginnt. </li><li> Für eine Aufnahme, schalten Sie die Pumpe an Superfusion Bewegung an der Oberfläche der Lösung zu vermeiden, schalten Sie den Anregungslichtquelle (die Halogenlampen), nehmen optische Aufnahmen mit beiden Kameras mit dem Datenerfassungssystem (Ultima-L, SciMedia) ; schalten Sie das Anregungslicht, und schalten Sie die Pumpe Superfusion. Prüfen Sie die Qualität der optischen Signale. Re-Fleck das Gewebe, wenn nötig. </li><li> Beenden Sie den Rest des entworfenen experimentellen Protokoll für eine Studie. </li><li> Schalten Sie die Raumbeleuchtung und ein Lichtbild des Herzens, die das Sichtfeld. Nehmen Sie das Herz aus der Kammer. Lassen Sie alle Lösungen. Waschen Sie die Perfusion System in der Reihenfolge der DI-Wasser, 70% Reagenz Alkohol (Fisher Scientific) und DI-Wasser. </li><li> Datenanalyse enthält Messungen der APD, CV-, Calcium-Transienten Dauer (CaTD), die Verzögerung zwischen AP Aufstrich und CAT steigen, die Anstiegszeit des Calcium-Transienten und die Zeitkonstante eines monoexponentielle fit of the Cat Verfall. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/3160/3160fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Repräsentative Ergebnisse einer Langendorff-perfundierten Kaninchen Experiment mit der Panorama-optischen System zur Kartierung. (A) Die vordere Ansicht des Kaninchens Herz und die rekonstruierte Kaninchen Herzen Geometrie in Form einer dreidimensionalen Mesh-grid Oberfläche. (B) Twickelte er epikardialen Oberfläche farblich von der Phase (aus der Phasenebene Analyse 18) unter Angabe der Wellenfront in rot während einer Episode von Tachyarrhythmie gezeigt. (C) Die optische Wirkung Potenzial Aufnahmen aus fünf Standorten rund um die Phase Singularität von 1-5 in Feld B (D) Acht Snapshots der Aktivierung Wellenfront (rote Farbe) Ausbreitung markiert während eines Zyklus von einer stabilen reentrant Arrhythmie. Die Wellenfront Kreise um eine Phase Singularität, die sichtbar an der vorderen Oberfläche des Herzens ist im Uhrzeigersinn. Die Farbe für Repolarisation (blau) eingestellt wird teilweise durchsichtig, so dass der hintere Wellenfront sichtbar ist (zB bei 80ms, 100ms, 120ms und). Ein Film dieser reentrant Arrhythmie ist in der ergänzenden Video 1 zur Verfügung gestellt. Die Methoden zur Geometrie Wiederaufbau-, Signal-Registrierung, die Berechnung der Phase Karte und Oberfläche Auspacken sind im Detail an anderer Stelle 6 beschrieben. <img src="/files/ftp_upload/3160/3160fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse aus einer Langendorff-perfundierten Kaninchen Herzen Experiment mit dem Dual-Mapping-System (gleichzeitige Abbildung von Aktionspotential und Kalzium transient). (A) Die vordere Fläche des Herzens mit der Mapping-Sichtfeld von schwarzen Punkten übersät. (B) A Nahaufnahme von Aufnahmen von einem Standort. (C) Sample Spuren Aktionspotential (blau) und Kalzium-Transienten (rot) aus einem Array von gleichmäßig verteilten Standorten durch die schwarzen Punkte in Panel A. Beachten Sie, dass nicht alle Pixel-Aufnahmen gezeigt werden und die räumliche Auflösung ist 200 um markiert.

