Die Autoren bedanken sich alle Mitglieder der Dumenil Labor, insbesondere Silke Silva für das kritische Lesen des Manuskripts danken. Die chirurgische Abteilung im Hôpital Européen Georges Pompidou (HEGP), Dr. David Maladry. Michael Hivelin und Dr. Patrick Bruneval, Pathologie-Abteilung an HEGP. Die Tierhaltung in PARCC von Elizabeth Huc geleitet. Diese Arbeit wurde durch die folgenden Zuschuss Agenturen unterstützt: Marie-Curie-Stipendium IEF-Nr. 273.223 (KM), ATIP-Avenir Grant von INSERM, CODDIM Ausrüstung Zuschuss (Region Ile de France), FRM (Fondation pour la recherche médicale) Ausrüstung gewähren, die IBEID Laboratory der Exzellenz-Konsortium, ANR (Agence Nationale pour la Recherche) grant &quot; Bugs-in-flow &quot;. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung zur Veröffentlichung oder Vorbereitung des Manuskripts.

1. Risiken und Berechtigungen <ol><li> Lokale Ethik-Kommissionen müssen alle Tier Protokolle genehmigen. Dieses Protokoll wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien von den Französisch und europäischen Vorschriften für die Pflege und Verwendung von Labortieren (Décrets 87-848, 2001-464, 2001-486 und 2001-131 und etablierte durchgeführt EU-Richtlinie 2010/63/UE) und von der lokalen Ethikkommission Comité d&#39;en matière d&#39;Ethique Expérimentation Animale, Universite Paris Descartes, Paris, Frankreich zugelassen. No: CEEA34.GD.002.11. </li><li> Für die menschliche Haut, geschrieben wurde, informierte Patient Zustimmung erhalten und alle Verfahren wurden durchgeführt, nach Französisch nationalen Richtlinien und durch die lokale Ethikkommission, Comité d&#39;Bewertung Ethique de l&#39;INSERM IRB 00003888 00005881 FWA, Paris, Frankreich Stellungnahme zugelassen: 11-048 . </li><li> N. meningitidis ist ein potenziell schädlichen menschlichen Krankheitserreger und alle notwendigen Vorsichtsmaßnahmen bei der Handhabung der orga genommen werdennismus. Zu diesen Vorsichtsmaßnahmen gehören die Impfung und Arbeiten unter Biosafety Level 2 Bedingungen. </li></ol> 2. Skin Graft <ol><li> Sammeln der menschlichen Haut so nah wie möglich Pfropfen. Die Mehrheit der Haut in dieser Arbeit kommt von Schönheitsoperationen, die die Bauchbereich. Andere Quellen, wie Brust-, Bein-und sogar Fläche mit Erfolg verwendet worden. </li><li> Bereiten Sie die Probe menschlichen Haut durch die Reinigung der Hautoberfläche mit 70% EtOH und es flach liegend auf einem gut gereinigten Oberfläche, vorzugsweise unter einem Fluss Kapuze. </li><li> Schneiden 200-400 um Scheiben von der Spitze der Haut mit einem Dermatom mit vorgegebenen Dicke. </li><li> Überprüfen Sie die Haut Scheiben für Integrität und schneiden sie in 2 cm x 2 cm große Quadrate, dann in PBS (ohne zweiwertigen Kationen), wenn sie sofort oder bei 4 ° C in DMEM Pfropfen mit 10% Serum für die kurzfristige Lagerung (3-12 h ). </li><li> Betäuben 6-8 Wochen alten SCID.bg Mäuse (etwa 20 g) mit Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg) injeCTED ip </li><li> Sobald die Mäuse narkotisiert werden, überprüfen Sie die Schmerzreaktion durch Ausführen einer Zehe Prise, ein Standardverfahren zur Gründung Schmerzreflex. Gel auf die Augen, um ein Austrocknen zu verhindern Hornhaut und rasieren die linke Seite des Tieres hinter der Schulter, wo das Implantat platziert wird. Halten Sie die Maus warm an einem Heizkissen während des gesamten Verfahrens. </li><li> Nach prepping Maus für Chirurgie, reinigen Sie die rasierte Fläche mit 70% EtOH. </li><li> Anwenden lokaler Betäubung topisch auf die Transplantationsstelle (Tronothane) und bereiten die Transplantationsstelle durch vorsichtiges Entfernen der Oberflächenschicht der Haut von Mäusen mit einem Paar von gebogenen Schere. Achten Sie darauf, um die zugrunde liegende Gefäßsystem zu stören. </li><li> Haut in einem Bereich ein wenig kleiner als der Bereich der menschlichen Haut Scheibe zu entfernen. </li><li> Haut entfernen Scheibe von PBS (oder DMEM) und legen über Transplantatbett, Sicherstellung der epidermalen Seite nach oben zeigt. 2,8-2,10 Schritte sollten so schnell wie möglich durchgeführt werden, wodurch das Transplantat Bett nicht austrocknet. </li><li> Richten Sie eine Eckeoder Kante und fix mit Gewebekleber. Den Rest der Haut vorsichtig Scheibe passen, um das Transplantat Bett, indem kleine Mengen von Gewebekleber an den Rändern. Immer trimmen die menschliche Haut zu Größe eher als machen das Transplantat Bett größer. </li><li> Die Haut Ziehen Sie nicht zu fest auf das Transplantatbett, wie die Maus Haut ist sehr flexibel. </li><li> Stellen Sie sicher, dass das Transplantat wird mit Gewebekleber in jeder Ecke befestigt. </li><li> Reinigen Sie den Bereich mit einer Jod-Lösung. </li><li> Tragen Sie eine Band-Aid mit dem Polsterbereich über dem Transplantat. Stellen Sie sicher, dass die Band-Aid ist fest, aber nicht zu eng, und dass das Tier die Atmung nicht beeinträchtigt wird. </li><li> Befestigen Sie das Band-Aid mit Dressing Band. </li><li> Lassen Sie das Tier auf einer warmen Oberfläche zu erholen. </li><li> Einmal wach, bringen Sie das Tier in seinen Käfig. Tiere untergebracht sind 2-3 pro Käfig. </li><li> Überprüfen Sie regelmäßig Mäuse während der Wiederherstellung auf Anzeichen von Schmerzen oder Leiden. 10-14 Tage nach der Transplantation, entfernen Sie das Band-Aid, darauf achten, daß das Transplantat zu stören. Nach unserer Erfahrung ist die postoperative Schmerz minimal. Dennoch Tiere sollten jeden Tag vor allem in den Tagen nach der Operation überwacht werden. Kriterien für die Schmerzen oder Leiden sind die folgenden. <ul><li> Gewichtsverlust über 10% </li><li> Erscheinungsbild, Pelz, Bucklige Position, die Augen </li><li> Erhöhte Atmung oder Herzfrequenz </li><li> Verminderte oder ungewöhnliche Bewegungen. </li><li> Anstieg der Körpertemperatur </li><li> Wurden Anzeichen von Schmerzen festgestellt werden paracetamole oral verabreicht (300 mg / kg, alle 4 h). Humane Endpunkte werden streng auf, wenn die Schmerzen länger haften. </li></ul></li><li> Wenn das Transplantat trocken aussieht Babyöl gelten alle 2-3 Tage, um die Haut geschmeidig zu halten. </li><li> Das Transplantat ist bereit für Experimente 21 Tage nach Transplantats. </li></ol> 3. Infektion <ol><li> Der Tag vor der Infektion, bereiten Bakterienstamm durch Ausstreichen auf GCB-Agar-Platten mit entsprechenden Antibiotika. Wachsen über Nacht bei 37 ° C in 5% CO 2. </li><li> Bakterienpräparat <ol&gt; <li> Reinoculate Bakterien in 5 ml menschliches Endothel SFM-Medium mit 10% Serum bis zu einer OD 600 von 0,05. </li><li> Inkubiere unter Schütteln für 2 h im Brutschrank (37 ° C in 5% CO 2) mit losem Deckel, bis eine Bakteriendichte von ungefähr 0,1 OD 600. </li><li> Zentrifugieren Sie die Bakterien für 3 min 15.000 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Überstand entfernen und Resuspension in PBS, dann wieder zentrifugiert. </li><li> Wiederholen Sie den Waschschritt (2.2.4-2.2.5) zweimal. </li><li> Resuspendieren Bakterienpellet in PBS. </li><li> Messen OD 600. </li><li> Einen Kultur entweder OD 600 0,1 (10 8 CFU / ml) oder OD 600 1,0 (10 9 CFU / ml). Von diesem bekannten Konzentration verdünnen bis 10 7 CFU / ml. Versuchen Sie, Bakterien so nah an Einspritzzeit wie möglich vorzubereiten. </li></ol></li><li> Mäuse <ol><li> Wiegen Mäusen. </li><li> Mäuse anästhesiert mit Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg) injiziert ip </li><li> Einmal eingeschlafen, cTeufel, dass die Schmerzreaktion ist von einem Zehen Prise fehlt, halten die Mäuse warm mit einem Heizkissen und legte Augensalbe auf, um das Trocknen zu verhindern. </li><li> Geben Sie jedem Maus 8 mg Humantransferrin, in Kochsalzlösung oder PBS, ip injiziert </li><li> Nehmen Sie einen kleinen Tropfen Blut aus dem Schwanz und verteilt auf einer Agar-Platte, um zu überprüfen Blut ist steril vor der Infektion. </li><li> Injizieren von 100 &amp;mgr; l 10 7 CFU / ml Bakterienkultur (10 6 CFU gesamt) intravenös über die retroorbitale oder Schwanzvene. Messungen der CFU genommen 5 Minuten nach der Injektion sind konsistent, unabhängig von der Injektionsstelle. </li><li> Nach ein paar Minuten, schnipp das hintere Ende und breitete Blutprobe auf Agar-Platten mit entsprechenden Antibiotika mit einer 10-fachen Verdünnung, um den Blut CFU etablieren unmittelbar nach der Infektion. </li><li> Verschließen Sie den Schwanz mit Gewebekleber. </li><li> Nach der Injektion verdünnt das Bakterieninokulum und verteilt auf Agar-Platten mit entsprechenden Antibiotika zu CFU etablieren. </li><li> Lassen Sie den Mäusenauf einem Heizkissen erholen, bis sie nach oben und bewegt sich </li><li> Nach 6 Stunden nach der Infektion ziehen Sie eine kleine Menge Blut aus dem Schwanz, verdünnen und Platte CFU bei 6 h zu etablieren. </li><li> Alle Agar-Platten bei 37 ° C in 5% CO 2 über Nacht. </li></ol></li></ol> 4. Sacrifice <ol><li> Bei dem gewählten Zeitpunkt der Infektion, Mäuse anästhesiert mit Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg) injiziert ip </li><li> Einmal eingeschlafen, halten Sie die Maus warm mit einem Heizkissen. </li><li> Wenn der Schmerz-Reflex hat (toe-Pinch) gegangen, schnipp Ende des Schwanzes und ziehen Blut. </li><li> Verbreiten Sie Blut auf Agar-Platten mit entsprechenden Antibiotika; 5 ul direkte und 10 ul 1:10 Verdünnung zu CFU etablieren. </li><li> Sacrifice der Maus durch Genickbruch. </li><li> Nachdem dabei die Maus nach allen relevanten institutionellen und ethischen Richtlinien, bestätigen Tod durch Mangel an Herzschlag. Machen Sie eine Mittellinienschnitt, durch Brustkorb geschnitten und einen Einschnitt in der mündlichent. </li><li> Sammeln Sie so viel Blut wie möglich aus dem Herz / Brustraum und in einem sterilen Röhrchen. </li><li> Organen (z. B. Leber, Milz, Gehirn) zu entfernen, in einen sterilen Platte. </li><li> Entfernen Sie die Hauttransplantation und einen Teil der Haut von Mäusen in den sterilen Teller. </li><li> Entsorgen Sie die Maus Körper. </li><li> Nachdem das gesammelte Blut wurde für 15 min gerinnen, es Zentrifuge 15 min bei 3.000 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Entfernen von Plasma aus Blut und bei -80 ° C für spätere Analysen, zB zur Erkennung von Zytokin-ELISA oder FACS-basierten Methoden. </li></ol> 5. Orgel CFU Grafen <ol><li> Wiegen Homogenisieren Röhrchen mit 500 ul PBS jeweils vor der Einnahme von Biopsie-Proben. </li><li> Nehmen Sie 4 mm Biopsieproben aus jedem Gewebe mit einer sterilen Biopsie Punch. </li><li> Platz in Biopsien vorgewogen Homogenisieren Röhrchen mit 500 ul PBS. Homogenisieren Hautproben mit 2-mm-Perlen, verwenden kleinere Perlen für andere Organe. </li><li> Legen Sie die restlichen tFragen in 4% Paraformaldehyd (PFA) und bei 4 ° C für die Mikroskopie (siehe unten). </li><li> Wiegen Homogenisieren Röhrchen mit den Biopsien Biopsie Gewichtes (für die spätere Berechnung der KBE / mg Gewebe). </li><li> Proben homogenisieren. <ol><li> Homogenisieren Leber, Milz und Gehirn, bei 6.000 rpm für 30 sek. </li><li> Homogenisieren Hautproben bei 6.000 rpm für 30 sec und bei Bedarf wiederholen. </li></ol></li><li> Verbreiten Verdünnungen von jedem Homogenisieren Rohr auf Agarplatten und über Nacht wachsen bei 37 ° C in 5% CO 2 bis Organ Keimzahlen herzustellen. </li></ol> 6. Histologie / Immunhistochemie <ol><li> Fixierung <ol><li> Fix die Gewebe in 4% PFA über Nacht bei 4 ° C Die Fixierung Schritt kann mehr sein, wenn die Speicherung über längere Zeiträume legen die Gewebe in 0,25% PFA. </li><li> Spülen Sie die Gewebe in PBS und dann in 20% Saccharose-Lösung legen und zurück auf 4 ° C über Nacht oder bis der Gewebe in der Lösung versenkt. </li><li> In PBS waschen Gewebe, auf Größe geschnitten und in Oktober-Lösung (entweder in Form eines Gewebes oder einer Grundplatte geklebt). </li><li> Frieren schnell die Gewebe auf einer Petrischale schwimmend in flüssigem Stickstoff. </li><li> Nach dem Einfrieren setzen die Gewebe auf Trockeneis vor der Übertragung auf -80 ° C für die Lagerung. </li></ol></li><li> Slicing <ol><li> Gewebe entfernen von -80 ° C übergeführt und bei -20 ° C in einem Kryostaten äquilibrieren. </li><li> Scheibengewebe mit einer Dicke von etwa 10-15 um und setzen auf beschichtete Objektträger-Mikroskopie. </li><li> Speicher gleitet bei -20 ° C, bis sie benötigt. </li></ol></li><li> Die Färbung <ol><li> Lassen Sie Folien auf Raumtemperatur kommen. </li><li> Zeichnen Sie rund um die Scheibe auf der Folie mit einem hydrophoben Stift. Warten Sie 5-10 min. </li><li> Rehydrate / Wasch Scheibe in PBS für 5 min, zweimal wiederholen. </li><li> Permeabilisieren Scheibe in 0,1% Triton in PBS für 10 min. </li><li> In PBS 2-3x Waschen für 5 min. </li><li> Blockieren in PBS0,1% Triton 1% BSA für zwischen 10-60 Minuten, je nach den Antikörper oder Flecken verwendet werden. </li><li> Entfernen Blockierungspuffer und fügen primäre Antikörper verdünnt in Blockpuffer erforderlich. Inkubieren bestimmte Zeit. (Oft 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C). </li><li> In PBS 2-3x Waschen für 5 min. </li><li> Bewerben sekundären Antikörper gegebenenfalls in bock Puffer verdünnt; DAPI wird typischerweise in diesem Schritt enthalten. Inkubieren bestimmten Zeit, oft 1-2 Stunden Raumtemperatur in der Dunkelheit. </li><li> In PBS 2-3x Waschen für 5 min. </li><li> Berg in Fade Schutz Montage Medien mit einem Deckglas und Dichtung mit Nagellack. </li><li> Bild gefärbten Objektträger sofort oder bei 4 ° C </li><li> Führen Bildgebung mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskopie oder mit Filter / angemessen Fluorophore verwendeten Laser eingestellt. </li></ol></li><li> Histologie <ol><li> Die Objektträger verwendet für die Histologie auf Raumtemperatur kommen. </li><li> Stain Folien mit sotandard Hämatoxylin / Eosin-Färbung Protokoll. <ol><li> Legen Sie die Folien in der Folienträger. </li><li> Bringen Sie mit den Objektträgern zwischen den Lösungen in der folgenden Reihenfolge: </li><li> 2 Sek. in fließendem Leitungswasser. </li><li> 3 min in Hämatoxylinlösung gefiltert. </li><li> 10 Sek. in fließendem Wasser. </li><li> 10 Sek. in destilliertes Wasser. </li><li> 10 sec in 100% Ethanol. </li><li> 2 sec in Eosin gefiltert. </li><li> 10 Sek. in fließendem Wasser. </li><li> 10 sec in Ethanol 100% </li><li> 2 min in Xylol x 3 (Bad I, II, III). </li><li> Übertragen Sie sofort und fügen einige Tropfen Leim Fixierung auf jedes Rutschen, Platz Deckglas auf, entfernen Sie Luftblasen, trocknen lassen für ein paar Stunden. </li><li> Bild gleitet unter einem Standard-Weißlicht-Mikroskop. </li></ol></li></ol></li></ol>

