LWE und RK werden von der US National Institutes of Health Zuschüsse R37 NS033506-16 und R01-03 NS060699 unterstützt. MPT wurde von einem American Cancer Society Postdoctoral Research Fellowship (PF-10-057-01-MPC) unterstützt. Die Beratung und das Wissen von Dr. Matthew Lyman und Dr. Oren Kobiler waren maßgeblich an der Gestaltung des Mikroskops Konfiguration und Live Cell Imaging Verfahren. Wir verlängern auch dank Neal Barlow und Brian T. Kain von Nikon Instruments für ihre technische Unterstützung bei der Anschaffung, Installation und Performance des Mikroskops.

Abschnitt 1 - Environmental Control Bedingungen für die Live-Zelle Fluoreszenzmikroskopie <ol><li> 30 min vor jeder Imaging Experiment anschließen und beginnen Erwärmung des Mikroskops top Inkubator. <ol><li> Schalten Sie Mikroskop, Durchlicht und epifluoreszenten Lichtquellen und automatisierte Hardware-Bedienelemente. Öffnen Sie die Mikroskop-Software, NIS Elements, um das Mikroskop anschließen und beginnen Abkühlen der EM-CCD-Kamera. </li><li> Bringen Objektiv wärmer entsprechende Ziel (entweder 60X oder 100X Öl-Immersion). Hinweis: Wählen Sie Objektivlinse auf Experiment Typ. Die 100X Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) ist am besten für die Verfolgung von anterograde Transport virion Baugruppen während der Phase 60X Ziel geeignet ist, anterograden Ausbreitung visualisieren. Lower Vergrößerung, haben Nicht-Öl-Immersions-Objektive erfordern eine Linse wärmer als sie nicht machen direktem Kontakt mit der Probe. </li><li> Bringen Bühne top Inkubator auf den motorisierten Stufe mi<html> kop. Sicherstellen, dass die entsprechenden Einsatzes, halten sich die Probe im Ort wird. Befestigen Sie die befeuchtete Luft Linie aus dem Inkubator Kontrolle an den Eingangs-Port auf der Bühne oben Inkubator. </li><li> Schalten Sie Inkubator und Objektiv wärmer Kontrollen und Temperatur einstellen Einstellungen vorher überprüft spezifischen Bedingungen für die objektive und Probe abgebildet (siehe Diskussion). </li><li> Öffnen Sie das Regelventil auf dem 5% CO 2/95% atmosphärischen Tank zu CO 2 ergänzt Luft nach oben bieten Inkubator zu inszenieren. Die Strömungsgeschwindigkeit sollte zwischen 60 und 80 ml Gas pro Minute. Schnellere Preise werden in umfangreichen Probe Austrocknung trotz der Befeuchtungskammer führen. </li></ol></li><li> In Objektiv Öl Objektiv und sofort legen die Kultur, die in die Stufe oben Inkubator abgebildet werden. </li><li> Erlauben Äquilibrierung der Temperatur in der Kultur für ein Minimum von 10 min. Eine Stunde wird bevorzugt, vor allem für Übernachtung Bildgebung in Abschnitt 3 beschrieben. </li></ol>ve_title &quot;&gt; Abschnitt 2 - Echtzeit-Imaging von Anterograde Virion Transport Protocol Events <ol><li> Sechs bis acht Stunden vor der Bildgebung, infizieren 35 mm Deckglas-bottom Schale der reifen, distanzierte SCG Neuronen mit 1 x 10 6 Plaque-bildenden Einheiten des Virus von Interesse (siehe Tabelle 1 zB Viren) mit der Methode in Taylor et beschrieben al. 2012a 11. Wird die Prüfung mehr als ein Virus, off-set Impfungen von 30-60 min bis zum Abbilden von sequentiellen Proben zu ähnlichen Zeiten nach der Infektion zu ermöglichen. </li><li> Legen Gericht in die Stufe oben Inkubator für ein Minimum von 10 Minuten vor der Ausführung jedes Experiment. Während die Temperatur im Gleichgewicht, wird der Brennebene Verschiebung und wird sich negativ auf alle bildgebenden Experimenten. </li><li> Mit Durchlicht und dem Okular des Mikroskops, finden Sie einen neuronalen Zellkörper, die eine deutlich isoliert axonal Erweiterung. Alternativ verwenden Sie die entsprechende Fluoreszenz-Beleuchtung zu einer Zelle, die Detektoren findenTabelle Mengen von fluoreszierenden Proteinen. Es ist wichtig, um die Exposition der Probe Fluoreszenzbeleuchtung begrenzen, in diesem Schritt und die folgenden Schritte durch Licht induzierten Zellschäden und Bleichen von fluoreszierenden Proteinen. </li><li> Dämpfen Fluoreszenzbeleuchtung um die Intensität des Anregungslichts auf dem die Zellen ausgesetzt zu reduzieren. Engage Lichtdämpfungsmittel Neutral Density (ND)-Filter in der Fluoreszenz Beleuchtungslichtweg. Bei Filmen, die länger als 1 min, ein Minimum von ND4 muss verwendet werden, um Foto-Bleichen von fluoreszierenden Proteinen und umfangreiche Foto-Schäden der Axone zu verhindern. Stark fluoreszierende Strukturen können in der Regel visualisiert werden mit einem ND8-Filter im Ort. </li><li> Mit dem Mikroskop-Software (Abbildung 2 und Supplemental Film 1A), schalten Sie das Licht-Pfad zum EM-CCD-Kamera. </li><li> Bestimmen Sie optimale Bildgebung und-bedingungen für jeden Kanal Fluoreszenz. <ol><li> Starten Sie eine Live-Bild-Fenster mit dem &quot;Play&quot;-Taste. &lt;/ Li&gt; <li> Bestimmen Sie die optimalen Belichtungseinstellungen