Die Untersuchungen wurden von der Wellcome Trust und Meningitis Großbritannien finanziert. HBMEC Zelllinie wurde von Dr. KS Kim zur Verfügung gestellt. Konfokale Bildgebung und Elektronenmikroskopie wurden in den Wolfson Bioimaging Facility, University of Bristol durchgeführt. Wir möchten auch an Herrn Alan Leard, Dr. Mark Jepson (University of Bristol), und Herr Alan Tilley (PerkinElmer) für ihre Hilfe und Ratschläge danken.

1. Immunfluoreszenz-Protokoll Seeding, Infektion und Immunfärbung Die folgenden Verfahren erfordern geeignete Sicherheitsniveau Gewebekultur und mikrobiologische Labors. TAG 1 A. Herstellung von Zielzellen für eine Infektion <ol><li> Seed HBMECs bei 50% Konfluenz (~ 1.5x10 4 Zellen / cm 2) auf Deckgläschen (16 mm Durchmesser) in einer 12-Well-Platte (3,8 cm 2 Wachstumsbereich / well) platziert. Nährmedium: RPMI 1640 mit 15% Hitze-inaktiviertem (56 ° C, 30min) FBS, 2 mM Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 100 U / ml Penicillin / Streptomycin, 1% (v / v) MEM nicht essentielle Aminosäuren ergänzt Säuren-Lösung und 1% MEM Vitamine Lösung. </li><li> Kultur über Nacht (O / N) bei 37 ° C in einer 5% CO 2-Inkubator. </li></ol> B. Bakterienkultur <ol><li> Wachsen die Belastung der Zinsen O / N (16-18 h) auf die gewünschte Medium zB Brain Heart Infusion (BHI)-Agar-Platten mit 10% geheizt Pferdeblut bei 37 ergänzt ° C in 5% CO 2-Atmosphäre 4. </li></ol> TAG 2 A. Herstellung von Bakterien (N. meningitidis) Suspension <ol><li> Mit einem 10 l Kultur-Schleife, eine Aussetzung der Nacht Bakterienkultur in 2 mL PBSB (PBS mit Calcium und Magnesium). </li><li> Lassen großen bakteriellen Aggregaten auf, indem die Suspension für 5 min bei Raumtemperatur (RT) stehen zu begleichen. </li><li> Ohne das Pellet, übertragen die Besten 1 ml der Suspension (stock Inokulum) in einem sterilen Röhrchen. </li><li> Zur Abschätzung Keimzahlen in den Bestand Inokulum, fügen Aliquots (20-50 ul) in Röhrchen mit 1 ml Volumen von 1% SDS in 0,1 M NaOH und vorsichtig mischen, um aufzulösen. </li><li> Messen Sie die Nukleinsäure-Gehalt der Lösung durch Bestimmung der Absorption bei 260nm (A260). In unseren Händen, bilden A260 von 1 entspricht 5x10 8 Kolonie Einheiten / ml (KBE / ml). Dies kann durch die Vorbereitung einer Reihe von Verdünnungen der Aktie Inokulum in PBSB, Ausplattieren auf Agar-Platten und das Zählen der Kolonien nach O / N Inkubation überprüft werden. </li><li> Einen aliquoten der Aktie Inokulum in die Infektion Medium [(M199 mit 2% decomplemented (56 ° C, 30min) normalem menschlichem Serum (NHS)], um die erforderliche bakterielle Dichte für die Infektion der Zielzellen zu erhalten. <ol><li> In unserem Labor ist eine Infektion Verhältnis von 200-300 Bakterien pro Zielzelle routinemäßig eingesetzt. </li></ol></li></ol> B. Cell Culture Infection <ol><li> Waschen Sie die Deckgläser mit kultivierten Zielzellen 3-mal mit Hanks Medium, um jede Spur von Antibiotika zu entfernen. </li><li> Infect Zellen mit frisch zubereiteten Bakteriensuspensionen (oben beschrieben) für 3 h auf 8 h bei 37 ° C, in 5% CO 2. </li><li> Am Ende der Infektion Zeitraum, waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS und in 500 ul von 2% Paraformaldehyd (PFA) fix für 30-45 min bei RT oder O / N bei 4 ° C. <ol><li> Paraformaldehyd Fixierung an der Konzentration und Zeit oben gezeigt wurde festgestellt, dass für die Erhaltung der bakteriellen und zellulären Morphologie. </li></ol></li><li> Nach dem Abwaschen Paraformaldehyd, permeabilisieren die Paraformaldehyd-fixierten Zellen durch Inkubation in 0,1% Triton X-100 in PBS für 10 min verdünnt. </li><li> Waschen Sie die Proben 3 mal mit PBS. </li><li> Gehen Sie zur Immunfärbung oder, alternativ, verlassen Proben in 500 ul 1% BSA / PBST O / N bei 4 ° C. </li></ol> TAG 3 Immuno-Färbung Färbung von intrazellulären Bakterien und α-Actinin können nacheinander oder gleichzeitig durch den Einsatz geeigneter primären und sekundären Antikörper wie folgt durchgeführt werden, alle Verfahren kann in 12-Well-Platten durchgeführt werden. <ol><li> Blockieren Sie die Deckgläser mit den permeabilisierten Zellen mit 500 ul 3% BSA / PBST (PBS mit 0,05% Triton X-100) für 30-60 min bei RT </li><li> Nach dem Waschen mit PBS, Übertragung jedes Deckglas einen neuen trockenen und gut in der 12-Well-Platte. </li><li> Fügen Sie die primäre Antikörper gegen Bakterien und α-Actinin; achtzig bis 100 ul Antikörper pro Deckglas genügt, wenn hinzugefügt sorgfältig auf die Oberfläche des Deckglases zu decken. Inkubieren 1h bei Raumtemperatur. <ol><li> Wir verwendeten polyklonalen Kaninchen-Antiserum gegen Neisseria meningitidis (Labor-gehoben) und monoklonalen Maus-Antikörper (mAb) gegen α-Actinin (Abcam) gleichzeitig. In einigen Experimenten an Stelle von anti α-Actinin wurden mAbs gegen Aktin oder Vimentin verwendet (Sigma). </li></ol></li><li> Am Ende der Inkubation mit 200 ul PBS zum Brunnen, heben Sie das Deckglas und in einen neuen Brunnen mit 500 ul PBS. </li><li> Nach 5 min entfernt PBS durch Pipettieren und fügen Sie dann frisches PBS. Zweimal wiederholen. Transfer Deckgläser zu einemneue gut trocknen. </li><li> Fügen Sie die entsprechenden Sekundärantikörper konjugiert unterschiedlichen Fluorochromen in 1% BSA / PBST verdünnt; inkubieren bei RT für 1h im Dunkeln. <ol><li> Für Nachweis von Bakterien, haben wir