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Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Tiermodelle sind für bakterielle Pathogenese Forschung von entscheidender Bedeutung. Es ist unmöglich, vollständig zu imitieren die in vivo-Umgebung, in der Zellkultur und es zeichnet sich ab, daß Wirt-Pathogen-Wechselwirkung wird durch viele dynamische Faktoren beeinflusst. Der menschliche Anwendbarkeit einiger klinisch wichtige Pathogene, wie N. meningitidis, HIV, HCV, Plasmodium falciparum, Listeria monocytogenes und Salmonella typhi ist die Verwendung von in-vivo-Modelle für diese Infektionen beschränkt. Allerdings, wie wir beginnen zu verstehen, welche Infektionsschritte werden in der Spezifität beteiligt, humanisierte Modelle entwickelt. Das hier beschriebene Protokoll ist ein Beweis dafür mit der Einführung des menschlichen Mikrogefäßen in Mäuse, was eine umfangreiche in vivo-Infektion mit N. meningitidis, was zu Gefäßschäden und gelegentlich die Entwicklung der Purpura Hautausschläge. Mit diesem ModellWir waren in der Lage zu bestimmen, dass die Klebeeigenschaften der TFP in Gefäßbesiedlung in vivo unter Verwendung von bakteriellen Mutanten und dass die Gefäßschäden in Abwesenheit der Adhäsion beteiligt 18 reduziert. Bisher haben die zirkulierende bakterielle Produkte in diesem Schaden in Verbindung gebracht, aber unsere Ergebnisse legen nahe, eine entscheidende Rolle für die lokale Adhäsion und Gefäß Kolonisation. Dies eröffnet neue Möglichkeiten für die Entwicklung neuer Behandlungsziele. Wenn Adhäsion von pathogenen Bakterien könnten pharmazeutisch blockiert werden es möglicherweise verhindern, könnte die Entwicklung von Hautläsionen und führen zu besseren Ergebnissen für die Meningokokken-Überlebenden in Bezug auf Gewebe Nekrose, Debridement und Amputationen. Die Arbeit hat auch die Komplexität der Infektion und die Beteiligung der Immunantwort und Gerinnungskaskade. Wir identifizierten humanen Zytokin-Signalisierung im Serum infizierter Mäuse trotz der relativ geringen Menge an menschlicher Endothel 18 vorhanden.Dies zeigte eine signifikante Reaktion Cytokin, zusammen mit der Infiltration von Mausimmunzellpopulationen in der Umgebung. Tiermodelle können natürlich nie vollständig menschlichen Krankheit zu replizieren und alle Ergebnisse erhielt von ihnen müssen in diesem Sinne angesehen werden. Zum Beispiel in diesem Modell das Blut und die zirkulierenden Zellen von Maus Herkunft, und wir können nicht ausschließen, dass sie unterschiedlich auf den menschlichen Zellen zu verhalten. Ein Vorteil davon jedoch, wie in unserer jüngsten Veröffentlichung 18 gezeigt, ist die Fähigkeit, Signal die aus menschlichen Endothel aus, dass der umlaufMausZellen zu differenzieren. Die immun Hintergrund der in diesem Modell verwendeten Mäuse würde auch für die allogene Übertragung von menschlichen Immunzellpopulationen zu ermöglichen, um eine weitere &#39;Humanisierung&#39; Aspekt. Die immun Hintergrund der Mäuse können jedoch Maske eine Rolle für die NK-, T-oder B-Zellen, die alle fehlen in diesem Modell oder defekt. Die relativ Short Zeitrahmen (24 h) in diesem Modell verwendet, betrifft vor allem die angeborene Reaktion, aber für längerfristige Infektionen und die Entwicklung der Immunität andere Optionen benötigen, erkundet zu werden. Die Haut ist ein wichtiger Infektionsstelle für N. meningitidis, aber mit einer relativ kleinen Menge an menschlichem Gefäße bedeutet auch, dass eine Extrapolation der Daten zu einer systemischen Infektion, die zahlreiche Organe ist schwierig. Während dieses Modell ermöglicht die Untersuchung von Haut Läsion Entwicklung, sind wichtige Schritte von Meningokokken-Infektion, wie Epithel-und Blut-Hirn-Überfahrt nicht inbegriffen. Die Weiterentwicklung dieser humanisierten Modellen benötigt wird, um diese anderen Aspekte der Infektion zu adressieren. Dennoch ist dieses Modell bietet ein großes Potenzial für zahlreiche Menschen spezifischen Krankheitserregern, insbesondere solcher, die auf die Blutgefäße.

