NIH gewährt R01 HL085369.

1. Erweiterte Zubereitung der Stammlösungen <ol><li> Bereiten Sie zwei Stammlösungen von Tyrode-Lösung (16x) im Voraus in deionisiertem Wasser und lagern Sie sie bei 4 ° C: <ol class="lalpha"><li> Lager I (119,872 g / L NaCl, 3,056 g / L CaCl 2 (2H 2 O), 5,6 g / L KCl, 2,6274 g / L NaH 2 PO 4, 3,408 g / L MgCl 2 (6H 2 O), (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ)); </li><li> Lager II (26,88 g / L NaHCO3, (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ)). </li></ol></li><li> Stammlösungen von Fluoreszenzfarbstoffen. Um zu vermeiden, wiederholtes Einfrieren und Auftauen, speichern wir 30 ul Aliquots der beiden Farbstoffe bei -20 ° C, was ausreicht für ein Experiment: <ol class="lalpha"><li> Voltage-sensitiven Farbstoff RH237 (Invitrogen, Carlsbad, CA) Stammlösung, 1,25 mg / ml-Lösung in Dimethylsulfoxid (DMSO, Sigma, St. Louis, MO); </li><li> Calcium-Indikator Rhod-2AM (Invitrogen, Carlsbad, CA) Stammlösung 1 mg / ml-Lösung in DMSO. </li></ol></li><li> Bereiten Erregung und Kontraktion Entkoppler blebbistatin Stammlösung (Tocris Bioscience, St. Louis, MO, 2 mg / ml-Lösung in DMSO) im Voraus und speichern Sie die gelösten blebbistatin bei 4 ° C. </li></ol> 2. Bereiten Perfusionslösungen und experimentelle Setup 7 <ol start="4"><li> Frisch vorzubereiten 2L Tyrode-Lösung (128.2mM NaCl, 1,3 mm CaCl 2 (2H 2 O), 4,7 mm KCl, 1,05 mm MgCl 2 (6H 2 O), 1,19 mm NaH 2 PO 4, 20 mM NaHCO 3, 11,1 mm D-Glucose in VE-Wasser, pH = 7,35 ± 0,05). Wenn Stammlösung verwendet wird, um 2L von Tyrode-Lösung (ausreichend für ein Experiment) nehmen 1750 ml VE-Wasser und mischen in 125 ml Lager I, 125 mL Lager II und 4g Glukose. </li><li> Schalten Sie die beiden Pumpen der Perfusion Systeme. Stellen Sie die Schlauchpumpe (Peri-Star, WPI, Sarasota, USA), die für retrograde Perfusion auf 40 mL / min verwendet wird. Legen Sie die anderen Schlauchpumpe (Cole-Parmer Masterflex peristaltische Pumpe L / S, Cole-Parmer Instrument Company, Vernon Hills, Illinois), die für Superfusion verwendet wird und das Perfusat wieder zurück in den Betrieb Reservoir bis 80 mL / min. </li><li> Waschen Sie die Perfusion mit 70% Ethanol für 30 min und dann mit 2L VE-Wasser. </li><li> Sobald alle VE-Wasser aus der Kammer evakuiert, zirkulieren die Tyrode-Lösung und führt es durch eine 5-um-Filter (Millipore, Billerica, MA, USA). Warm Perfusat bis +37 ° C mit einem Wassermantel und Thermostat (ThermoNESLAB EX7, Newtown, USA) und mit Sauerstoff das Perfusat durch Einblasen von O 2 / CO 2 (95% / 5%) Gas in die Lösung. Überwachen Sie den pH-Wert der Lösung mit einem pH-Meter (Oakton Instruments, Vernon Hills, IL) und passen Sie die Geschwindigkeit von O 2 / CO 2 sprudelnden der pH um 7.35 ± 0,05 zu halten. Weiter Überwachung pH-Wert und Temperatur während des Experiments. </li><li> Die zwei optischen Abbildung Vorrichtung besteht aus zwei Micam Ultima-L CMOS-Kameras (SciMedia, Costa Mesa, CA), die hohe räumliche (100x100 Pixel, 230 ± 20 mu m pro Pixel) und zeitliche (1.000-3.000 Frames / sec) Auflösung haben. Fix ein Bandpass-Filter (590 ± 15 nm, Thorlabs, Newton, NJ) vor dem bezeichneten Kalzium-Imaging-Kamera, während ein lang-Pass-Filter (&gt; 700 nm, Thorlabs, Newton, NJ) muss in positioniert werden vor dem vorgesehenen Spannung Wärmebildkamera. Die Kameras sind senkrecht zueinander durch eine Halterung, die einen dichroitischen Spiegel (635 nm-Cutoff, Omega Optical, Brattleboro, VT) enthält angeordnet. Unmittelbar unterhalb der Zwei-Kamera-Halterung befindet sich ein Objektiv (Nikon Nikkor 55 mm 1:1,4 235052), die die Emission Licht konzentriert sich von Herzen kommt auf den dichroitischen Spiegel. Der Arbeitsabstand