Anti-Kaninchen-Ig konjugiert TRITC und für α-Actinin und andere Zytoskelettprotein Detektion verwendeten wir Anti-Maus-Ig konjugiert entweder FITC-(Sigma) oder Alexa Fluor 488 - (Invitrogen). </li></ol></li><li> Am Ende der Inkubationszeit, wie in den Schritten 4 und 5 zu waschen. </li><li> Gegenfärbung mit 0,6 ug / ml DAPI in PBS (DNA-Färbung) für 5 min bei RT im Dunkeln. </li><li> Spülen mit PBS. </li><li> Berg Deckgläser (Zellen nach unten) auf Objektträger mit einem Tropfen Eindeckmedium (e, g Mowiol oder Vectashield) </li><li> Lagerung im Dunkeln bei 4 ° C. </li><li> Die Proben sind bereit für die Beobachtung unter dem Mikroskop. </li></ol> 2. Konfokale Laser Scanning Mikroskopie (CLSM) Zu beobachten und zu erfassen Bilder von intrazellulären Bakterien und Zytoskelett-Elemente haben wir immunolabelled Proben und Aufnahmen mit einer Leica SP5-AOBS konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop an einem Leica DM i6000 invertiert Epifluoreszenzmikroskop. Alle Bilder wurden unter Verwendung eines 63x NA 1,4 Ölimmersionsobjektiv und Prozess mit Leica-Software. CLSM Verfahren: <ol><li> Zu Beginn der CLSM Verfahren, einen Tropfen Immersionsöl auf das Ziel und Ort der Objektträger, Deckglas nach unten, auf dem Mikroskoptisch. </li><li> Set dem Mikroskop zu einem visuellen Modus und finden Sie den Bereich von Interesse über die Okulare des Mikroskops. </li><li> Mit Leica Software, wählen Sie die xyz Akquisition Modus. </li><li> Wählen Sie die 512 x 512 Format (Bildgröße). Für Kolokalisation Studien, die höhere Auflösung, desto genauer das Bild, unter Berücksichtigung der Auflösungsgrenze des Mikroskops. Dann wählen Sie die bidirektionale X-Modus, der die Scan-Geschwindigkeit erhöhen und dazu beitragen, Foto-Bleichen. </li><li> Set up sequentiellen Scan-Einstellungen. Klicken Sie in der &quot;seq&quot;-Funktion und wählen Sie eine der Scan-Modi. Wir verwenden &quot;zwischen den Zeilen&quot;-Modus. </li><li> Wählen Laserstrahlen nach dem Fluorochromen konjugiert dem Sekundärantikörper: 405 nm für DAPI (blau), 488 nm für Alexa Fluor 488 (grün) und 561 nm für TRITC (rot). Aktivieren Photomultiplier (PMT) 1, 2 und 3. Passen Sie PMT-Einstellungen an den richtigen Emissionswellenlänge zu erkennen. </li><li> Set up nach oben (&quot;begin&quot;) und unten (&quot;end&quot;) von z-Stapeln oder Serien. Als nächstes stellen Sie die gewünschte &quot;z-Schritt-size&quot;. <ol><li> Neisseria meningitidis ist ein Diplococcus (Abb. 1G) und da jeder coccus hat einen ungefähren Durchmesser von 0,5 mm, die z-Schrittweite von 0,20 &amp;mgr; m wurde gewählt, um die Wahrscheinlichkeit des Scannens jede coccus mindestens zweimal zu verbessern. Es ist auch innerhalb der Schrittweite für optimalen Auflösung von 0,1 bis 0,2 um. </li></ol></li><li> Stellen Sie den endgültigen Scan-Parameter, indem Sie Zeile Mittelung von 3, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern. </li><li> Durch Klick auf &quot;Start&quot;-Doppel-oder Dreifach-gefärbte Bilder werden durch sequentielles Abtasten bei verschiedenen Wellenlängen erhalten zu cross-talk zwischen verschiedenen Chromophoren zu beseitigen. </li><li> Für einen Hinweis auf Kolokalisation von zwei Fluorochromen, wählen Sie die &quot;Overlay&quot;-Funktion, um ausgewählte Kanäle zu einem einzigen Bild verschmelzen, zum Beispiel, wenn beide Alexa 488 (grün) und TRITC (rot) Fluorochrome colocalise, gelbe Farbe wird in das überlagerte Bild erscheinen . </li><li> Kompilieren z-Stapel oder eine Reihe mit der &quot;maximalen Projektion&quot;-Funktion für den Bau eines 2D-Bildes zur Visualisierung möglich Kolokalisation erforderlich. Weitere detaillierte Analyse der Kolokalisation kann durch Analyse der einzelnen optischen Schnitt erzielt werden. </li><li> Nach dem Erwerb der z-Stacks oder Serie verarbeiten Ihre Daten auf einem orthogonalen Bild zur Visualisierung der intrazelluläre Lokalisation von verschiedenen Elementen (Abb. 1E) zu erhalten. </li></ol> 3. Die Quantifizierung der Kolokalisation Statistische Analysen der konfokalen Scanning-Mikroskop werden die Bilder mit Volocity Software (Improvisation, PerkinElmer) durchgeführt. Diese Software bietet ein Tool speziell für Kolokalisation Analyse konzipiert, dass durch Manders et al. (1993) 5 beschrieben. Kolokalisation im Kontext der digitalen Fluoreszenzmikroskopie kann die Erkennung eines Signals am gleichen Voxel (Pixel Volumen) Lage in jedem Kanal beschrieben werden. Die beiden Kanäle sind aus Bildern von zwei verschiedenen Fluorochromen aus derselben Probe-Bereich (Volocity Bedienungsanleitung) Bezug genommen. Statistische Analysen werden mit Volocity Software (Improvisation, PerkinElmer) mittels quantitativer Kolokalisation Analysis beschrieben durchgeführt. Quantitative Analysis Kolokalisation <ol><li> Erstellen Sie eine Bibliothek mit CLSM-Bilder mit Volocity Software. </li><li> Wählen Sie &quot;extended focus&quot; vom Bild in der oberen Leiste. Dieses Tool wird z-Stacks in ein 2D-Bild zu analysierenden kompilieren. </li><li> Wählen Sie &quot;Kolokalisation&quot;-Tool. Die beiden Kanäle analysiert werden sollen die gleichen Farbtiefe. </li><li> Wählen Sie den Bereich, es wird quantifiziert werden. Stellen Sie den Schwellenwert auf jedem Hintergrund zu entfernen. </li><li> Erstellen Sie die Kolokalisation Ausgang, indem Sie &quot;zu