Meningokokken-Sepsis ist eine häufig tödlich Blut geboren Infektion, die durch den bakteriellen Erreger Neisseria meningitidis verursacht. Meningokokken-Sepsis-Patienten oft mit Petechien oder Purpura auf ihrer Haut, die zuvor mit Gefäßzerstörung durch zirkulierende Bakterien und bakterielle Produkte 1 verursacht in Verbindung gebracht wurde Gegenwart. Hautbiopsien von Patienten zeigen klinische Bakterien mit Mikrogefäßen verbunden sind, oft füllt die Gefäße 2. Abgesehen von den Bakterien, ausgedehnten Thrombose, Gerinnung, Staus und Gefäß Leck in den Regionen Purpura 3-5 gesehen. Diese Gefäßschäden können zu ausgedehnten Nekrosen der Haut und der umgebenden Gewebe führen, was Debridement und sogar Amputation in Meningokokken-Überlebenden. Zu verstehen, wie diese Infektion verursacht Gefäßschäden ist wichtig, Prävention und Behandlungsstrategien zu optimieren. Der Großteil der Forschung auf Meningokokken-Sepsis wurde in vitro durchgeführt ammenschlichen Zelllinien aufgrund der Spezifität des menschlichen N. meningitidis. Viele Aspekte der Infektion wurden in vitro einschließlich bakterieller Adhäsion, Wirtszellantwort sowie Cytokinantwort 6-9 untersucht. Typ-IV-Pili (TFP) haben als Haupt Haftung für Organelle N. in Verbindung gebracht meningitidis sowohl Epithel-und Endothel-Zellen 10. Es wurde auch gefunden, daß die Haftung von N. gezeigten meningitidis an Wirtszellen ist Schubspannung abhängig und wird daher angenommen, um den Blutfluss Raten in der Mikrogefäß 11 bezogen werden. Dies legt nahe, die dynamischen Belastungen die Bakterien stellen in vivo sind entscheidend für die Pathogenese. Es ist jedoch sehr schwierig, die Mikroumgebung der kleinen Gefäße in vitro-Modell. Die Haftung Rezeptor für Neisseria TFP noch unbekannt und somit Knock-in Strategien zur bakteriellen Adhäsion in einem Tiermodell zu erzielen kann zu diesem Zeitpunkt nicht in Betracht gezogen werden. CD46 wurde vorgeschlagen, sein TFP-Rezeptor und transgenen Tieren produziert wurden als Maus-Modelle handeln. Allerdings bedeutet Infektion bei diesen Tieren nicht um umfangreiche Infektionen führen oder die Entwicklung 12,13 Ausschlag. Andere Tiermodelle, die für die Bakteriämie Aspekt der Neisseria-Infektion beschrieben wurden, berücksichtigen die bakterielle Vorliebe für menschliches Transferrin als Eisenquelle 14,15. Entweder Ergänzung menschliches Transferrin oder von einem Transgen zu einer erhöhten Bakterienlast im Blut über einen längeren Zeitraum zum Ausdruck, aber dieses Modell zeigt keine bakterielle Adhäsion oder Hautausschlag Entwicklung 16,17. In diesem Protokoll beschreiben wir einen humanisierten Mausmodell, in dem die menschliche Haut, einschließlich der dermalen Mikrogefäß, auf immungeschwächten Mäusen 18,19 transplantiert. Dies führt zu Funktions menschlichen Gefäße, mit der Maus Zirkulation durchblutet. In Kombination mit humanem Transferrin Ergänzung, diese modell letzteres mindestens zwei der menschlichen spezifische Aspekte N. meningitidis, dh menschlichen Endothel-und Humantransferrin, in einer in vivo Umgebung. N. meningitidis eingeführt intravenös in diesem Modell haften spezifisch für das menschliche Endothel Herstellung einer Pathologie, die ähnlich zu dem, was in der klinischen Patienten, einschließlich Gefäßschäden und Purpura Entwicklungs 18 angegeben ist.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="693">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">DMEM</td>
			<td style="width:161px;">Gibco Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">31885-023</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:161px;">Gibco Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10010-056</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ketamine 500</td>
			<td style="width:161px;">Virbac France&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">LOT N&#176;VAL4243</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Xylazine</td>
			<td rowspan="2" style="width:161px;">Bayer Healthcare</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">AMM N&#176; FR/8146715 2/1980</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">LOT N&#176; KPO809S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">(Rompun 2%)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:247px;">Optigel&#160;&#160;&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:161px;">Europhta</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">Medicament autoris&#233; N&#176;3400933521134</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Lacrigel&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Tronothane</td>
			<td style="width:161px;">Lisa Pharma</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" rowspan="2" style="height:40px;width:247px;">GC agar Base</td>
			<td rowspan="2" style="width:161px;">Conda</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">1106</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Human endothelium SFM media</td>
			<td style="width:161px;">Gibco Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11111</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:161px;">P A A</td>
			<td style="width:119px;">A15-101</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Human transferrin</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T3309</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">UEA lectin - rhodamine</td>
			<td style="width:161px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">RL-1062</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Hematoxylin</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H9627</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Eosin</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E4009&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Xylene</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">534056</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;"></td>
			<td style="width:161px;">Humeca BV, Holland</td>
			<td style="width:119px;">4.SB01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Equiptment Name</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalogue Number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Sober Hand Dermatome</td>
			<td style="width:161px;">Humeca BV, Holland</td>
			<td style="width:119px;">4.SB01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Animal housing</td>
			<td style="width:161px;">Innovive</td>
			<td style="width:119px;">M-BTM-C8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Biopsy punch (4 mm)</td>
			<td style="width:161px;">Dominic Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">30737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Fast-Prep lysing matrix M tubes</td>
			<td style="width:161px;">MP Bio</td>
			<td style="width:119px;">116923050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">MagNA Lyzer Green Beads</td>
			<td style="width:161px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">3358941001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">MagNA Lyzer</td>
			<td style="width:161px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">3358976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Vectashield mounting media</td>
			<td style="width:161px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Vetbond</td>
			<td style="width:161px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">1469SB</td>
			<td>Tissue Glue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">OCT tissue tek</td>
			<td style="width:161px;">Sakura</td>
			<td style="width:119px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