der Kamera für jeden fluoreszierenden Proteins. Nicht mehr als 300 ms pro Kanal als motional Aberrationen schnelllebigen virion Strukturen auftreten. Nutzen Sie die EM Verstärkung der Kamera auf eine Einstellung von 300 (Hersteller empfohlene maximale Verstärkung), um die Exposition zu minimieren und verbessern Erkennung von schwachen Signalen. Korrigieren Belichtungszeiten sollte einen Bild mit niedriger Intensität Hintergrund und hohe spezifische Signale. </li></ol></li><li> Nach dem Einstellen Expositionen und der Suche nach einem gut definierten Bereich des Axon, muss die Software konfiguriert ist, um automatisierte Bildaufnahme durchzuführen. Stoppen Sie den Live-Aufnahmen Fenster Probe zu verhindern Bleichen. <ol><li> In der NIS Elements-Software, wählen Sie die 6D - Definieren / Ausführen Experiment Anwendung aus der &quot;Applications&quot; Dropdown-Menü. </li><li> In der ND Erwerb Fenster klicken Sie auf die Registerkarte Zeit, die die Frequenz der Bildaufnahme bestimmen. Legen Sie die Interval auf &quot;Keine Verzögerung&quot; und die Dauer bis 5 min. The Software wird dann erwerben Bildrahmen bei der höchsten Frequenz möglich Dauer von 5 min. </li><li> Wählen Sie den &quot;Lambda&quot;-Reiter, die Auswahl der voreingestellten Hardware-Konfigurationen für mehrere fluoreszierende Bildaufnahme verwendet werden können. Klicken Sie auf das erste Feld und in der nachfolgenden Dropdown-Menü, um eine geeignete Hardware-Konfiguration wählen. Wiederholen Sie dies für alle fluoreszierenden Proteinen, die abgebildet werden. </li><li> Sicherstellen, dass die Tabs für &quot;XY Positionen&quot;, &quot;Z-Serie&quot; und &quot;Großes Bild&quot; sind abgewählt. </li><li> Über den Registerkarten wählen Sie das Kästchen mit der Aufschrift &quot;Save to File&quot;, um automatisch Bilder speichern auf der Festplatte während der Aufnahme. Konfigurieren Sie den Speicherort und den Dateinamen des Experiments Ausgabedatei. Als sequentielle Experimente durchgeführt werden, wird die Software eine sequentielle Zahl am Ende des bezeichneten Dateinamen hinzuzufügen. </li><li> Sobald alle Registerkarten ausgewählt wurden. Initiieren Sie das Experiment, indem Sie auf den &quot;Run-Now&quot;-Button. </li><li> Optimieren Sie die Bildaufnahmerate durch Belichtungseinstellungen und image Größe. Mit einem kleinen Bereich der bedruckbaren Bereich wird oft beschleunigen Rahmen Abtastraten. Definieren Sie die Region of Interest mit dem ROI-Tool in NIS-Elements, Auswählen eines Bereichs zwischen 25% und 50% des gesamten Bildbereich. Alternativ werden kürzere Belichtungszeiten erhöhen Rahmen Erfassungsraten, verringert aber die Qualität des Signals (siehe Diskussion). </li></ol></li></ol> Abschnitt 3 - Overnight Zeitraffer-Imaging von Anterograde Spread-Events <ol><li> Vier Stunden vor der Bildgebung, infizieren compartmentalized neuronalen Kultur auf einer 35 mm μ-Dish konstruiert. Impfen neuronalen Zellkörper mit 1 x 10 6 Plaque-bildenden Einheiten des Virus von Interesse (siehe Tabelle 1 zB Viren) mit der Methode in Taylor et al. 2012b 12. </li><li> Sanft legen Kulturschale in die Stufe oben Inkubator. Sicherstellen, dass die Position des Objektivs auf die Seite der Schale festgelegt ist. Langsam bringen das Ziel in den Mittelpunkt, ensurING das Ziel nicht Push-up in die Probe. Sobald der Fokus Feld identifiziert worden ist, bewegen sich langsam das Ziel in der Mitte der Schale, in der Nähe der inneren Barriere Demarkierung der Innenseite der Axon Fach. Während der Bewegung sicherzustellen, die Fokustiefe gehalten wird und vermeiden treibt in der Probe. Durchbiegung der Kunststoffoberfläche durch das Objektiv beschädigt die Axone und Kunststoff. </li><li> In etwa 2 ml warmem (~ 37 ° C) Phosphat-gepufferter Salzlösung in die Kulturschale außerhalb des Teflon-Ring. Diese umgibt den neuronalen Kultur mit einem Ring von PBS zu Probe Dehydratisierung zu minimieren und Wärmedämmung. </li><li> Erlauben Temperatur für mindestens 1 Stunde vor dem Einleiten ins Gleichgewicht automatisierte Bildaufnahme (3.8). Steps 3.5 durch 3.7 können während dieser Zeit konfiguriert werden. </li><li> Beschränken Sie die Intensität der Beleuchtung auf der niedrigst möglichen Ebene durch Einbeziehung aller Neutralfilter. Dies ermöglicht häufige Bildaufnahme over lange Zeiträume ohne übermäßige Foto-Schäden. Reduzierung Beleuchtung wird in Low-Signal führen, erfordern längere Belichtungszeiten (siehe Diskussion). </li><li> Verwenden historischen Belichtungseinstellungen oder vor dem Versuchsaufbau erzeugen eine parallel Gericht aus infizierten Epithelzellen exprimieren die Ziel-fluoreszierende Proteine ​​zu Belichtungseinstellungen zu etablieren, wie in Abschnitt 2.5 beschrieben. </li><li> Nach dem Einstellen Forderungen für die notwendigen Kanäle, ist es Zeit, um