generieren Kolokalisation&quot;. Kolokalisation Statistiken sind für die Regionen von Interesse ausgewählt zuvor generierten. </li><li> Wählen Manders &#39;Koeffizienten R (Überlappung Koeffizient) und My (Kolokalisation Koeffizient). <ol><li> Manders &#39;Koeffizienten sind nicht empfindlich auf die Intensität der Färbung, wie sie gegen insgesamt Pixelintensität normalisiert, daher können sie eingesetzt werden, wenn die Färbung eines Antigens stärker als die andere ist. </li><li> Overlap Koeffizient R nach Manders 5,6 repräsentiert das wahre Ausmaß der Kolokalisation, dh die Anzahl der Pixel, die mit der Gesamtzahl der Pixel im Vergleich colocalise. </li><li> Auf der anderen Seite, die Kolokalisation Koeffizient, My, die Fluoreszenz Beitrag der häufiger Einheit (in diesem Fall α-Actinin, grün), die weniger häufig Einheit (in diesem Fall Bakterien, rot) beschreibt, dh die Anzahl der roten Pixel dass Überschneidungen mit grünen Pixel verglichen mit der Gesamtzahl der roten Pixel. </li><li> Manders &#39;Koeffizienten zwischen 1 und 0, wobei 1 die hohe Kolokalisation, wobei 0 keiner, aber sie kann als Prozentsatz zur leichteren Interpretation zum Ausdruck gebracht werden. </li></ol></li><li> Export Statistik-Werte in eine Excel-Dokument für die Präsentation der Daten. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Intrazelluläre Lokalisation von OPC-exprimierenden Neisseria meningitidis und α-Actinin Konfokale Bildgebung des menschlichen Gehirns mikrovaskulären Endothelzellen mit Nm für 3 und 8 Stunden wie oben angegeben Kolokalisation von α-Actinin und Nm, die weniger häufig zu sein in 3 h Infektion Experimente (nicht dargestellt) erschienen beschrieben infiziert verglichen mit Kulturen für 8 h infiziert ( Abbildung 1 AF). Eine nachweisbare Kolokalisation von α-Actinin mit OPC-exprimierenden Meningokokken war jedes Mal in&gt; 5 wiederholten Experimenten beobachtet. Die statistische Analyse der Kolokalisation mit mehreren konfokalen Bildern erfolgte wie oben beschrieben durchgeführt. Insgesamt in HBMEC mit OPC-exprimierenden Meningokokken,&gt; 25% Überlappung der grünen (α-Actinin) und rot (Nm) Pixel erhalten wurde (Abbildung 2B, Overlap Koeffizient R) infiziert. Im Gegensatz zu α-Actinin, Experimenten, in denen die Kennzeichnung von internalisierten Bakterien und entweder Aktin oder Vimentin durchgeführt wurde, wurde gelegentlich Kolokalisation mit Aktin aber beobachtet mit Vimentin war selten (Figure. 2B). Die Daten wurden darüber hinaus anhand des Koeffizienten My, unter Berücksichtigung der relativen Häufigkeit der einzelnen Einheit. Meine ist ein Maß für die Häufigkeit des Auftretens der häufigeren Signal (in diesem Fall grün, α-Actinin) jedes Mal weniger reichlich Signal (in diesem Fall rot, Bakterien) auftritt. Diese Maßnahme zeigt eine auffallende Höhe des Auftretens von α-Actinin in der Nähe von verinnerlicht Meningokokken (Abb. 2A und C). <img src="/files/ftp_upload/2045/2045fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie zur intrazellulären Interaktionen von N. bewerten meningitidis mit α-Actinin. AH. Confluent endothelialen Monolayer auf Deckgläsern gezüchtet wurden mit dem OPC-exprimierenden (AF) N. infiziert meningitidis. Nach 8 h, nicht haftende Bakterien gewaschen wurden abgeschnitten, Zellen mit Paraformaldehyd fixiert und permeabilisiert mit 0,1% Triton X-100. Anschließend wurden Bakterien und α-Actinin gefärbt wie oben beschrieben (α-Actinin, grün; Bakterien, rot). AC. Ein Feld mit xy Bilder vom Standort des Nm (A) oder α-Actinin (B). Das Overlay-Bild in (C) zeigt mehrere Regionen, in denen gelb-orange Farbe anzeigt, dass Kolokalisation. Die Pfeile in (A) und (B) zeigen Regionen, in denen ein hohes Maß an α-Actinin Anhäufung scheint sich um Bakterien aufgetreten sind. D. Optical Dissektion eines infizierten HBMEC Monoschicht zeigt Kolokalisation um intrazelluläre Bakterien an der Basis der Zelle befindet. Auch dies ist Kolokalisation nicht durch zufällige Nähe der α-Actinin, als der General der α-Actinin Fleck in dieser Region ist gering. E und F. Dreidimensionale Bilder von infizierten HBMEC Monoschichten wie oben verarbeitet. Ein schräger Blick auf die apikale Oberfläche (E) zeigt anhaftenden Bakterien rot gefärbt (roter Pfeil), während einige Bakterien auf die Grundflächen von Endothelzellen (gelber Pfeil) liegen deutlich orange / gelb in der Farbe. Basal Lage deutlicher in (F), die eine End-on XZ Querschnitt zu sehen. G. A negativ gefärbten elektronenmikroskopische Aufnahme von N. meningitidis zeigt seinevorherrschende diplococcal aus. Jeder coccus ist ca. 0,5 m im Durchmesser. <img src="/files/ftp_upload/2045/2045fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Lokalisierung und Verteilung von α-Actinin, Aktin und Vimentin in HBMEC Zellen. A. Infizierte Monoschichten HBMEC behandelt wurden wie in der Legende oben beschrieben, jedoch zusätzlich zu α-Actinin, einige Deckgläser wurden für den Nachweis von Aktin oder Vimentin durch Verfahren ähnlich dem für α-Actinin verwendet. Wie oben, α-Actinin um mehrere verinnerlicht Bakterien (weiße Pfeile) konzentriert. Vimentin und Aktin nicht mit Bakterien zu nennenswerten Ebenen colocalise. Bar stellt 20 um. B. &amp; C. Die Werte für die Koeffizienten R und Meine wurden aus mehr als drei Versuche mit Volocity Software wie oben beschrieben erhalten.