humanized mouse model to study bacterial infections targeting the microvasculature

Neisseria meningitidis verursacht eine schwere, oft tödliche Sepsis, wenn es den menschlichen Blutkreislauf gelangt. Die Infektion führt zu umfangreichen Schäden der Blutgefäße, was zu Gefäß Leck, der Entwicklung von Purpura Hautausschläge und eventuelle Gewebe Nekrose. Untersuchung der Pathogenese dieser Infektion wurde zuvor durch das menschliche Spezifität der Bakterien, die in-vivo-Modellen erschwert beschränkt. In diesem Protokoll beschreiben wir einen humanisierten Modell für diese Infektion in der die menschliche Haut, Hautmikrogefäße enthält, wird auf immungeschwächten Mäusen gepfropft. Diese Gefäße anastomosieren mit der Maus Zirkulation unter Wahrung ihrer menschlichen Eigenschaften. Einmal in diesem Modell, N. eingeführt meningitidis haften ausschließlich die menschlichen Gefäße, was zu umfangreichen Gefäßschäden, Entzündungen und in einigen Fällen die Entwicklung der Purpura. Dieses Protokoll beschreibt die Transplantation, Infektion und Auswertungsschritte dieses Modells in der context von N. meningitidis-Infektion. Die Technik kann zu zahlreichen Menschen spezifische Krankheitserreger, die in den Blutstrom zu infizieren angewendet werden.