beträgt ca. 3cm. Das Anregungslicht wird durch eine Halogenlampe (Newport Oriel Instruments, Stratford, CT; SciMedia, Costa Mesa, CA) erzeugt und durch einen Wärme-Filter, Shutter und Bandpassfilter (520 ± 45 nm) übergeben. Eine flexible Lichtleiter leitet die bandpassgefiltert Licht auf die Vorbereitung, und eine Blende verwendet wird, um sicherzustellen, dass die Vorbereitung ausgesetzt ist, nur das Licht während der Bildaufnahme zu vermeiden Ausbleichen der Farbstoffe. </li><li> Bereiten Ag / AgCl 2 Elektroden für Stimulation und Erfassung im Voraus und installieren Sie sie in der Kammer vor der Erteilung des Herzens. Stellen Sie sicher, dass Verstärker und Filter, um eine angemessene eingestellt sind. </li></ol> 3. Ernten Sie die Maus Herz, kanülieren, und richten Sie Langendorff Perfusion <ol start="10"><li> Anesthetize die Maus mit Ketamin / Xylazin (Ketamin, 80mg/kg Körpergewicht; Xylazin, 10 mg / kg Körpergewicht) und Heparin (100 Einheiten) durch intraperitoneale Injektion. Assure angemessenes Niveau der Anästhesie durch den Mangel an Schmerz-Reflex. </li><li> Nach einer mittleren sternalen Einschnitt, schnell zu entfernen, das Herz und waschen Sie es in Sauerstoff (95% O 2, 5% CO 2), mit konstanter Temperatur (37 ± 1 ° C) Tyrode-Lösung. </li><li> Mit einem Binokular, Schnell zu identifizieren die Aorta und machen einen sauberen Schnitt in der aufsteigenden Aorta unterhalb der rechten A. subclavia. Ein kurzer Abschnitt der Aorta wird dann eine benutzerdefinierte aufgeklebt wird, 21-Gauge-Kanüle mit einem erweiterten Spitze. 4-0 schwarz-geflochtene Seidenfaden (Surgical Specialties Corporation, Reading, PA) wird verwendet, um das Herz auf die Kanüle zu fixieren. Nach Kanülierung, ist das Herz retrograd perfundierten und superfundiert mit Tyrode-Lösung. Brückenverstärker TBM4M, WPI, Sarasota,, Die retrograde Perfusion beträgt im Bereich von 2-5 ml / min auf die Aortendruck zwischen 60 und 80 mmHg (Druckaufnehmer, World Precision Instruments Inc (WPI), Sarasota, USA halten eingestellt USA). </li><li> Nach dem Herz ist durchbohrt, sind Lunge, Thymus und Fettgewebe dann seziert und entfernt werden. </li><li> Das isolierte Herz merken (Fine Science Tools) an der Spitze auf den Boden der Perfusionskammer (Sylgard beschichtet) zu streamen-induzierte Bewegung zu verhindern. Die rechten und linken Vorhof Anhängsel sind auch gespannt und merken (Fine Science Tools, Inc, Foster City, CA), um den Boden der Kammer, die maximale Fläche bietet für optische Messungen der Vorhöfe. Sehr wichtig! Ein kleiner Silikonschlauch ist in die linke Herzkammer durch die Lungenvenen eingesetzt und durch Seidenfaden zu den nahe gelegenen Bindegewebe. Dies verhindert Lösung Staus und Versauerung der Perfusat in die linke Herzkammer, was besonders wichtig ist nach der Niederschlagung des ventrikulären Kontraktionen mit einer Erregung und Kontraktion Kupplung (siehe Teil 4 Schritt 19) gefangen. </li><li> Eine maßgeschneiderte Elektrode wird auf der Oberfläche des Herzens angeordnet, um die Stimulation Reize, die von Meister-8 (AMP Instruments Ltd, Jerusalem, Israel) oder PowerLab 26T (AD Instruments, Sydney, Australien) erzeugt wird, zu führen. </li><li> Ein kleines Deckglas auf der Oberfläche der Lösung über das Herz, um Bewegungsartefakte aus der schwingenden Lösung reduzieren fixiert. </li><li> Fokus des Anregungslichts auf das Herz. Darüber hinaus stellen Sie den Abstand zwischen den Dual-Kamera Apparat und das Herz, so dass maximale Auflösung erreicht wird. </li><li> Schalten Sie alle Lichter in den Raum und beginnen elektrische Aufnahmen mit PowerLab 26T. </li></ol> 4. Lastspannung und Calcium sensitiven Farbstoffen und