<ol>
	<li>Virji, M., Makepeace, K., Moxon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+mechanisms+of+interactions+of+Opc-expressing+meningococci+at+apical+and+basolateral+surfaces+of+human+endothelial+cells;+the+role+of+integrins+in+apical+interactions.">Distinct mechanisms of interactions of Opc-expressing meningococci at apical and basolateral surfaces of human endothelial cells; the role of integrins in apical interactions.</a> Molecular Microbiology. 14, 173-184 (1994).</li><li>Virji, M., Makepeace, K., Peak, I. R., Ferguson, D. J., Jennings, M. P., Moxon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opc-+and+pilus-+dependent+interactions+of+meningococci+with+human+endothelial+cells:+molecular+mechanisms+and+modulation+by+surface+polysaccharides.">Opc- and pilus- dependent interactions of meningococci with human endothelial cells: molecular mechanisms and modulation by surface polysaccharides.</a> Molecular Microbiology. 18, 741-754 (1995).</li><li>Sa E Cunha, C., Griffiths, N. J., Murillo, I., Virji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neisseria+meningitidis+Opc+invasin+binds+to+the+cytoskeletal+protein+alpha-actinin.">Neisseria meningitidis Opc invasin binds to the cytoskeletal protein alpha-actinin.</a> Cellular Microbiology. 11, 384-405 (2009).</li><li>Virji, M., Kayhty, H., Ferguson, D. J., Alexandrescu, C., Alexandrescu, J. E., Heckels, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+pili+in+the+interactions+of+pathogenic+Neisseria+with+cultured+human+endothelial+cells.">The role of pili in the interactions of pathogenic Neisseria with cultured human endothelial cells.</a> Molecular Microbiology. 5, 1831-1841 (1991).</li><li>Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+colocalization+of+objects+in+dual+color+confocal+images.">Measurement of colocalization of objects in dual color confocal images.</a> Journal of Microscopy. 6, 357-382 (1993).</li><li>Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+colocalization+analysis+of+multicolor+confocal+immunofluorescence+microscopy+images:+pushing+pixels+to+explore+biological+phenomena.">Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena.</a> Acta Histochemica et Cytochemica. 40, 101-111 (2007).</li></ol>