Keimzahlen Der N. meningitidis-Stamm in dieser repräsentativen Ergebnisse verwendet, ist N. meningitidis 8013 Klon 12, eine Serogruppe C klinischen Isolat, Ausdruck einer Klasse-I-SB pilin, Opa -, OPC -, PilC1 + / + 20 PilC2. Der Stamm war so konstruiert, dass das grün fluoreszierende Protein (GFP) von einer chromosomalen Insertion 18 auszudrücken. Bakterienkolonie-Bildungseinheit Zählwerte durch Zählung der Anzahl der Kolonien auf den Agarplatten und Berechnen entweder CFU / ml Blut oder CFU / mg Gewebe aus den bekannten Volumina plattiert etabliert. Blutbild zeigte, dass 5 Minuten nach iv Injektion von 10 6 CFU Bakterien war ein Durchschnitt von 1,5 × 10 5 CFU / ml im Blut zirkuliert (Fig. 1A). Nach 6 Stunden die Zählungen im Durchschnitt 4,8 x 10 4 KBE / ml. Nach 24 Stunden waren die durchschnittlichen zählt 2,4 x 10 4 KBE / ml, aber in dieser Gruppe von 10 Mäusen, 5 hattekeine nachweisbaren zirkulierenden Bakterien, während die anderen 5 relativ hohe Zählungen (Fig. 1A). Keimzahlen von den Hautproben genommen zeigen die Mehrzahl der Mäuse mit erheblichen Zählungen in der menschlichen Haut, durchschnittlich 2,1 x 10 4 KbE / mg Gewebe in 6 h ​​und 4,4 × 10 2 KBE / mg Gewebe in 24 h (Fig. 1B) . Die kontralateralen Maus Hautproben zeigten keine Bakterienzahl bei 24 Stunden und nur einer sehr geringen Anzahl an 6 Stunden, was die starke Präferenz für N. meningitidis zu den menschlichen Gefäße in der transplantierten Haut (Abbildung 1B). Im Allgemeinen waren die Bakterienzahl in den anderen Organen abgetastet, obwohl 2 Tiere zeigen Zählungen, die eine Kontamination durch das Blut zugeschrieben werden können, wie sie mit hoher Umlaufbakterienzahlen (Abbildung 1C) korreliert tat ​​sehr niedrig nicht nachweisbar. Das Modell kann auch verwendet werden, um die Rolle von Virulenzfaktoren in vivo zu bestimmen, beispielsweise der Typ IV pili. Bakterienstämme mit definierten Mutationen im Gen PILD 21, was zu einem Stamm fehlt TFP sowie die pilC1-Gen 8, ohne die vorgeschlagene Tfp &quot;Adhäsin&quot; wurden in das Modell eingeführt. Diese Mutationen ergaben keine bakterielle Adhäsion im menschlichen Hauttransplantat und bestätigt die entscheidende Rolle spielen TFP Adhäsion in vivo (Fig. 1D). Immunhistochemie / Histologie In diesen Experimenten verwendeten wir N. meningitidis-Stämme, die grün fluoreszierendes Protein (GFP) exprimieren, um Fluoreszenzdetektion ohne sekundäre Färbung zu ermöglichen. Menschliche Gefäße wurden mit einem Marker für menschliche Endothel gefärbt, entweder CD31 (PECAM-1) oder das Lectin Ulex Europaeus Agglutinin (UEA) 18,22. Der UEA wurde Rhodamin konjugiert wodurch ein Färbungsschritt (Fig. 2A-C). Zellkerne können zu färbened mit DAPI zur Identifizierung Gewebestrukturen (Fig. 2A-B). Histologie wurde unter Verwendung eines Standard-Hämatoxylin / Eosin-Färbung. Die epidermalen / dermalen Grenze der Haut war deutlich erkennbar. Entzündungen, Thrombose und Gefäßleck wurden auf Schiffe in der Nähe dieser Grenze 24 Stunden nach der Infektion (Abbildung 2D) konzentriert. Thrombose war in mehreren kleinen Hautgefäße, die oft von Staus und Entzündungen einher sichtbar. Austritt von roten Blutkörperchen aus in das Gewebe sehen konnte, was auf eine weit reichende Gefäßschäden. Die Histopathologie der transplantierten Haut in nicht-infizierten Mäusen normal erschien ohne Entzündung zu unterscheiden 18. In etwa 30% der Infektionen bakteriellen Adhäsion in der Haut führt zur Entwicklung von makroskopisch nachweisbare Purpura (Fig. 2E und 2F). <img alt="Figur 1" fo:content-width=<html> &quot;5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51134/51134fig1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51134/51134fig1.jpg&quot; /&gt; Fig. 1 ist. CFU zählt. (A) Bakterienkeimzahlen pro ml Blut in 5 min, 6 h und 24 h nach Infektion. (B) Bakterielle CFU zählt von Hautproben Vergleich der menschlichen Haut (HS) und Maus-Haut (MS) sowohl bei 6 Stunden und 24 Stunden nach der Infektion. (C) Bakterienkeimzahl von anderen Organen aufgenommen 24 Stunden nach der Infektion. (D) Vergleich der Bakterienkeimzahlen aus Mensch und Maus Hautproben bei 24 Stunden nach der Infektion von Mäusen, die mit dem Wildtyp infizierten N. genommen meningitidis 2C43 Fleck (WT), einen Stamm mit einer Mutation in dem Gen PILD (PILD) oder einem Stamm mit einer Mutation in der pilC1-Gens (pilC1). Alle Diagramme werden als Rohdaten mit Median gezeigt. Abbildung von 18 Melican et al. Modifiziert&quot;_blank&quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Ansicht. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51134/51134fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51134/51134fig2.jpg" /> 2. Mikroskopie. (A) Projektion eines konfokalen Stapel, die einen menschlichen Mikrogefäß mit Lektin UEA (rot) in der Nähe der Haut (d) der Epidermis (e) Grenze gefärbt. Der Behälter wird mit infizierten N. meningitidis (grün) 2 h nach der Infektion. (B) Eine optische Scheibe und eine Scheibe Projektion (C) zeigt N. meningitidis Mikrokolonien (grün)-Infektion eine menschliche Gefäß (UEA - rot) in einer Hauttransplantation 2 Stunden nach der Infektion. (D) Hämatoxylin / Eosin-Färbung von menschlichen Hauttransplantation für 24 Stunden mit N. infiziert meningitidis. Der epidermale (e), ist dermalen (d) Grenze deutlich sichtbar und ausgedehnten Thrombose und Staus von microvessels (Pfeile) in der Dermis zu sehen. Entzündung und einige Vascular Leak (Pfeilspitze) kann auch identifiziert werden. (E) Die menschliche Haut Transplantat vor der Infektion. (F) Das gleiche Hauttransplantation als (E) 24 h nach Infektion mit N. meningitidis, die Purpura Regionen (Pfeile). 2B, 2D, 2E, 2F und werden von Melican et al. modifizierten 18 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51134/51134fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> .