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M., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+maps+of+intracellular+[Ca2+]i+transients+and+action-potentials+from+the+surface+of+perfused+guinea-pig+hearts+(abstract).">Optical maps of intracellular [Ca2+]i transients and action-potentials from the surface of perfused guinea-pig hearts (abstract).</a> Circulation. 90, 632-632 (1994).</li><li>Choi, B. R., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+maps+of+optical+action+potentials+and+calcium+transients+in+guinea-pig+hearts:+mechanisms+underlying+concordant+alternans.">Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans.</a> J Physiol. 529, 171-188 (2000).</li><li>Fast, V. G., Ideker, R. 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R., Burton, F., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+Ca2++triggers+early+afterdepolarizations+and+Torsade+de+Pointes+in+rabbit+hearts+with+type+2+long+QT+syndrome.">Cytosolic Ca2+ triggers early afterdepolarizations and Torsade de Pointes in rabbit hearts with type 2 long QT syndrome.</a> J Physiol. 543, 615-631 (2002).</li><li>Hwang, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+and+vulnerability+to+fibrillation+and+defibrillation+in+Langendorff-perfused+rabbit+ventricles.">Intracellular calcium and vulnerability to fibrillation and defibrillation in Langendorff-perfused rabbit ventricles.</a> Circulation. 114, 2595-2603 (2006).</li><li>Lou, Q., Efimov, I. 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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Basierend auf unserer Erfahrung, sind der Schlüssel für eine erfolgreiche Langendorff-perfundierten Kaninchen Herzen Experiment gut vorbereitet Tyrodes &quot;-Lösung, schnelle Ernte des Herzens, gepflegte Perfusionsdruck und entsprechende pH-Wert der Lösung mit Sauerstoff in der Perfusion System. Um das Signal mit der höchstmöglichen Signal-Rausch-Verhältnis aufzunehmen, müssen wir Faktoren, einschließlich Lichtquelle, optische Filter, Fokussieroptik, Photodetektoren, etc 19 zu berücksichtigen. Einzelheiten zu diesen Aspekten werden an anderer Stelle 19 erläutert. Junge Kaninchen (Alter: 4-5 Monate, Gewicht: 7-9 kg) verwendet werden, um die epikardialen Fett, das das Signal-Rausch-Verhältnis sinkt der optischen Signale zu vermeiden. Das Signal von jedem Pixel aufgezeichnet wird eine gewichtete Integration des emittierten Lichts von einem Volumen von Gewebe. Die Tiefe dieser Gewebe ist abhängig von der Anregungs-und Emissionswellenlänge des Farbstoffes verwendet. Für di-4-ANEPPS, als Beispiel, ist der geschätzte Eindringtiefe 300 pm in der Kaninchen-Herz 20. So sollte Auslegung des optischen Signals mit Vorsicht erfolgen, wenn die lokale Heterogenität der elektrischen Funktion im Sinusknoten, AV-Knoten sind, und während der ventrikulären Arrhythmien 1,21,22. Eine Einschränkung der optischen Mapping-Technik mit Elektrode Aufnahme im Vergleich ist, dass die Repolarisationsphase der optischen Aktionspotential wird oft durch Bewegungsartefakte durch Herzkontraktion verursacht verzerrt. Mechanische Einschränkung verwendet werden, um das Artefakt zu reduzieren, kann aber nicht vollständig beseitigen. Im Vergleich dazu sind pharmakologische Erregung und Kontraktion Entkuppler wirksam bei der Beseitigung der Bewegungsartefakte. Allerdings konnten diese Entkoppler (z. B. 2,3-Butandion Monoxim) haben erhebliche elektrophysiologische Nebenwirkungen. Blebbistatin wurde gezeigt, dass keine unerwünschten Nebenwirkungen auf das Herz-Elektrophysiologie in der normalen Herzens 23 haben, und ist somit eine vielversprechende Entkoppler für optische Abbildung. Es wird darauf hingewiesen, dass die Beschleunigung von Ödemen infolge der Abschaffung der Kontraktion könnte auch Auswirkungen auf die Elektrophysiologie werden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S271-1 </td></tr><tr><td> CaCl 2 (2H 2 O) </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> C79-500 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S217-500 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (6H 2 O) </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> M33-500 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 (H 2 O) </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S369-500 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S233-3 </td></tr><tr><td> D-Glucose </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> D16-1 </td></tr><tr><td> Blebbistatin </td><td> Tocris Bioscience, Ellisville, MO </td><td> 1760 </td></tr><tr><td> Di-4-ANEPPS </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> D1199 </td></tr><tr><td> RH237 </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> S1109 </td></tr><tr><td> Rhod-2AM </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> R1244 </td></tr><tr><td> Pluronic F127 </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> P3000MP </td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxid (DMSO) </td><td> Sigma, St. Louis, MO </td><td> D2650 </td></tr></tbody></table>