Erregung und Kontraktion Entkoppler <ol start="19"><li> Warm-up 0,6 ml blebbistatin. Mix 0,5 ml des blebbistatin mit dem Perfusat in der Holding-Reservoir. Verdünnen Sie die verbleibenden 0,1 ml blebbistatin in 1 ml Tyrode-Lösung und langsam injizieren (über einen Zeitraum von 20 Minuten) durch ein Medikament Hafen in der Nähe der Kanüle entfernt. Beobachten Sie, wie blebbistatin allmählich reduziert Bewegungsartefakte. </li><li> Verdünnen Sie 30 ul Spannung Farbstoff RH237 Stammlösung in 1 ml Tyrode-Lösung und langsam über 5-7 Minuten injiziert in die gleiche Einspritzöffnung als blebbistatin. </li><li> 30 ul Calcium-Indikator Rhod-2 AM ist 1:1 mit Pluronic F127 (Invitrogen, Carlsbad, CA, 20% ige Lösung in DMSO) gemischt und dann verdünnt in 1 ml Tyrode-Lösung und langsam über 5-10 min über die gleiche Einspritzöffnung angewendet . </li><li> Warten Sie 5-10 Minuten für blebbistatin und Farbstoffe an die Zellmembran und Zytosol zu erreichen. Fahren Sie mit dem Protokoll, wenn die Bewegung völlig unterdrückt. </li><li> Kontinuierliche Überwachung EKG-Aufzeichnungen über das gesamte Verfahren, um sicherzustellen, normale elektrische Funktion des Herzens. </li><li> Commence Fluoreszenzsignal Aufnahmen über den SciMedia kundenspezifische Software (SciMedia, Costa Mesa, CA). </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig1.jpg" /> Abbildung 1. Versuchsaufbau zur Perfusion, elektrische und optische Aufnahmen Mapping. EM = Emission; Lp = Langpass <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig2.jpg" /> Abbildung 2. Experimental Vorbereitung und Signal Beispiele während ventrikuläre Stimulation aufgezeichnet. Links: EKG-Signale werden von Ag / AgCl 2 Platten-Elektroden (Top) und ein Beispiel für S1S1 Stimulationsprotokoll angezeigt wird (Bottom) gesammelt. Center: Langendorff Mäuseherzen Vorbereitung. Rechts: Vertreter optische Aktionspotentiale und Kalzium transiente Signale von Atrien (Top) und Ventrikel (unten) dargestellt. Der gelbe Pfeil (oben) zeigt auf das Fluoreszenzsignal Streuung aus den Herzkammern, die im Vorhof-Aufnahmen zu sehen ist. LV = linker Ventrikel; RV = rechter Ventrikel, LA = linker Vorhof, RA = rechter Vorhof <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig3.jpg" /> Abbildung 3. Representative optische Aufnahmen von V m und die Katze von den Herzkammern eines Wildtyp-Maus Herzen. A. Die experimentelle Vorbereitung mit einer Reihe von gleichmäßig verteilten Standorten durch schwarze Punkte, deren optische Aufnahmen können in (C) gesehen werden markiert. B. Beispiel Verfolgung von V m und die Katze von einer zentralen Stelle auf dem Array (siehe Kasten in (C)). C. V m (blau) und Katze (rot) aus dem Array von gleichmäßig verteilten Standorten. Die Signale wurden binned 3x3. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig4.jpg" /> Abbildung 4. Activation Karte und Wärmeleitung. A. Ein Beispiel Aktivierung Karte von einem Wildtyp-Maus Herz mit Quer-(T) und längs (L) Richtungen durch weiße Pfeile gekennzeichnet. B. V m-Signale (Top) und dV / dt (unten) für die drei Punkte zu sehen in A (T1, T2, T3, L1, L2, L3). <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig5.jpg" /> Abbildung 5. Aktionspotential und Kalzium transienten Dauer Analyse. A. Aktionspotentialdauer bei 80% Repolarisation (APD80) und Kalzium transienten Dauer bei 80% Entspannung (80 CAD) Karten sind aus einem Herzen unter Kontrollbedingungen (links) und nach 30 nM Isoproterenol Anwendung (rechts) gezeigt. Die gelb / grüne Farbe in die Ventrikel (rechts) zeigt Isoproterenol verkürzt APD80 und 80 CAD. B. Beispiel Kurven von APD80 und 80 CAD aus dem Wildtyp-Maus Ventrikel (Top) und Vorhöfe (Bottom).