Die Möglichkeit der Bindung von verinnerlicht Opc-exprimierenden Neisseria meningitidis, um α-Actinin erforscht wurde mit HBMEC durch die Untersuchung der Kolokalisation von Bakterien und die Zytoskelettprotein in infizierten Zellen nach 3 und 8 h Inkubationszeit. Durch konfokale Mikroskopie konnte Kolokalisation von Neisseria meningitidis mit α-Actinin nachgewiesen werden. Bemerkenswert ist, obwohl Bakterien bei 3 h verinnerlicht wurden, gab es wenig Kolokalisation mit α-Actinin zu diesem Zeitpunkt. Bakterielle Assoziation mit dem Zytoskelett-Protein schien einen längeren Zeitraum von intrazellulären Aufenthalt als nach 8 h Infektion Zeitraum benötigen, hatte eine erhebliche Zahl von Bakterien α-Actinin offenbar in enger Verbindung. Alpha-actinin ist ein multifunktionelles Protein, und bakteriellen Interaktionen mit dem Zytoskelett-Element könnte erheblichen Einfluss auf die Zielzelle Funktion, die einen Gegenstand aktueller Untersuchungen ist zu haben. Die Quantifizierung der Kolokalisation wie oben beschrieben, erfordert eine sorgfältige Probenvorbereitung. Besonderes Augenmerk sollte auf Probe Fixierung gegeben werden, Sperrfrist und Antikörper-Verdünnungen. Für das beste Signal-Rausch-Verhältnis sollte jeder primären und sekundären Antikörper in Vorversuchen titriert werden, um die optimale Konzentration zu bestimmen. In unserer Erfahrung, produzierte das Eindeckmedium Mowiol bessere Bilder.