die Software für die automatisierte Bildaufnahme konfigurieren. Stoppen Sie den Live-Aufnahmen Fenster Probe begrenzen Bleichen. <ol><li> In Elements Software (Abbildung 2 und ergänzende Film 2), wählen Sie die 6D - Definieren / Ausführen Experiment Anwendung aus der &quot;Applications&quot; Dropdown-Menü, um das ND Acquisition Fenster. </li><li> In ND Acquisition-Fenster auf die Registerkarte Uhrzeit. Legen Sie die Interval auf &quot;5 min&quot;. Stellen Sie die Dauer auf 20 Stunden. Die Schlaufen Feld wird automatisch für die Anzahl der Wiederholungen der progra berechnet werdenm führt. </li><li> Wählen Sie den &quot;Lambda&quot;-Registerkarte. Klicken Sie auf das erste Feld und in der nachfolgenden Dropdown-Menü wählen Sie die entsprechende Lambda-Konfiguration für Phase Kontrast. Wiederholen für nachfolgende Positionen eine entsprechende Konfigurationen für jedes fluoreszierende Protein abzubildenden. </li><li> Wählen Sie das &quot;Große Bild&quot;-Registerkarte, die die Parameter von mehreren Bildern zu einem einzigen größeren Sichtfeld kombiniert werden bestimmt. Eine ziemlich große Gebiet besteht aus 5 x 2 Bildern mit einem 7% Nähte überlappen. Dies wird für die maximale Anzahl der Zellen pro Lage, ohne Auswirkungen auf die Häufigkeit der Bildaufnahme abgebildet werden können. Auch deaktivieren Sie das Kontrollkästchen für &quot;Close Active Shutter während Bühne Bewegung&quot;. Diese Option steigert die Geschwindigkeit der Übernahme durch Rollläden schließt nicht zwischen den Bildern. </li><li> Wählen Sie den &quot;XY Position&quot;-Registerkarte, um mehrere Positionen, die nacheinander in parallel werden im Laufe der Nacht Film wird abgebildet identifizieren. Wählen Sie Positionen, die das Zentrum po definierenint für jeden großen Bildbereich. Wählen Sie 6-8 Bild Positionen in der Probe. Ein gutes Bild, werden kleine Gruppen von Zellen in enger Apposition zu klar definierten Axone haben. Zellen sollten nicht auf der jeweils anderen und Axon Bündelung gestapelt werden sollte minimiert werden. Der Brennpunkt ist der Kern der Zelle. Positionieren des Ziels, so dass eine definierte Kernhülle für die Mehrheit der Zellen gesehen wird. </li><li> Sicherstellen, dass der &quot;Z-Serie&quot; Registerkarte abgewählt wird. </li><li> Konfigurieren Sie die Auto-Save-Funktion, wie oben beschrieben in Abschnitt 2.6.5. </li><li> Testen Sie die Belichtung und die Position Einstellungen durch Klicken auf &quot;1 Mal loop&quot;. Bewerten Sie die resultierenden Bilder für Durchlicht-Beleuchtung, Fokus und Rahmung. Wenn der Fokus verschoben hat, setzen Sie den Fokus für jede Position unter der Registerkarte XY. Warten Sie 10 min und wiederholen Sie diesen Schritt, bis Fokus ist stabil. </li><li> Nachdem alle Einstellungen überprüft und getestet wurde, starten Sie die automatische Experiment, indem Sie auf den &quot;Run Now&quot;-Button. </li></ol></li&gt; </ol> Abschnitt 4 - Bildverarbeitung und Export Data Export <ol><li> Datensätze während der Live-Cell-Imaging des Verkehrs oder Verbreitung Veranstaltungen erhalten sollten aus der NIS Elements-Software in gängige Dateitypen werden für die spätere Verwendung in Präsentationen und Publikationen (Supplemental Movie 3) exportiert. So exportieren Filme öffnen Sie das entsprechende Rohmaterial. Nd2 Datei in NIS Elements und wählen Sie die &quot;Split-Anteil&quot; im Hinblick auf die gewünschten Kanäle fluoreszierenden visualisieren. Wiedergabe der Datei mit einer geeigneten Geschwindigkeit; 5 Bildern pro Sekunde ist ein guter Ausgangspunkt für die Visualisierung der schnellen Transport. </li><li> Fügen Sie einen Zeitstempel, eine Echtzeituhr während der Filmwiedergabe zu vertreten. Auf das Bild mit der rechten Maustaste und wählen Sie, ND-Informationen hinzufügen. Ein digitaler Zähler wird in der oberen linken Ecke angezeigt. <ol><li> Bearbeiten Sie den Zeitstempel, um Informationen anzuzeigen. Rechts auf der Theke auf und wählen Sie Bearbeiten ND-Informationen. In der anschließenden Pop-up-Fenster, den Text bearbeiten, um die Phantasie widerspiegelnng Parameter, die wichtig sind. Bearbeiten Schriftart, Farbe und Größe für Klarheit. </li></ol></li><li> Zum Menü &quot;Bearbeiten&quot; und finden Sie &quot;Create view Momentaufnahme&quot; oder drücken Sie die &quot;x&quot;-Taste. Dieser Befehl öffnet die &quot;Ansicht Snapshot&quot;-Fenster. Wählen Sie &quot;Zu allen Frames anwenden&quot;, um eine 8-Bit-, RGB-, Export-ready-Datei mit den fluoreszierenden Kanäle aus dem gesamten Film zu erzeugen. </li><li> Speichern als. AVI-Datei für Cross-Plattform-Kompatibilität. Stellen Sie die Wiedergabe bei 200 ms pro Frame. Die. AVI-Dateien durch NIS Elements erzeugt wird, kann dann weiter mit anderen Konvertierungs-Software werden in den gewünschten Dateityp komprimiert. </li></ol>