<ol>
	<li>Efimov, I. R., Rendt, J. M., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+maps+of+intracellular+[Ca2+]i+transients+and+action-potentials+from+the+surface+of+perfused+guinea-pig+hearts.">Optical maps of intracellular [Ca2+]i transients and action-potentials from the surface of perfused guinea-pig hearts.</a> Circulation. 90, 1-1 (1994).</li><li>Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+of+repolarization+and+refractoriness+from+intact+hearts.">Optical mapping of repolarization and refractoriness from intact hearts.</a> Circulation. 90, 1469-1480 (1994).</li><li>Choi, B. 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P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+the+heart.">Optical imaging of the heart.</a> Circ Res. 95, 21-33 (2004).</li><li>Fast, V. G., Dhein, S., Delmoar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+action+potential+using+voltage+sensitive+dyes.">Recording action potential using voltage sensitive dyes.</a> Practical methods in cardiovascular research. , 233-255 (2005).</li><li>Glukhov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+K(ATP)+channel+pharmacology+in+intact+mouse+heart.">Differential K(ATP) channel pharmacology in intact mouse heart.</a> J Mol Cell Cardiol. , (2009).</li><li>Baker, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+dispersion+of+repolarization+and+refractoriness+in+transgenic+mouse+hearts+promotes+reentrant+ventricular+tachycardia.">Enhanced dispersion of repolarization and refractoriness in transgenic mouse hearts promotes reentrant ventricular tachycardia.</a> Circ Res. 86, 396-407 (2000).</li><li>Sutherland, F. J., Hearse, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolated+blood+and+perfusion+fluid+perfused+heart.">The isolated blood and perfusion fluid perfused heart.</a> Pharmacol Res. 41, 613-627 (2000).</li><li>Efimov, I. 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Keine Interessenskonflikte erklärt.