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Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis ist ein Menschen bestimmten Erreger infiziert, die Blutgefäße. In diesem Protokoll menschlichen Mikrogefäße werden durch Pfropfen von der menschlichen Haut auf immungeschwächten Mäusen in eine Maus vorgestellt. Bakterien haften umfassend für die menschlichen Gefäße, was zu Gefäßschäden und die Entwicklung der Purpura typischerweise in menschlichen Fälle beobachtet.

Humanisierten Maus-Modell, um bakterielle Infektionen Studieren Targeting der Mikrogefäß

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

humanized-mouse-model-to-study-bacterial-infections-targeting

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.7K Aufrufe.  Paris Cardiovascular Research Centre.  Neisseria meningitidis ist ein Menschen bestimmten Erreger infiziert, die Blutgefäße. In diesem Protokoll menschlichen Mikrogefäße werden durch Pfropfen von der menschlichen Haut auf immungeschwächten Mäusen in eine Maus vorgestellt. Bakterien haften umfassend für die menschlichen Gefäße, was zu Gefäßschäden und die Entwicklung der Purpura typischerweise in menschlichen Fälle beobachtet. 

Serie: Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

Mit Luciferase to Image Bakterielle Infektionen bei Mäusen

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Introducing Schubspannung in der Studie der bakteriellen Adhäsion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

Small animal models such as mice have been extensively used to study human disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of information gained from these studies, the unique characteristics of mouse immunity as well as the species specificity of viral diseases such as human immunodeficiency virus (HIV) infection led to the development of humanized mouse models. The earlier models involved the use of C. B 17 scid/scid mice and the transplantation of human fetal thymus and fetal liver termed thy/liv (SCID-hu) 1, 2 or the adoptive transfer of human peripheral blood leukocytes (SCID-huPBL) 3. Both models were mainly utilized for the study of HIV infection.
One of the main limitations of both of these models was the lack of stable reconstitution of human immune cells in the periphery to make them a more physiologically relevant model to study HIV disease. To this end, the BLT humanized mouse model was developed. BLT stands for bone marrow/liver/thymus. In this model, 6 to 8 week old NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) immunocompromised mice receive the thy/liv implant as in the SCID-hu mouse model only to be followed by a second human hematopoietic stem cell transplant 4. The advantage of this system is the full reconstitution of the human immune system in the periphery. This model has been used to study HIV infection and latency 5-8.
We have generated a modified version of this model in which we use genetically modified human hematopoietic stem cells (hHSC) to construct the thy/liv implant followed by injection of transduced autologous hHSC 7, 9. This approach results in the generation of genetically modified lineages. More importantly, we adapted this system to examine the potential of generating functional cytotoxic T cells (CTL) expressing a melanoma specific T cell receptor. Using this model we were able to assess the functionality of our transgenic CTL utilizing live positron emission tomography (PET) imaging to determine tumor regression (9).
The goal of this protocol is to describe the process of generating these transgenic mice and assessing in vivo efficacy using live PET imaging. As a note, since we use human tissues and lentiviral vectors, our facilities conform to CDC NIH guidelines for Biosafety Level 2 (BSL2) with special precautions (BSL2+). In addition, the NSG mice are severely immunocompromised thus, their housing and maintenance must conform to the highest health standards (<a href="http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html" target="_blank">http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html</a>).

The generation and characterization of tumor specific T cells using humanized mice is described here. Human thymic tissue and genetically modified human hematopoietic stem cells are transplanted into immunocompromised mice. This results in the reconstitution of an engineered human immune system allowing for in vivo examination of anti-tumor immune responses.

Mit der BLT humanisierte Maus als Stem Cell based Gene Therapy Tumormodell

Small animal models such as mice have been extensively used to study human  disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of  ...