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Wir haben nichts zu offenbaren.

Das Ziel des Live Cell Imaging beobachtet biologische Prozesse, wie sie ohne signifikante Veränderung durch den Akt der Beobachtung auftreten. Umwelt-Kontrolle, die Geschwindigkeit der Bildgebung und Fluoreszenz-Beleuchtung: Dieses Ziel wird durch die Optimierung der drei Variablen erreicht. Diese inter-abhängigen Variablen müssen ausgeglichen werden, um tragfähige Abbildungsbedingungen erreichen. Die Protokolle vorgestellt nutzen spezifischen Bedingungen, die repräsentative Ergebnisse zu produzieren. Wir werden ku...

Infektion des peripheren Nervensystems (PNS) durch alphaherpes Viren wie Herpes-simplex-Virus (HSV) -1, -2 und Pseudorabies-Virus (PRV) umfasst mehrere komplizierte und stark regulierten Schritte gesamten Lebenszyklus des Virus. Transport innerhalb der Neuronen des PNS ist kritisch während der Ereignisse der beiden primären Virusinfektion und anschließende inter-Host Verbreitung. Die molekularen Mechanismen, die beiden Komponenten des viralen Lebenszyklus modulieren; gerichteten Transport von viralen Baugruppen vom Zellkörper in Axonen (anterograde Transport) und die anschließende Übertragung der Virionen auf empfängliche Zellen (anterograde Spread) sind wichtig, um Verständnis Herpesvirus Pathogenese. Die Transport-und Austritt von Viruspartikeln in Neuronen ist abhängig von der Montage eines reifen infektiösen Virion 1,2. Vorher festgelegten Assays, einschließlich Immunfluoreszenz (IF) und Elektronenmikroskopie (EM), wurden verwendet, um die Teilchen Montagezustand und prot studierenEin Wechselwirkungen mit virion Transport und Ausbreitung 3-6 verbunden. Doch die dynamische Natur der Transport Virionen und experimentelle Artefakte durch chemische Fixierung führte die Interpretation der fixierten Bilder 7,8 verwechselt. In jüngster Zeit haben eine Reihe von viralen fluoreszierenden Fusionsproteine ​​für HSV und PRV, die geringe Auswirkungen auf die Protein-Funktion beschrieben worden. Green Fluorescent Protein (GFP) und Rot fluoreszierende Proteine ​​(mCherry oder mRFP) Fluorophore sind oft gepaart Bildgebung von zwei der drei strukturellen Komponenten eines reifen Virion erlauben: Kapsid, Spelzen, und Glykoprotein 9-11. Live Cell Imaging der anterograde Transport mit Dual-markierten Viren visualisiert die Montage Zustand der viralen Partikel während des Transports. Ähnliche Fluorophor Ausdruck Virusstämme werden verwendet, um Anzahl und die Vielfalt der viralen Genomen nach Ausbreitung 12,13 visualisieren. Die Eigenschaften der fluoreszierenden Proteine ​​(Bewertung in 14,15) stark beeinflussendie Fähigkeit, virale oder zelluläre Baugruppen visualisieren. Die intrinsischen Eigenschaften des fluoreszierenden Proteins, einschließlich Self-Interaktionen und Stabilität, sollten bei der Entwicklung und Erprobung neuer Protein-Fusionen für die Erhaltung der Wildtyp-Funktionalität werden. In Verbindung mit fluoreszierenden Protein-Fusionen, zwei in vitro-Zellkultur-Systeme gut charakterisiert sind für Live-Cell-Imaging von Herpes-Virus-Infektion eingesetzt: dissoziierten 16 und 17 Kompartimente (Abbildung 1A) Ratte überlegen Halsganglien (SCG) Neuronen. Bei beiden Systemen werden embryonale SCG seziert, dissoziiert einzigen Zellkörper und plattiertem zur in vitro Kultivierung von 18. SCG Neuronen sind Teil des vegetativen Nervensystems und kann leicht kultiviert und differenziert von neuronalen Wachstumsfaktor (NGF) zu einer reifen polarisierten Zustand ex vivo. Dissoziierte SCG Neuronen bilden ein ausgedehntes Netz von Axonen, die f erlaubtoder die Visualisierung von viralen Partikeln, wie sie anterograden transport 6 zu unterziehen. Unterteilte SCG Kulturen bieten fluidischen Trennung der neuronalen Zellkörper (S Abteil) und distalen Axon-Termini (N Abteil) 19. Eine Reihe von detaillierten Protokolle für den Bau und die Nutzung von compartmentalized Neuronen mit original 20 oder mutierend Campenot Kammern 17 wurden bereits veröffentlicht. Fluidic Isolierung ermöglicht selektive Infektion von neuronalen Zellkörper und den Nachweis von Nachkommenvirionen nach dem Transport zu isolierten Axon-Termini. Plating Epithelzellen über den Termini vor der Infektion bietet Rezipientenzellen für Ausbreitung der Virusinfektion. Es gibt viele wesentliche Elemente wichtig für alle Live Cell Imaging Experimente, aber die meisten für uns relevanten Protokolle sind: automatisierte Bildaufnahme, fluoreszierende Beleuchtung, die Geschwindigkeit der Bildgebung und Umweltkontrolle. Für alle bildgebenden Experimenten verwenden wireine invertierte, automatisierte Epifluoreszenz Beleuchtung Mikroskop (Abbildung 1B). Das Mikroskop ist rund um die Nikon Eclipse-Ti Basis gebaut und beschäftigt eine Reihe von Computer gesteuert motorisierten Systeme möglichst schnell