In diesem Experiment haben wir modifiziert die Langendorff Perfusion Methode durch Zugabe einer kleinen Silikonschlauch, was besonders wichtig ist nach der Niederschlagung des ventrikulären Kontraktionen mit einer Erregung und Kontraktion Entkoppler. Der Silikonschlauch wird verwendet, um Lösung Staus, Versauerung der Perfusionslösung und der Entwicklung von Ischämie im linken Ventrikel zu verhindern. Die Maus Herz ist sehr empfindlich gegen Unterkühlung; somit Temperaturschwankungen über das Herz künstlichen Unterschiede in Aktionspotential Laufzeiten verursachen. Folglich wurde ein Heizsystem in der Perfusionskammer implementiert, um eine konstante Temperatur von 37 ° C während der Gesamtheit der Versuch 8 zu erhalten. Da eine Langendorff-Modell nicht beibehält Innervation des Herzens, muss man überlegen, Neurotransmitter, um das Perfusat, um physiologische Sympathikus und Parasympathikus Ton 9 zu untersuchen. Neben retrograde Perfusion, hilft neben der Superfusion des Herzens, um geeignete ökologische Parameter wie pH-Wert und Temperatur zu halten. In diesem Verfahren war die Langendorff perfundierten Herzen horizontal platziert. Eine vertikale Langendorff Perfusion-Setup kann auch 10 verwendet werden, kann aber in leicht unterschiedlichen Herz-Mechanik 11 Resultat. Neben CMOS-Kameras, sind alternative Detektoren ebenfalls verfügbar und kann auf die Karte V m und CAT gleichzeitig 12 aufgebracht werden. Anwendung von CMOS-Kameras mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung gewährleistet die Genauigkeit der Aufzeichnungen, jedoch sind optische Zuordnung Signale nicht aus einer einzigen Zelle. Vielmehr kommt jedes Fluoreszenzsignal von Hunderten oder Tausenden von Zellen, je nach optischer Vergrößerung. Die viel größere ventrikuläre Fluoreszenz kann atriale Signale durch optische Streuung verzerren, daher sorgfältige Interpretation der optisch aufgezeichneten Signalen erforderlich ist. Eine weitere Einschränkung der Maus Vorbereitung ist das Signal, Verzerrungen und Rauschen durch die Krümmung der Oberfläche aufgrund der geringen Größe des Herz 13 induziert. Leitgeschwindigkeit Messungen können nicht nur von der Krümmung der Maus Herz, sondern auch von der Elektrode Polarität und virtuelle Elektroden verändert werden. Um Genauigkeit zu erreichen für Leitgeschwindigkeit, Aktivierung Anisotropie und Repolarisation Karten, korrekte Fokussierung der Kamera an der Oberfläche des Herzens ist unerlässlich. In dieser Methode können Echtzeit-EKG-Aufnahmen ergänzen die optische Untersuchung der kardialen Elektrophysiologie. Voltage-sensitiven Farbstoffs (RH237) und Kalzium-Indikator (Rhod-2AM) sind in das Protokoll wegen ihrer schnellen Reaktion, ähnlich Anregung und verschiedene Emissionsspektren 3,7 verwendet. Es gibt alternative Kombinationen von Farben, die verwendet werden, um V m und CAT außer RH237 und Rhod-2AM 3 messen kann. Eine neuartige Spannung Farbstoff, PGHI, mit einem großen Stokes-Shift (&gt; 200 nm) wurde festgestellt, dass eine bessere V m und CAT-Signale wegen der größeren Trennung der Emissionswellenlänge zwischen PGHI und Rhod-2AM 14 zu ermöglichen. Zukünftige Verbesserungen können auf die Erforschung neuartiger fluoreszierender Sonden, die Entwicklung der neuen bildgebenden Detektoren und einer verbesserten Bildverarbeitungs-Software konzentrieren. Höhere Auflösung und neuartige optische Bildgebungsverfahren für optische 3D-Mapping sind ebenfalls wichtige zukünftige Ausrichtung der optischen Abbildung 5.