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of insects as infection models provides a valuable alternative. Compared to other non-vertebrate model hosts such as nematodes, insects have a relatively advanced system of antimicrobial defenses and are thus more likely to produce information relevant to the mammalian infection process. Like mammals, insects possess a complex innate immune system1. Cells in the hemolymph are capable of phagocytosing or encapsulating microbial invaders, and humoral responses include the inducible production of lysozyme and small antibacterial peptides2,3. In addition, analogies are found between the epithelial cells of insect larval midguts and intestinal cells of mammalian digestive systems. Finally, several basic components essential for the bacterial infection process such as cell adhesion, resistance to antimicrobial peptides, tissue degradation and adaptation to oxidative stress are likely to be important in both insects and mammals1. Thus, insects are polyvalent tools for the identification and characterization of microbial virulence factors involved in mammalian infections.
Larvae of the greater wax moth Galleria mellonella have been shown to provide a useful insight into the pathogenesis of a wide range of microbial infections including mammalian fungal (Fusarium oxysporum, Aspergillus fumigatus, Candida albicans) and bacterial pathogens, such as Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes or Enterococcus faecalis4-7. Regardless of the bacterial species, results obtained with Galleria larvae infected by direct injection through the cuticle consistently correlate with those of similar mammalian studies: bacterial strains that are attenuated in mammalian models demonstrate lower virulence in Galleria, and strains causing severe human infections are also highly virulent in the Galleria model8-11. Oral infection of Galleria is much less used and additional compounds, like specific toxins, are needed to reach mortality.
G. mellonella larvae present several technical advantages: they are relatively large (last instar larvae before pupation are about 2 cm long and weight 250 mg), thus enabling the injection of defined doses of bacteria; they can be reared at various temperatures (20 &deg;C to 30 &deg;C) and infection studies can be conducted between 15 &deg;C to above 37 &deg;C12,13, allowing experiments that mimic a mammalian environment. In addition, insect rearing is easy and relatively cheap. Infection of the larvae allows monitoring bacterial virulence by several means, including calculation of LD5014, measurement of bacterial survival15,16 and examination of the infection process17. Here, we describe the rearing of the insects, covering all life stages of G. mellonella. We provide a detailed protocol of infection by two routes of inoculation: oral and intra haemocoelic. The bacterial model used in this protocol is Bacillus cereus, a Gram positive pathogen implicated in gastrointestinal as well as in other severe local or systemic opportunistic infections18,19.

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

Oral and intra haemocolic infection of larvae of the greater wax moth Galleria mellonella is described. This insect can be used to study virulence factors of entomopathogenic as well as mammalian opportunistic bacteria. Rearing of the insects, methods of infection and examples of in vivo analysis are described.

Das Insekt<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Als leistungsfähiges Infektion Modell zur bakterielle Pathogenität Untersuchen

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

Eine experimentelle Modell zum Studium Tuberkulose-Koinfektion auf Natur Malaria Übertragung von Mycobacterium tuberculosis Und Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Generation und Multi-phänotypischen High-Content-Screening<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon-Mutanten

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In-vitro- und In-vivo-Modell, um die bakterielle Adhäsion an der Gefäßwand unter Strömungsbedingungen Studieren

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Menschliche Plazenta und Deziduale Organkulturen Infektionen zu studieren an der Maternal-fetale Schnittstelle

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of lipids. The function of lipids (e.g., in host-pathogen interactions or host entry) has been reported to play a crucial role in cellular processes. Here, we show a method to determine lipid composition, with a focus on the cholesterol level of primary blood-derived neutrophils, by HPTLC in comparison to high performance liquid chromatography (HPLC). The aim was to investigate the role of lipid/cholesterol alterations in the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NET release is known as a host defense mechanism to prevent pathogens from spreading within the host. Therefore, blood-derived human neutrophils were treated with methyl-&#946;-cyclodextrin (M&#946;CD) to induce lipid alterations in the cells. Using HPTLC and HPLC, we have shown that M&#946;CD treatment of the cells leads to lipid alterations associated with a significant reduction in the cholesterol content of the cell. At the same time, M&#946;CD treatment of the neutrophils led to the formation of NETs, as shown by immunofluorescence microscopy. In summary, here we present a detailed method to study lipid alterations in neutrophils and the formation of NETs.

Lipids are known to play an important role in cellular functions. Here, we describe a method to determine the lipid composition of neutrophils, with emphasis on the cholesterol level, by using both HPTLC and HPLC to gain a better understanding of the underlying mechanisms of neutrophil extracellular trap formation.

Methoden Lipidveränderungen in Neutrophilen und die anschließende Bildung von Neutrophilen Extracellular Traps zu studieren

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

The WinCF Model - An Inexpensive and Tractable Microcosm of a Mucus Plugged Bronchiole to Study the Microbiology of Lung Infections

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their mucus-plugged bronchioles create a favorable habitat for microbial colonization. Various pathogens thrive in this environment interacting with each other and driving many of the symptoms associated with CF disease. Like any microbial community, the chemical conditions of their habitat have a significant impact on the community structure and dynamics. For example, different microorganisms thrive in differing levels of oxygen or other solute concentrations. This is also true in the CF lung, where oxygen concentrations are believed to drive community physiology and structure. The methods described here are designed to mimic the lung environment and grow pathogens in a manner more similar to that from which they cause disease. Manipulation of the chemical surroundings of these microbes is then used to study how the chemistry of lung infections governs its microbial ecology. The method, called the WinCF system, is based on artificial sputum medium and narrow capillary tubes meant to provide an oxygen gradient similar to that which exists in mucus-plugged bronchioles. Manipulating chemical conditions, such as the media pH of the sputum or antibiotics pressure, allows for visualization of the microbiological differences in those samples using colored indicators, watching for gas or biofilm production, or extracting and sequencing the nucleic acid contents of each sample.

The mucus plugged airways of cystic fibrosis (CF) patients are an ideal environment for microbial pathogens to thrive. The manuscript describes a novel method for studying the CF lung microbiome in an environment that mimics where they cause disease and how alterations of chemical conditions can drive microbial dynamics.

Das WinCF-Modell - Ein preiswerter und tragbarer Mikrokosmos eines Schleims verstopfte Bronchiole zur Untersuchung der Mikrobiologie von Lungeninfektionen

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their ...