rekonfiguriert das Mikroskop während automatisierte Bildaufnahme. Für Fluoreszenz-Beleuchtung, verwenden wir ein breites Spektrum Quecksilberbogenlampe, die gedämpft werden mit Neutralfilter entlang der Beleuchtungspfad können. Anregung Filter begrenzen das Spektrum der Fluoreszenz-Beleuchtung und wenn es mit Multi-Pass-dichroitischen Spiegel und Fluoreszenzemission Filter visualisieren spezifischen fluoreszierenden Verbindungen gepaart. Die Anregungs-und Emissions-Filter werden in unabhängigen, schnelles Umschalten Filter Räder montiert, um eine schnelle sequentielle Erwerb von verschiedenen fluoreszierenden Kanäle ermöglichen. Die Geschwindigkeit der Bildaufnahme ist ferner mit einer empfindlichen und schnellen EM-CCD-Kamera, nützlich für die Detektion von niedriger Signalstärke und kurze Bild Lesezeiten verbessert. Umweltkontrolle auf der MicroscOPE ist mit einer Bühne oben Wärmeschrank und eine Objektivlinse Heizgerät Proben bei erhöhten Temperaturen zu halten, während ein befeuchtet und CO 2 angereicherten Atmosphäre in den Inkubator geleitet wird erreicht. Das Mikroskop wird in einem abgedunkelten Raum mit Umgebungstemperatur gehalten knapp 25 ° C gehalten und Außenleuchte mit Verdunkelung an allen Fenstern minimiert. Die folgenden Protokolle beschreiben die Verwendung dieses Systems für anterograde Transport und Ausbreitung Assays. Eine Reihe von Alternativen gibt es für die Variablen des Live Cell Imaging steuern. Die Steuerung der Mikroskopie Einstellungen können manuell oder durch automatisierte Systeme abhängig von proprietärer Software durchgeführt werden. Fluoreszenz Beleuchtung kann mit Halogen-, LED-oder Laser-Quellen erreicht werden. Die Geschwindigkeit der Bildgebung durch die Geschwindigkeit der Filterwechsel und die Zeit, um das Signal mit dem gepaarten Detektionssystem sichtbar verändert. Umwelt-Steuerung kann mit spezialisierten Hardware auf dem Meilen erreicht werdenkroskop Stufe Gehäuse ganz oder teilweise von dem Mikroskop in einem erwärmten und befeuchteten Feld oder durch Erhöhen der Temperatur des Raumes, wo Mikroskopie durchgeführt wird. Jede dieser Alternativen hat Vor-und Nachteile in Bezug auf Kosten und Leistung. In der anschließenden Protokoll, detail wir den Einsatz von Live Cell Imaging, um eine schnelle anterograde Transport und anterograde Ausbreitung von Viren alphaherpes durch den Einsatz von rekombinanten Virusstämme zu studieren. Echtzeit-Live Cell Imaging visualisiert Kapsid, Spelzen, und / oder Glykoprotein Co-Lokalisation auf dynamische Strukturen unterziehen Transport innerhalb 11 Axone. Übernachtung Zeitraffer Bildgebung compartmentalized neuronalen Kulturen visualisiert axonal virion Austritt und Infektion empfänglicher Zellen 12. Die hier vorgestellten Protokolle sind für den Einsatz mit unseren speziellen Imaging-System optimiert worden, sind aber in groben Zügen in Bezug auf die vier Elemente des Live Cell Imaging präsentiert. In der Diskussion, die wirwird näher einige der Optimierung, die notwendig für eine erfolgreiche Experimente ist.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>35 mm glass bottom culture dish</td>
 <td>MatTek Corporation; Ashland, MA </td>
 <td>P35G-1.5-20-C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>35 mm &mu;-Dish </td>
 <td>Ibidi USA LLC, Verona, WI </td>
 <td>81156</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microscope body </td>
 <td>Nikon Instruments Inc. </td>
 <td>Nikon Eclipse Ti</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Motorized microscope X-Y stage</td>
 <td>Prior Scientific; Rockland, MA </td>
 <td>H117 ProScan Flat Top</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Motorized filter wheels</td>
 <td>Prior Scientific</td>
 <td>HF110 10 position filter wheel</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescent illumination source </td>
 <td>Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario Canada </td>
 <td>X-Cite 120Q </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Multi-band Fluorescence filter sets</td>
 <td>Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT</td>
 <td>89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry - ET</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EM-CCD camera</td>
 <td>Andor Technology USA; South Windsor, CT</td>
 <td>iXon3 897 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chamlide stage top environmental incubator</td>
 <td>Live Cell Instruments; Seoul, South Korea</td>
 <td>TC-L-10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Objective lens heater</td>
 <td>Bioptecs; Butler, PA</td>
 <td>150803 Controller 150819-12-08 Heater</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Analysis software</td>
 <td>Nikon Instruments Inc.; Melville, NY</td>
 <td>NIS Elements </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