<table border="1"><tbody><tr><td> Chemikalie </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S271-1 </td></tr><tr><td> CaCl 2 (2H 2 O) </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> C79-500 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S217-500 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (6H 2 O) </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> M33-500 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 (H 2 O) </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S369-500 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S233-3 </td></tr><tr><td> D-Glucose </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> D16-1 </td></tr><tr><td> Blebbistatin </td><td> Tocris Bioscience, Ellisville, MO </td><td> 1760 </td></tr><tr><td> RH237 </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> S1109 </td></tr><tr><td> Rhod-2AM </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> R1244 </td></tr><tr><td> Pluronic F127 </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> P3000MP </td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxid (DMSO) </td><td> Sigma, St. Louis, MO </td><td> D2650 </td></tr></tbody></table>

optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart

Die Maus Herz ist ein beliebtes Modell für Herz-Kreislauf-Studien aufgrund der Existenz von Low-Cost-Technologie für die Gentechnik in dieser Spezies. Herz-Kreislauf-physiologische Phänotypisierung der Maus Herz kann leicht getan werden mittels Fluoreszenz-Bildgebung unter Einsatz verschiedener Sonden für transmembrane Potential (V m), Calcium-Transienten (CAT), und andere Parameter. Elektromechanische Kopplung wird durch Aktionspotential und intrazellulären Calcium-Dynamik geprägt, daher ist es äußerst wichtig, sowohl V m und CAT gleichzeitig Karte von der gleichen Stelle auf das Herz 1-4. Gleichzeitige optische Abbildung von Langendorff perfundierten Mäuseherzen hat das Potenzial, Mechanismen Herzinsuffizienz, Herzrhythmusstörungen, Stoffwechselerkrankungen und andere Herzkrankheiten aufzuklären. Visualisierung der Aktivierung können Leitgeschwindigkeit, die Dauer des Aktionspotentials und andere Parameter bei einer Vielzahl von Websites, die nicht von zellulärer Ebene Untersuchung erreicht werden, sondern ist auch durch optische Abbildung 1,5,6 gelöst. In diesem Papier stellen wir die Instrumentierung Setup und experimentellen Bedingungen für die simultane optische Abbildung von V m und Katze in Mäuseherzen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung mit state-of-the-art CMOS Imaging-Technologie. Konsequente optische Aufnahmen mit dieser Methode erhaltenen verdeutlichen, dass die simultane optische Abbildung von Langendorff perfundierten Mäuseherzen ist sowohl machbar als auch zuverlässig.

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Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

Dieses Papier beschreibt die Präparation Verfahren, Instrumental-Setup, und experimentellen Bedingungen bei der optischen Abbildung von Transmembranpotential (Vm) und intrazellulären Calcium-Transienten (CAT) in intakten isolierten Langendorff perfundierten Maus Herzen.

Optische Mapping von Aktionspotentialen und Calcium Transienten in der Maus Herz

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

optical-mapping-action-potentials-calcium-transients-mouse

Research

JoVE Journal

Bioengineering

27.0K Aufrufe.  Washington University in St. Louis. Dieses Papier beschreibt die Präparation Verfahren, Instrumental-Setup, und experimentellen Bedingungen bei der optischen Abbildung von Transmembranpotential (Vm) und intrazellulären Calcium-Transienten (CAT) in intakten isolierten Langendorff perfundierten Maus Herzen.

Serie: Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Dreidimensionale Optische Auflösung photoakustische Mikroskopie

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Forschung

Biotechnik

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not have been accomplished by other approaches1. With the use of the calcium- and voltage-sensitive dyes, optical mapping allows measurement of transmembrane action potentials and calcium transients with high spatial resolution without the physical contact with the tissue. This makes measurements of the cardiac electrical activity possible under many conditions where the use of electrodes is inconvenient or impossible1. For example, optical recordings provide accurate morphological changes of membrane potential during and immediately after stimulation and defibrillation, while conventional electrode techniques suffer from stimulus-induced artifacts during and after stimuli due to electrode polarization1. 
The Langendorff-perfused rabbit heart is one of the most studied models of human heart physiology and pathophysiology. Many types of arrhythmias observed clinically could be recapitulated in the rabbit heart model. It was shown that wave patterns in the rabbit heart during ventricular arrhythmias, determined by effective size of the heart and the wavelength of reentry, are very similar to that in the human heart2. It was also shown that critical aspects of excitation-contraction (EC) coupling in rabbit myocardium, such as the relative contribution of sarcoplasmic reticulum (SR), is very similar to human EC coupling3. Here we present the basic procedures of optical mapping experiments in Langendorff-perfused rabbit hearts, including the Langendorff perfusion system setup, the optical mapping systems setup, the isolation and cannulation of the heart, perfusion and dye-staining of the heart, excitation-contraction uncoupling, and collection of optical signals. These methods could be also applied to the heart from species other than rabbit with adjustments to flow rates, optics, solutions, etc.
Two optical mapping systems are described. The panoramic mapping system is used to map the entire epicardium of the rabbit heart4-7. This system provides a global view of the evolution of reentrant circuits during arrhythmogenesis and defibrillation, and has been used to study the mechanisms of arrhythmias and antiarrhythmia therapy8,9. The dual mapping system is used to map the action potential (AP) and calcium transient (CaT) simultaneously from the same field of view10-13. This approach has enhanced our understanding of the important role of calcium in the electrical alternans and the induction of arrhythmia14-16.

This article describes the basic procedures for conducting optical mapping experiments in the Langendorff-perfused rabbit heart using the panoramic imaging system, and the dual (voltage and calcium) imaging modality.