1. Konfokale Laser Scanning Mikroskopie (CLSM): Leica SP5 konfokalen Imaging-System: Dieses System, das durch eine Kombination von AOTF (akusto-optischen abstimmbaren Filter) und einer AOBS (akusto-optischen Strahlteiler), vereinfacht Anregung mit bestimmten Wellenlängen. 2-Software: Leica konfokalen Software LCS, Leica Microsystems, Deutschland. Volocity 5, Improvisation, PerkinElmer, USA.

visualisation and quantification of intracellular interactions of neisseria meningitidis and human &alpha;-actinin by confocal imaging

Der OPC-Protein von Neisseria meningitidis (Nm, Meningokokken) ist eine Oberflächen-Ausdruck integralen Protein der äußeren Membran, die als Adhäsin und eine effektive Invasin für die menschliche Epithel-und Endothelzellen wirken können. Wir haben endotheliale Oberflächen-lokalisierten Integrine als wichtigsten Rezeptoren für OPC, ein Prozess, der Opc erfordert zunächst binden an Integrin-Liganden wie Vitronektin und über diese an die Zell-exprimierte Rezeptoren 1 identifiziert. Dieser Prozess führt zu bakteriellen Invasion von Endothelzellen 2. In jüngster Zeit beobachteten wir eine Interaktion von OPC mit einem 100 kDa Protein in Ganzzelllysaten von menschlichen Zellen 3 gefunden. Wir haben uns zunächst beobachtet diese Interaktion, wenn Wirtszellproteinen durch Elektrophorese aufgetrennt und geblottet auf Nitrozellulose wurden mit OPC-exprimierenden Nm überlagert. Das Zusammenspiel war direkt und waren nicht mit Zwischen-Moleküle. Mit der Massenspektrometrie, haben wir die Identität des Proteins als α-Actinin. Da keine Fläche zum Ausdruck α-Actinin wurde auf jedem der acht Zelllinien untersucht gefunden, und als OPC-Interaktionen mit Endothelzellen in Anwesenheit von Serum führen zu bakterieller Eintritt in die Zielzellen, untersuchten wir die Möglichkeit, die beiden Proteine ​​interagieren intrazellulär. Hierzu wurden kultivierte menschliche Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen (HBMECs) mit OPC-exprimierenden Nm über einen längeren Zeitraum und die Standorte der verinnerlichten Bakterien und α-Actinin wurden durch konfokale Mikroskopie untersucht infiziert. Wir beobachteten zeitabhängigen Anstieg der Kolokalisation von Nm mit dem Zytoskelett-Protein, das erhebliche nach einem Zeitraum von acht Stunden von bakteriellen Internalisierung wurde. Darüber hinaus ermöglicht der Einsatz von quantitativen Bildbearbeitungssoftware uns ein relatives Maß für die Kolokalisation von Nm mit α-Actinin und anderen Zytoskelett-Proteine ​​zu erhalten. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Visualisierung und Quantifizierung der Kolokalisation des Bakteriums mit intrazellulären Proteinen nach bakteriellen Einstieg in humanen Endothelzellen, obwohl das Verfahren gilt auch für die menschliche Epithelzellen.