live cell imaging of alphaherpes virus anterograde transport and spread

Advances in lebenden Zellen Fluoreszenzmikroskopie Techniken, sowie die Konstruktion von rekombinanten Virusstämme, die fluoreszierende Fusionsproteine ​​exprimieren haben Echtzeit-Visualisierung von Transport und die Ausbreitung von alphaherpes Virusinfektion von Neuronen aktiviert. Der Nutzen der neuen fluoreszierenden Fusionsproteine ​​Virusmembran, Spelzen und Kapside in Verbindung mit Live Cell Imaging, identifiziert Viruspartikel Baugruppen unterziehen Transport innerhalb Axone. Ähnliche Instrumente wurden erfolgreich für die Analyse von Zell-Zell von Viruspartikeln verbreitet, um die Anzahl und die Vielfalt der Virionen zwischen Zellen übertragen quantifizieren beschäftigt. Wichtig ist, produzieren die Techniken des Live Cell Imaging der anterograde Transport und Ausbreitung eine Fülle von Informationen, einschließlich Partikeltransport Geschwindigkeiten, Verteilungen von Partikeln und zeitliche Analysen von Protein-Lokalisierung. Neben den klassischen viralen genetischen Techniken haben diese Methoden kritische Einblicke bereitgestelltin wichtige mechanistische Fragen. In diesem Artikel beschreiben wir im Detail die bildgebenden Verfahren, die entwickelt, um grundlegende Fragen der alphaherpes Virus Transport und Ausbreitung zu beantworten waren.