Multiparametrische Optical Mapping der Langendorff-perfundierten Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including skeletal muscle, bone and placenta. Contemporary studies demonstrate fusion of cells of the same type confers enhanced function. For example, when the trophoblast cells of the placenta fuse to form the syncytiotrophoblast, the syncytiotrophoblast is better able to transport nutrients and hormones across the maternal-fetal barrier than unfused trophoblasts1-4. More recent studies demonstrate fusion of cells of different types can direct cell fate. The "reversion" or modification of cell fate by fusion was once thought to be limited to cell culture systems. But the advent of stem cell transplantation led to the discovery by us and others that stem cells can fuse with somatic cells in vivo and that fusion facilitates stem cell differentiation5-7. Thus, cell fusion is a regulated process capable of promoting cell survival and differentiation and thus could be of central importance for development, repair of tissues and even the pathogenesis of disease.
Limiting the study of cell fusion, is lack of appropriate technology to 1) accurately identify fusion products and to 2) track fusion products over time. Here we present a novel approach to address both limitations via induction of bioluminescence upon fusion (Figure 1); bioluminescence can be detected with high sensitivity in vivo8-15. We utilize a construct encoding the firefly luciferase (Photinus pyralis) gene placed adjacent to a stop codon flanked by LoxP sequences. When cells expressing this gene fuse with cells expressing the Cre recombinase protein, the LoxP sites are cleaved and the stop signal is excised allowing transcription of luciferase. Because the signal is inducible, the incidence of false-positive signals is very low. Unlike existing methods which utilize the Cre/LoxP system16, 17, we have incorporated a "living" detection signal and thereby afford for the first time the opportunity to track the kinetics of cell fusion in vivo.
To demonstrate the approach, mice ubiquitously expressing Cre recombinase served as recipients of stem cells transfected with a construct to express luciferase downstream of a floxed stop codon. Stem cells were transplanted via intramyocardial injection and after transplantation intravital image analysis was conducted to track the presence of fusion products in the heart and surrounding tissues over time. This approach could be adapted to analyze cell fusion in any tissue type at any stage of development, disease or adult tissue repair.

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A method to track cell fusion in living organisms over time is described. The approach utilizes Cre-LoxP recombination to induce luciferase expression upon cell fusion. The luminescent signal generated can be detected in living organisms using biophotonic imaging systems with a sensitivity of detection of &tilde;1,000 cells in peripheral tissues.

Ein Cre-Lox P Rekombination Ansatz für den Nachweis von Cell Fusion In Vivo</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and mechanical strength. These native collagen fibrils have a characteristic banding periodicity of ~67 nm and are formed in vivo through the hierarchical assembly of Type I collagen monomers, which are 300 nm in length and 1.4 nm in diameter. In vitro, by varying the conditions to which the monomer building blocks are exposed, unique structures ranging in length scales up to 50 microns can be constructed, including not only native type fibrils, but also fibrous long spacing and segmental long spacing collagen. Herein, we present procedures for forming the three different collagen structures from a common commercially available collagen monomer. Using the protocols that we and others have published in the past to make these three types typically lead to mixtures of structures. In particular, unbanded fibrils were commonly found when making native collagen, and native fibrils were often present when making fibrous long spacing collagen. These new procedures have the advantage of producing the desired collagen fibril type almost exclusively. The formation of the desired structures is verified by imaging using an atomic force microscope.

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Simple and reproducible procedures are described for making three structurally distinct collagen assemblies from a common commercially available Type I collagen monomer. Native type, fibrous long spacing or segmental long spacing collagen can be constructed by varying the conditions to which the 300 nm long and 1.4 nm diameter monomer building block is exposed.

In vitro Synthese von Native, Fibröse Lange Abstände und Segmentberichterstattung Lange Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Optische Detektion von<em&gt; E. coli</em&gt; Bakterien durch Mesoporous Silicon Biosensoren

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

In-situ-Mapping der mechanischen Eigenschaften von Biofilmen durch Partikel-Tracking Mikrorheologie