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Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &amp;#945;-actinin by Confocal Imaging

Neisseria meningitidis (Nm), ein gram-negative human-spezifische respiratorische Erreger können für die menschliche α-Actinin binden. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Visualisierung von Kolokalisation des Bakteriums mit intrazellulären α-Actinin nach bakteriellen Eintrag in das menschliche Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen (HBMECs).

Visualisierung und Quantifizierung der intrazellulären Wechselwirkungen von Neisseria meningitidis And Human α-Actinin durch konfokale Imaging

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an ...

visualisation-quantification-intracellular-interactions-neisseria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &alpha;-actinin by Confocal Imaging

18.0K Aufrufe.  University of Bristol, UK. Neisseria meningitidis (Nm), ein gram-negative human-spezifische respiratorische Erreger können für die menschliche α-Actinin binden. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Visualisierung von Kolokalisation des Bakteriums mit intrazellulären α-Actinin nach bakteriellen Eintrag in das menschliche Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen (HBMECs).

Serie: Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &#945;-actinin by Confocal Imaging

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

Single Cell Messungen Vacuolar Rupture durch intrazelluläre Erreger verursacht

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

Imaging InlC Sekretion to Cellular-Infektion durch den bakteriellen Erreger untersuchen<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at all on selective media that are usually used to cultivate bacteria. For this reason, many of these pathogens were discovered only recently or following important outbreaks. These pathogens are often associated with amoebae, which serve as host-cell and allow the survival and growth of the bacteria. We intend here to provide a demonstration of two techniques that allow isolation and characterization of intracellular pathogens present in clinical or environmental samples: the amoebal coculture and the amoebal enrichment. Amoebal coculture allows recovery of intracellular bacteria by inoculating the investigated sample onto an amoebal lawn that can be infected and lysed by the intracellular bacteria present in the sample. Amoebal enrichment allows recovery of amoebae present in a clinical or environmental sample. This can lead to discovery of new amoebal species but also of new intracellular bacteria growing specifically in these amoebae. Together, these two techniques help to discover new intracellular bacteria able to grow in amoebae. Because of their ability to infect amoebae and resist phagocytosis, these intracellular bacteria might also escape phagocytosis by macrophages and thus, be pathogenic for higher eukaryotes.

Amoebal coculture is a cell culture system using adherent amoebae to selectively grow intracellular pathogens able to resist phagocytic cells such as amoebae and macrophages. It thus represents a key tool to discover new infectious agents. Amoebal enrichment allows discovery of new amoebal species and of their specific intracellular bacteria.

Entdeckung neuer intrazelluläre Erreger von Amöben Amöben Cokultur und Enrichment Ansätze

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

Echtzeit-Imaging von myeloischen Zellen in Dynamics<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Darmtumoren durch Spinning-Disk-konfokale Mikroskopie

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Eine neue Methode zur qualitativen Mehrskalige Analyse von bakteriellen Biofilmen auf filamentösen Pilzkolonien mittels konfokaler und Elektronenmikroskopie

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

Improving the speed and accuracy of bacterial detection is important for patient stratification and to ensure the appropriate use of antimicrobials. To achieve this goal, the development of diagnostic techniques to recognize bacterial presence in real-time at the point-of-care is required. Optical imaging for direct identification of bacteria within the host is an attractive approach. Several attempts at chemical probe design and validation have been investigated, however none have yet been successfully translated into the clinic. Here we describe a method for ex vivo validation of bacteria-specific probes for identification of bacteria within the distal lung, imaged by fibered confocal fluorescence microscopy (FCFM). Our model used ex vivo human lung tissue and a clinically approved confocal laser endomicroscopy (CLE) platform to screen novel bacteria-specific imaging compounds, closely mimicking imaging conditions expected to be encountered with patients. Therefore, screening compounds by this technique provides confidence of potential clinical tractability.

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

This technique describes an efficient screening process for evaluating bacteria-specific optical imaging agents within ex vivo human lung tissue, by fibered confocal fluorescence microscopy for the rapid identification of small molecule chemical probe-candidates with translatable potential.