Anterograde Transport Anwendung dieses Protokolls, um Infektionen von dissoziierten SCG Kulturen mit PRV 348 hat ein rekombinantes PRV-Stamm, die GFP-US9 und GM-mCherry Membranfusionsproteine, die Visualisierung der anterograde Transport von Virionen (Abbildung 3 und Supplemental Movie 4) erleichtert. Incorporation dieser Fusionsproteine ​​in virale Partikel zu deren Erkennung auf den Transport puncta und den genannten bildgebenden Bedingungen minimieren di...

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Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Live-Cell-Imaging von alphaherpes Virusinfektionen ermöglicht die Analyse der dynamischen Ereignisse gerichteten Transport und interzelluläre Ausbreitung. Hier präsentieren wir Methoden, die rekombinanten viralen Stämmen, fluoreszierende Fusionsproteine ​​Visualisierung der viralen Baugruppen während der Infektion von primären Neuronen erleichtern nutzen.

Live Cell Imaging von Alphaherpes Virus Anterograde Transport und Aufstrich

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.0K Aufrufe.  Montana State University. Live-Cell-Imaging von alphaherpes Virusinfektionen ermöglicht die Analyse der dynamischen Ereignisse gerichteten Transport und interzelluläre Ausbreitung. Hier präsentieren wir Methoden, die rekombinanten viralen Stämmen, fluoreszierende Fusionsproteine ​​Visualisierung der viralen Baugruppen während der Infektion von primären Neuronen erleichtern nutzen.

Serie: Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

Die Verwendung einer optischen Falle für das Studium der Wirt-Pathogen-Interaktionen für Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Live Cell Imaging von Bacillus subtilis Und Streptococcus pneumoniae Verwendung von Automated Zeitraffer-Mikroskopie

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

Echtzeit-Live-Imaging von T-Zell-Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrophilen-Isolierung und Analyse zur Bestimmung ihrer Rolle in der Lymphom-Zellempfindlichkeit therapeutische Mittel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNAs Targeting HIV-1-Produktion für den Einsatz in Gene oder Arzneimitteltherapie

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. Two-photon intravital microscopy (2P-IVM) allows the observation of cell interactions in deep tissue in living animals, while minimizing the photobleaching generated during image acquisition. To date, different models for 2P-IVM of lymphoid and non-lymphoid organs have been described. However, imaging of respiratory organs remains a challenge due to the movement associated with the breathing cycle of the animal.
Here, we describe a protocol to visualize in vivo immune cell interactions in the trachea of mice infected with influenza virus using 2P-IVM. To this purpose, we developed a custom imaging platform, which included the surgical exposure and intubation of the trachea, followed by the acquisition of dynamic images of neutrophils and dendritic cells (DC) in the mucosal epithelium. Additionally, we detailed the steps needed to perform influenza intranasal infection and flow cytometric analysis of immune cells in the trachea. Finally, we analyzed neutrophil and DC motility as well as their interactions during the course of a movie. This protocol allows for the generation of stable and bright 4D images necessary for the assessment of cell-cell interactions in the trachea.

In this study, we present a protocol to perform two-photon intravital imaging and cell interaction analysis in the murine tracheal mucosa after infection with influenza virus. This protocol will be relevant for researchers studying immune cell dynamics during respiratory infections.

Bildgebung Zelle Interaktion in Trachealen Schleimhaut während der Influenza-Virus-Infektion mit Intravitalen zwei-Photonen-Mikroskopie

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

In Vitro ELISA-Test zur Bewertung der Wirksamkeit von Tollwut-Impfstoffen

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, studying IAV requires the use of laborious secondary approaches to detect the presence of the virus in infected cells and/or in animal models of infection. This limitation has been recently circumvented with the generation of recombinant IAVs expressing easily traceable fluorescent or bioluminescent (luciferase) reporter proteins. However, researchers have been forced to select fluorescent or luciferase reporter genes due to the restricted capacity of the IAV genome for including foreign sequences. To overcome this limitation, we have generated a recombinant replication-competent bi-reporter IAV (BIRFLU) stably expressing both a fluorescent and a luciferase reporter gene to easily track IAV infections in vitro and in vivo. To this end, the viral non-structural (NS) and hemagglutinin (HA) viral segments of influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) were modified to encode the fluorescent Venus and the bioluminescent Nanoluc luciferase proteins, respectively. Here, we describe the use of BIRFLU in a mouse model of IAV infection and the detection of both reporter genes using an in vivo imaging system. Notably, we have observed a good correlation between the expressions of both reporters and viral replication. The combination of cutting-edge techniques in molecular biology, animal research and imaging technologies, provides researchers the unique opportunity to use this tool for influenza research, including the study of virus-host interactions and dynamics of viral infections. Importantly, the feasibility to genetically alter the viral genome to express two foreign genes from different viral segments opens up opportunities to use this approach for: (i) the development of novel IAV vaccines, (ii) the generation of recombinant IAVs that can be used as vaccine vectors for the treatment of other human pathogen infections.