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Herstellung von 3D-Kollagen-Gel und Mikrokanäle für das Studium der 3D-Interaktionen<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths from the myocardium. Genetic program defects in the Notch signaling cascade are involved in ventricular defects such as Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy or Hypoplastic Left Heart Syndrome. Using this protocol, it can be determined that shear stress driven trabeculation and Notch signaling are related to one another. Using Light-sheet Fluorescence Microscopy, visualization of the developing zebrafish heart was possible. In this manuscript, it was assessed whether hemodynamic forces modulate the initiation of trabeculation via Notch signaling and thus, influence contractile function occurs. For qualitative and quantitative shear stress analysis, 4-D (3-D+time) images were acquired during zebrafish cardiac morphogenesis, and integrated light-sheet fluorescence microscopy with 4-D synchronization captured the ventricular motion. Blood viscosity was reduced via gata1a-morpholino oligonucleotides (MO) micro-injection to decrease shear stress, thereby, down-regulating Notch signaling and attenuating trabeculation. Co-injection of Nrg1 mRNA with gata1a MO rescued Notch-related genes to restore trabeculation. To confirm shear stress driven Notch signaling influences trabeculation, cardiomyocyte contraction was further arrested via tnnt2a-MO to reduce hemodynamic forces, thereby, down-regulating Notch target genes to develop a non-trabeculated myocardium. Finally, corroboration of the expression patterns of shear stress-responsive Notch genes was conducted by subjecting endothelial cells to pulsatile flow. Thus, the 4-D light-sheet microscopy uncovered hemodynamic forces underlying Notch signaling and trabeculation with clinical relevance to non-compaction cardiomyopathy.

Here, we present a protocol to visualize developing hearts in zebrafish in 4-Dimensions (4-D). 4-D imaging, via light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), takes 3-Dimensional (3-D) images over time, to reconstruct developing hearts. We show qualitatively and quantitatively that shear stress activates endocardial Notch signaling during chamber development, which promotes cardiac trabeculation.

Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie, 4-dimensionale Bilder über die Auswirkungen der modulierende Schubspannung auf entwickelnden Zebrafisches Herzen erfassen

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. Traditional light-sheet techniques involve the use of a single illumination beam directed orthogonally at sample tissue. Images of large samples that are produced using a single illumination beam contain stripes or artifacts and suffer from a reduced resolution due to the scattering and absorption of light by the tissue. This study uses a dual-sided illumination beam and a simplified CLARITY optical clearing technique for the murine heart. These techniques allow for deeper imaging by removing lipids from the heart and produce a large field of imaging, greater than 10 x 10 x 10 mm3. As a result, this strategy enables us to quantify the ventricular dimensions, track the cardiac lineage, and localize the spatial distribution of cardiac-specific proteins and ion-channels from the post-natal to adult mouse hearts with sufficient contrast and resolution.

This study uses a dual-sided illumination light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) technique combined with optical clearing to study the murine heart.

Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie for the Study of Murine Herzen

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive models, which provide a mathematical representation of the mechanical function of those structures. This presented biaxial mechanical testing protocol involves (i) tissue acquisition, (ii) the preparation of tissue specimens, (iii) biaxial mechanical testing, and (iv) postprocessing of the acquired data. First, tissue acquisition requires obtaining porcine or ovine hearts from a local Food and Drug Administration-approved abattoir for later dissection to retrieve the valve leaflets. Second, tissue preparation requires using tissue specimen cutters on the leaflet tissue to extract a clear zone for testing. Third, biaxial mechanical testing of the leaflet specimen requires the use of a commercial biaxial mechanical tester, which consists of force-controlled, displacement-controlled, and stress-relaxation testing protocols to characterize the leaflet tissue&#39;s mechanical properties. Finally, post-processing requires the use of data image correlation techniques and force and displacement readings to summarize the tissue&#39;s mechanical behaviors in response to external loading. In general, results from biaxial testing demonstrate that the leaflet tissues yield a nonlinear, anisotropic mechanical response. The presented biaxial testing procedure is advantageous to other methods since the method presented here allows for a more comprehensive characterization of the valve leaflet tissue under one unified testing scheme, as opposed to separate testing protocols on different tissue specimens. The proposed testing method has its limitations in that shear stress is potentially present in the tissue sample. However, any potential shear is presumed negligible.

This protocol involves characterizations of atrioventricular valve leaflets with force-controlled, displacement-controlled, and stress-relaxation biaxial mechanical testing procedures. Results acquired with this protocol can be used for constitutive model development to simulate the mechanical behavior of functioning valves under a finite element simulation framework.

Biaxiale mechanische Charakterisierung von ventrikulären Herzklappen

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...