multiparametric optical mapping of the langendorff-perfused rabbit heart

Die optische Bildgebung und fluoreszierende Sonden erheblich erweiterte Forschungsmethodik im Bereich der Elektrophysiologie des Herzens in einer Weise, die nicht durch andere Ansätze 1 erreicht worden konnte. Mit dem Einsatz des Calcium-und Spannungs-sensitiven Farbstoffen, ermöglicht die optische Abbildung Messung des transmembranen Aktionspotentiale und Kalzium Transienten mit hoher räumlicher Auflösung ohne physischen Kontakt mit dem Gewebe. Das macht Messungen der kardialen elektrischen Aktivität möglich unter vielen Bedingungen, wo die Verwendung von Elektroden ist unbequem oder unmöglich 1. Zum Beispiel bieten optischen Aufnahmen genaue morphologische Veränderungen des Membranpotentials während und unmittelbar nach der Stimulation und Defibrillation, während konventionelle Elektrode Techniken aus Stimulus-induzierten Artefakten leiden während und nach der Reize, die durch Elektrodenpolarisation 1. Der Langendorff-perfundierten Kaninchen Herz ist eines der am besten untersuchten Modelle des menschlichen Herzens Physiologie und Pathophysiologie. Viele Arten von Herzrhythmusstörungen beobachtet klinisch konnte beim Kaninchen Herzmodell rekapituliert werden. Es wurde gezeigt, dass Wellenmuster in das Kaninchen Herzen während ventrikuläre Arrhythmien, durch wirksame Größe des Herzens und der Wellenlänge des Wiedereintritts bestimmt, sehr ähnlich, die im menschlichen Herzen 2 sind. Es wurde auch gezeigt, dass kritische Aspekte der Erregung und Kontraktion (EG)-Kopplung in Kaninchen Myokard, wie der relative Beitrag der sarkoplasmatischen Retikulum (SR), sehr ähnlich dem menschlichen EC-Kupplung 3 ist. Hier präsentieren wir die grundlegenden Verfahren der optischen Mapping-Experimente in Langendorff-perfundierten Kaninchenherzen, einschließlich der Langendorff Perfusion System-Setup, das optische Mapping-Systeme Einrichtung, die Isolierung und Kanülierung des Herzens, Perfusion und Farbstoff-Färbung des Herzens, Erregung und Kontraktion Entkopplung und Sammlung von optischen Signalen. Diese Methoden können auch das Herz werden von anderen Tierarten als Kaninchen mit Anpassungen an Flussraten, Optik, Lösungen, etc. angewendet Zwei optische Mapping-Systeme beschrieben werden. Die Panorama-Mapping-System wird verwendet, um die gesamte Epikard des Kaninchens Herz 4-7 Karte. Dieses System bietet einen umfassenden Überblick über die Entwicklung der reentrant Schaltungen während Arrhythmogenese und Defibrillation und wurde verwendet, um die Mechanismen von Herzrhythmusstörungen und antiarrhythmia Therapie 8,9 studieren. Die Dual-Mapping-System wird verwendet, um das Aktionspotential (AP) und Kalzium transienten (CAT) gleichzeitig vom selben Blickfeld 10-13 Karte. Dieser Ansatz hat unser Verständnis der Rolle von Calcium in die elektrische alternans und die Induktion von Arrhythmien 14-16 verbessert.

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Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Dieser Artikel beschreibt die grundlegenden Verfahren für die Durchführung optische Mapping-Experimente in der Langendorff-perfundierten Kaninchen Herzen mit dem Panorama-Imaging-System und der Dual-(Spannungs-und Kalzium) Bildgebungsverfahren.

Multiparametrische Optical Mapping der Langendorff-perfundierten Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

multiparametric-optical-mapping-langendorff-perfused-rabbit

Research

JoVE Journal

Bioengineering

22.4K Aufrufe.  Washington University in St. Louis. Dieser Artikel beschreibt die grundlegenden Verfahren für die Durchführung optische Mapping-Experimente in der Langendorff-perfundierten Kaninchen Herzen mit dem Panorama-Imaging-System und der Dual-(Spannungs-und Kalzium) Bildgebungsverfahren.

Serie: Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Optische Mapping von Aktionspotentialen und Calcium Transienten in der Maus Herz