Optische Überprüfung der neuartige Bakterien-spezifischen Sonden auf Ex Vivo menschlichen Lungengewebe durch konfokale Laser Endomikroskopie

Improving the speed and accuracy of bacterial detection is important for patient stratification and to ensure the appropriate use of antimicrobials. To ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze membrane fusion within eukaryotic cells. The SNARE protein family consists of about 36 different members. Specific intracellular transport routes are catalyzed by specific sets of 3 or 4 SNARE proteins that thereby contribute to the specificity and fidelity of membrane trafficking. However, studying the precise function of SNARE proteins is technically challenging, because SNAREs are highly abundant and functionally redundant, with most SNAREs having multiple and overlapping functions. In this protocol, a new method for the visualization of SNARE complex formation in live cells is described. This method is based on expressing SNARE proteins C-terminally fused to fluorescent proteins and measuring their interaction by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) employing fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). By fitting the fluorescence lifetime histograms with a multicomponent decay model, FRET-FLIM allows (semi-)quantitative estimation of the fraction of the SNARE complex formation at different vesicles. This protocol has been successfully applied to visualize SNARE complex formation at the plasma membrane and at endosomal compartments in mammalian cell lines and primary immune cells, and can be readily extended to study SNARE functions at other organelles in animal, plant, and fungal cells.

This protocol describes a new method allowing for the quantitative visualization of complex formation of SNARE proteins, based on F&#246;rster resonance energy transfer, and fluorescence lifetime imaging microscopy.

Visualisierung von intrazellulären SNARE Menschenhandel durch Fluoreszenz Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under controlled laboratory conditions. Ex vivo infection of human tissues with human immunodeficiency virus (HIV), among other viruses, has been successfully used to investigate early disease pathogenesis, as well as a platform to test the efficacy and toxicity of antiviral drugs. In the present protocol, we explain how to process and infect with HIV-1 tissue explants from human tonsils and cervical mucosae, and maintain them in culture on top of gelatin sponges at the liquid-air interface for about two weeks. This non-polarized culture setting maximizes access to nutrients in culture medium and oxygen, although progressive loss of tissue integrity and functional architectures remains its main limitation. This method allows monitoring HIV-1 replication and pathogenesis using several techniques, including immunoassays, qPCR, and flow cytometry. Of importance, the physiologic variability between tissue donors, as well as between explants from different areas of the same specimen, may significantly affect experimental results. To ensure result reproducibility, it is critical to use an adequate number of explants, technical replicates, and donor-matched control conditions to normalize the results of the experimental treatments when compiling data from multiple experiments (i.e., conducted using tissue from different donors) for statistical analysis.

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Infection of human tissues with human immunodeficiency virus (HIV) ex vivo provides a valuable 3D model of virus pathogenesis. Here, we describe a protocol to process and infect tissue specimens from human tonsils and female genital mucosae with HIV-1 and maintain them in culture at the liquid-air interface.

Ex-Vivo Infektion der lymphatischen Gewebe und weiblichen genitalen Schleimhaut mit Human Immunodeficiency Virus 1 und Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

Quantifizierung der Efferocytosis durch einzellige Fluoreszenz-Mikroskopie

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors (PRRs) such as the retinoic acid (RIG-I) like receptors (RLRs) RIG-I and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA-5) leads to the induction of the innate immune response. The formation and intracellular distribution of dsRNA in positive-sense RNA virus infection has been well characterized by microscopy. Many negative-sense RNA viruses, including some arenaviruses, trigger the innate immune response during infection. However, negative-sense RNA viruses were thought to produce low levels of dsRNA, which hinders the imaging study of PRR recognition of viral dsRNA. Additionally, infection experiments with highly pathogenic arenaviruses must be performed in high containment biosafety level facilities (BSL-4). The interaction between viral RNA and PRRs for highly pathogenic RNA virus is largely unknown due to the additional technical challenges that researchers need to face in the BSL-4 facilities. Recently, a monoclonal antibody (Mab) (clone 9D5) originally used for pan-enterovirus detection has been found to specifically detect dsRNA with a higher sensitivity than the traditional J2 or K1 anti-dsRNA antibodies. Herein, by utilizing the 9D5 antibody, we describe a confocal microscopy protocol that has been used successfully to visualize dsRNA, viral protein and PRR simultaneously in individual cells infected by arenavirus. The protocol is also suitable for imaging studies of dsRNA and PRR distribution in pathogenic arenavirus infected cells in BSL4 facilities.

Double-stranded RNA produced during RNA virus replication can be recognized by pattern recognition receptors to induce an innate immune response. For negative-sense RNA viruses, the interaction between the low-level dsRNA and PRRs remains unclear. We have developed a confocal microscopy method to visualize arenavirus dsRNA and PRR in individual cells.

Konfokale Abbildung von Double-Stranded RNA und Muster Anerkennung Rezeptoren im negativen Sinn-RNA-Virusinfektion

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...