Influenza A viruses (IAVs) are contagious respiratory pathogens that cause annual epidemics and occasional pandemics. Here, we describe a protocol to track viral infections in vivo using a novel recombinant luciferase and fluorescence-expressing bi-reporter IAV (BIRFLU). This approach provides researchers with an excellent tool to study IAV in vivo.

Ein luziferasefluoreszierendes Reporter-Influenzavirus zur Live-Bildgebung und Quantifizierung von Virusinfektionen

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, ...

Intravital Widefield Fluorescence Microscopy of Pulmonary Microcirculation in Experimental Acute Lung Injury Using a Vacuum-Stabilized Imaging System

Intravital imaging of leukocyte-endothelial interactions offers valuable insights into immune-mediated disease in live animals. The study of acute lung injury (ALI)/acute respiratory distress syndrome (ARDS) and other respiratory pathologies in vivo is difficult due to the limited accessibility and inherent motion artifacts of the lungs. Nonetheless, various approaches have been developed to overcome these challenges. This protocol describes a method for intravital fluorescence microscopy to study real-time leukocyte-endothelial interactions in the pulmonary microcirculation in an experimental model of ALI. An in vivo lung imaging system and 3-D printed intravital microscopy platform are used to secure the anesthetized mouse and stabilize the lung while minimizing confounding lung injury. Following preparation, widefield fluorescence microscopy is used to study leukocyte adhesion, leukocyte rolling, and capillary function. While the protocol presented here focuses on imaging in an acute model of inflammatory lung disease, it may also be adapted to study other pathological and physiological processes in the lung.

Intravital fluorescence microscopy can be utilized to study leukocyte-endothelial interactions and capillary perfusion in real-time. This protocol describes methods to image and quantify these parameters in the pulmonary microcirculation using a vacuum-stabilized lung imaging system.

Intravitale Weitfeldfluoreszenzmikroskopie der pulmonalen Mikrozirkulation bei experimenteller akuter Lungenschädigung mit einem vakuumstabilisierten Bildgebungssystem

Intravital imaging of leukocyte-endothelial interactions offers valuable insights into immune-mediated disease in live animals. The study of acute lung ...

Echtzeit-Live-Bildgebung der Regeneration der submandibulären Drüse der Maus

Interrogating Cell-Cell Interactions in the Salivary Gland via Ex Vivo Live Cell Imaging

Salivary gland regeneration is a complex process involving intricate interactions among various cell types. Recent studies have shed light on the pivotal role played by macrophages in driving the regenerative response. However, our understanding of this critical role has primarily relied on static views obtained from fixed tissue biopsies. To overcome this limitation and gain insights into these interactions in real time, this study outlines a comprehensive protocol for culturing salivary gland tissue ex vivo and capturing live images of cell migration.
The protocol involves several key steps: First, mouse submandibular salivary gland tissue is carefully sliced using a vibratome and then cultured at an air-liquid interface. These slices can be intentionally injured, for instance, through exposure to radiation, to induce cellular damage and trigger the regenerative response. To track specific cells of interest, they can be endogenously labeled, such as by utilizing salivary gland tissue collected from genetically modified mice where a particular protein is marked with green fluorescent protein (GFP). Alternatively, fluorescently-conjugated antibodies can be employed to stain cells expressing specific cell surface markers of interest. Once prepared, the salivary gland slices are subjected to live imaging using a high-content confocal imaging system over a duration of 12 h, with images captured at 15 min intervals. The resulting images are then compiled to create a movie, which can subsequently be analyzed to extract valuable cell behavior parameters. This innovative method provides researchers with a powerful tool to investigate and better understand macrophage interactions within the salivary gland following injury, thereby advancing our knowledge of the regenerative processes at play in this dynamic biological context.

Autor im Rampenlicht: Untersuchung von Makrophagen-Epithelzell-Interaktionen bei der Regeneration von Speicheldrüsen nach Verletzungen 

Immunofluorescent imaging is constrained by the ability to observe complex, time-dependent biological processes in just a single snapshot in time. This study outlines a live-imaging approach conducted on precision-cut mouse submandibular gland slices. This approach allows for the real-time observation of cell-cell interactions during homeostasis and the processes of regeneration and repair.

Untersuchung von Zell-Zell-Interaktionen in der Speicheldrüse mittels ex vivo Lebendzell-Bildgebung

Salivary gland regeneration is a complex process involving intricate interactions among various cell types. Recent studies have shed light on the pivotal ...