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Forschung

Biotechnik

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including skeletal muscle, bone and placenta. Contemporary studies demonstrate fusion of cells of the same type confers enhanced function. For example, when the trophoblast cells of the placenta fuse to form the syncytiotrophoblast, the syncytiotrophoblast is better able to transport nutrients and hormones across the maternal-fetal barrier than unfused trophoblasts1-4. More recent studies demonstrate fusion of cells of different types can direct cell fate. The "reversion" or modification of cell fate by fusion was once thought to be limited to cell culture systems. But the advent of stem cell transplantation led to the discovery by us and others that stem cells can fuse with somatic cells in vivo and that fusion facilitates stem cell differentiation5-7. Thus, cell fusion is a regulated process capable of promoting cell survival and differentiation and thus could be of central importance for development, repair of tissues and even the pathogenesis of disease.
Limiting the study of cell fusion, is lack of appropriate technology to 1) accurately identify fusion products and to 2) track fusion products over time. Here we present a novel approach to address both limitations via induction of bioluminescence upon fusion (Figure 1); bioluminescence can be detected with high sensitivity in vivo8-15. We utilize a construct encoding the firefly luciferase (Photinus pyralis) gene placed adjacent to a stop codon flanked by LoxP sequences. When cells expressing this gene fuse with cells expressing the Cre recombinase protein, the LoxP sites are cleaved and the stop signal is excised allowing transcription of luciferase. Because the signal is inducible, the incidence of false-positive signals is very low. Unlike existing methods which utilize the Cre/LoxP system16, 17, we have incorporated a "living" detection signal and thereby afford for the first time the opportunity to track the kinetics of cell fusion in vivo.
To demonstrate the approach, mice ubiquitously expressing Cre recombinase served as recipients of stem cells transfected with a construct to express luciferase downstream of a floxed stop codon. Stem cells were transplanted via intramyocardial injection and after transplantation intravital image analysis was conducted to track the presence of fusion products in the heart and surrounding tissues over time. This approach could be adapted to analyze cell fusion in any tissue type at any stage of development, disease or adult tissue repair.

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A method to track cell fusion in living organisms over time is described. The approach utilizes Cre-LoxP recombination to induce luciferase expression upon cell fusion. The luminescent signal generated can be detected in living organisms using biophotonic imaging systems with a sensitivity of detection of &tilde;1,000 cells in peripheral tissues.

Ein Cre-Lox P Rekombination Ansatz für den Nachweis von Cell Fusion In Vivo</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and mechanical strength. These native collagen fibrils have a characteristic banding periodicity of ~67 nm and are formed in vivo through the hierarchical assembly of Type I collagen monomers, which are 300 nm in length and 1.4 nm in diameter. In vitro, by varying the conditions to which the monomer building blocks are exposed, unique structures ranging in length scales up to 50 microns can be constructed, including not only native type fibrils, but also fibrous long spacing and segmental long spacing collagen. Herein, we present procedures for forming the three different collagen structures from a common commercially available collagen monomer. Using the protocols that we and others have published in the past to make these three types typically lead to mixtures of structures. In particular, unbanded fibrils were commonly found when making native collagen, and native fibrils were often present when making fibrous long spacing collagen. These new procedures have the advantage of producing the desired collagen fibril type almost exclusively. The formation of the desired structures is verified by imaging using an atomic force microscope.

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Simple and reproducible procedures are described for making three structurally distinct collagen assemblies from a common commercially available Type I collagen monomer. Native type, fibrous long spacing or segmental long spacing collagen can be constructed by varying the conditions to which the 300 nm long and 1.4 nm diameter monomer building block is exposed.

In vitro Synthese von Native, Fibröse Lange Abstände und Segmentberichterstattung Lange Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Patient-specific Modeling of the Heart: Estimation of Ventricular Fiber Orientations

Patient-specific simulations of heart (dys)function aimed at personalizing cardiac therapy are hampered by the absence of in vivo imaging technology for clinically acquiring myocardial fiber orientations. The objective of this project was to develop a methodology to estimate cardiac fiber orientations from in vivo images of patient heart geometries. An accurate representation of ventricular geometry and fiber orientations was reconstructed, respectively, from high-resolution ex vivo structural magnetic resonance (MR) and diffusion tensor (DT) MR images of a normal human heart, referred to as the atlas. Ventricular geometry of a patient heart was extracted, via semiautomatic segmentation, from an in vivo computed tomography (CT) image. Using image transformation algorithms, the atlas ventricular geometry was deformed to match that of the patient. Finally, the deformation field was applied to the atlas fiber orientations to obtain an estimate of patient fiber orientations. The accuracy of the fiber estimates was assessed using six normal and three failing canine hearts. The mean absolute difference between inclination angles of acquired and estimated fiber orientations was 15.4 &deg;. Computational simulations of ventricular activation maps and pseudo-ECGs in sinus rhythm and ventricular tachycardia indicated that there are no significant differences between estimated and acquired fiber orientations at a clinically observable level.The new insights obtained from the project will pave the way for the development of patient-specific models of the heart that can aid physicians in personalized diagnosis and decisions regarding electrophysiological interventions.

A methodology to estimate ventricular fiber orientations from in vivo images of patient heart geometries for personalized modeling is described. Validation of the methodology performed using normal and failing canine hearts demonstrate that that there are no significant differences between estimated and acquired fiber orientations at a clinically observable level.

Patienten-spezifischer Modellierung des Herz: Schätzung der Ventrikuläre Faserorientierungen

Patient-specific  simulations of heart (dys)function aimed at personalizing cardiac therapy are hampered  by the absence of in vivo imaging technology for ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Optische Detektion von<em&gt; E. coli</em&gt; Bakterien durch Mesoporous Silicon Biosensoren

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Nanomanipulation von RNA-Einzelmoleküle durch Optische Pinzetten

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

In-situ-Mapping der mechanischen Eigenschaften von Biofilmen durch Partikel-Tracking Mikrorheologie

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Intraductal Delivery to the Rabbit Mammary Gland

Localized intraductal treatments for breast cancer offer potential advantages, including efficient delivery to the tumor and reduced systemic toxicity and adverse effects1,2,3,4,5,6,7. However, several challenges remain before these treatments can be applied more widely. The development and validation of intraductal therapeutics in an appropriate animal model facilitate the development of intraductal therapeutic strategies for patients. While the mouse mammary gland has been widely used as a model system of mammary development and tumorigenesis, the anatomy is distinct from the human gland. A larger animal model, such as the rabbit, may serve as a better model for mammary gland structure and intraductal therapeutic development. In contrast to mice, in which ten ductal trees are spatially distributed along the body axis, each terminating in a separate teat, the rabbit mammary gland more closely resembles the human gland, with multiple overlapping ductal systems that exit through separate openings in one teat. Here, we present minimally invasive methods for the delivery of reagents directly into the rabbit mammary duct and for visualization of the delivery itself with high-resolution ultrasound imaging.

Here, we describe a technique for the localized delivery of reagents to the rabbit mammary gland via an intraductal injection. In addition, we describe a protocol for visualization and the confirmation of delivery by high-resolution ultrasound imaging of contrast agents.

Intraduktale Lieferung an die Kaninchen Brustdrüse

Localized intraductal treatments for breast cancer offer potential advantages, including efficient delivery to the tumor and reduced systemic toxicity and ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. Traditional light-sheet techniques involve the use of a single illumination beam directed orthogonally at sample tissue. Images of large samples that are produced using a single illumination beam contain stripes or artifacts and suffer from a reduced resolution due to the scattering and absorption of light by the tissue. This study uses a dual-sided illumination beam and a simplified CLARITY optical clearing technique for the murine heart. These techniques allow for deeper imaging by removing lipids from the heart and produce a large field of imaging, greater than 10 x 10 x 10 mm3. As a result, this strategy enables us to quantify the ventricular dimensions, track the cardiac lineage, and localize the spatial distribution of cardiac-specific proteins and ion-channels from the post-natal to adult mouse hearts with sufficient contrast and resolution.

This study uses a dual-sided illumination light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) technique combined with optical clearing to study the murine heart.

Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie for the Study of Murine Herzen

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive models, which provide a mathematical representation of the mechanical function of those structures. This presented biaxial mechanical testing protocol involves (i) tissue acquisition, (ii) the preparation of tissue specimens, (iii) biaxial mechanical testing, and (iv) postprocessing of the acquired data. First, tissue acquisition requires obtaining porcine or ovine hearts from a local Food and Drug Administration-approved abattoir for later dissection to retrieve the valve leaflets. Second, tissue preparation requires using tissue specimen cutters on the leaflet tissue to extract a clear zone for testing. Third, biaxial mechanical testing of the leaflet specimen requires the use of a commercial biaxial mechanical tester, which consists of force-controlled, displacement-controlled, and stress-relaxation testing protocols to characterize the leaflet tissue&#39;s mechanical properties. Finally, post-processing requires the use of data image correlation techniques and force and displacement readings to summarize the tissue&#39;s mechanical behaviors in response to external loading. In general, results from biaxial testing demonstrate that the leaflet tissues yield a nonlinear, anisotropic mechanical response. The presented biaxial testing procedure is advantageous to other methods since the method presented here allows for a more comprehensive characterization of the valve leaflet tissue under one unified testing scheme, as opposed to separate testing protocols on different tissue specimens. The proposed testing method has its limitations in that shear stress is potentially present in the tissue sample. However, any potential shear is presumed negligible.

This protocol involves characterizations of atrioventricular valve leaflets with force-controlled, displacement-controlled, and stress-relaxation biaxial mechanical testing procedures. Results acquired with this protocol can be used for constitutive model development to simulate the mechanical behavior of functioning valves under a finite element simulation framework.

Biaxiale mechanische Charakterisierung von ventrikulären Herzklappen

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...