Wir danken SIGA Technologies (Corvallis, OR) für die Bereitstellung von ST-246. DKR wurde durch ein NIH Ausbildungsförderung in der Immunologie an der Universität Boston (5T32AI 7309) unterstützt. Diese Arbeit wurde zum Teil von P41 086180 unterstützt, NIH RO1AI1096159-01 und RO3 (bis JHC).

1. Platte Cells <ol><li> Distanzieren HeLa-Zellen von der Platte und in Wachstumsmedium (DMEM, 2 mM L-glut, 10% FBS) zu verdünnen, um etwa 2,0 x 10 5 Zellen / ml. Pipettieren von 100 ul / Vertiefung in einem schwarzen Wänden, klare Flachboden-96-Well-Platte (20.000 Zellen / Vertiefung). </li><li> Zellen für 24 Stunden inkubieren, bis Konfluenz in einer 37 ° C-Inkubator + 5% CO 2. </li></ol> 2. Zellen infizieren <ol><li> Verdünnen Virus und Zellen infizieren. <ol><li> Tauwetter TRPV (Dreibett-Virus, Früh Venus, Intermediate mCherry, Spät TagBFP) und PLV (Promoter-less Venus) Fluoreszenz-Virus und zerlegen mit Beschallung für 5 Minuten. Alternativ können rohen Virusvorräte mit 0,25 mg / ml Trypsin in Infektionsmedium gemischt 1:1 und bei 37 ° C für 30 min inkubiert. </li><li> Verdünnen rohen Virusvorräte in 37 °-C-Infektion Medien (DMEM, 2 mM L-glut, 2% FBS). Bei hohen MOI-Infektionen (10 PFU / Zelle), verdünnte Virus Lager bis 1,0 x 10 7 PFU / ml unter der Annahme, 5 x 10 4Zellen / Vertiefung und ein Inokulum von 50 ul. Plan zu infizieren 3 Wiederholungsvertiefungen für jede Behandlung mit TRPV und weitere 3 Wiederholungsvertiefungen für die gleiche Behandlung mit PLV auf Hintergrundfluoreszenz spezifisch für jede Behandlung zu berücksichtigen. </li><li> Infizieren Vertiefungen durch Zugabe von 50 &amp;mgr; l / Vertiefung verdünnt Virus in Infektionsmedium. Dies wird als Zeit = 0 h nach Infektion (hpi 0) definiert. </li></ol></li><li> Verdünnen gewünschten Behandlungs Verbindungen in Infektion Medien. Für alle Behandlungen sollte eine einzige Master-Mix 2x Verdünnung hergestellt werden und auf Brunnen (z. B. 350 ul Gesamtvolumen von sechs 96-Brunnen mit jeweils 50 ul) zu replizieren. <ol><li> Verdünnen experimentelle Infektion Verbindungen in Medien. </li><li> Verdünnen Fahrzeug-Steuer Lösungsmittel (zB PBS, DMSO) in Infektions Medien. Hinweis: Ähnliche Endkonzentrationen von Fahrzeug-Steuerlösemittel sollten wie für experimentelle Verbindungen (z. B. angewendet werden, wenn Ihr IBT Lager ist mit DMSO hergestellt und in einem abschließenden concentratio verwendetns von 1 ul / ml, dann mit DMSO allein bei 1 ul / ml auf der Fahrzeugsteuerung). </li><li> Verdünnen Steuer Verbindungen in Infektion Medien. Empfohlene Kontrollverbindungen umfassen: 3,6 um (1 ug / ml) 1-β-D-arabinofuranosylcytosin (AraC), 50 uM (11,7 ug / ml) β-thiosemicarbazon Isatin (IBT), 60 uM (50 ug / ml) Rifampicin, oder 5 &amp;mgr; m (1,9 &amp;mgr; g / ml) ST-246 8,15,16. Siehe Repräsentative Ergebnisse für die erwarteten Effekte. Hinweis: machen diese Verdünnung zu zweimal (2x) der gewünschten Endkonzentration da diese im Verhältnis 1:1 auf das Volumen bereits in die Vertiefung gegeben. </li></ol></li><li> Unmittelbar nach Zugabe des Virus, 50 &amp;mgr; l Medium, das gewünschte Infektion Behandlungen und Kontrollen wie in Schritt 2.2 verdünnt. Hinweis: Um für die Hemmung vor frühzeitig Ausdruck zu testen, Verbindung (en) kann entweder direkt zu der verdünnten Virusinokulum (Schritt 2.1.2) oder hinzugefügt werden, um Zellen vor der Infektion zu hosten (vor Schritt 2.1.3). </li><li> Inkubieren 24.06 h in einem 37 &amp; #176; + C-Inkubator mit 5% CO 2. </li></ol> 3. Fix Cells <ol><li> Fix Zellen durch Zugabe von 100 ul 8% Para für Infektionen Medien bereits in jedes Well. Inkubation bei Raumtemperatur für 15 min vor Licht geschützt. Hinweis: Es wird empfohlen, 2x PFA (8%), die direkt auf eine Infektion Medien zu Vernebelung von Infektions Vaccinia die auftreten können, zu vermeiden, wenn mit hohem Titer Medien direkt in die Abfallschale vor der Fixierung invertiert. </li><li> Entfernen Fixiermittel durch Umdrehen der Platte in den Abfall Gericht. </li><li> 100 l Raumtemperatur PBS. </li><li> Dichtungsplatte mit optisch klare Klebstoff-Film. Hinweis: Die Platten können bei 4 ° C gelagert werden, wenn nicht sofort gelesen werden. Achten Sie darauf, versiegelten Platten auf Raumtemperatur vor dem Lesen, um Kondensation zu verzerren Spektralphotometer Messungen verhindern zurückzukehren. </li></ol> 4. Quantifizierung Virus Wachstum <ol><li> Messen Endpunkt Fluoreszenz bei 515:530 für Venus, 587:610 für mCherry und 415:457 foder TagBFP (Anregung: Emissionswellenlänge in nm). Vier Messungen sollten pro Vertiefung mit optimierten Verstärkungseinstellungen für jeden Kanal gemittelt werden. Hinweis: Die entsprechenden Emissionswellenlänge kann je nach Modell und Filtereigenschaften des Plattenlesegerät. Dies kann empirisch durch die Durchführung einer Emissionswellenlängen-Scan, um den Punkt, wo es den größten Unterschied zwischen TRPV und PLV für jeden Kanal bestimmen, bestimmt werden. </li><li> Normalisieren Sie die Rohdaten zum Vergleich zwischen den Experimenten zu erleichtern. <ol><li> Für jeden Kanal die mittlere von Wiederholungs TRPV und PLV Brunnen. </li><li> Subtrahieren Sie die Mittel PLV-infizierten Hintergrundmessungen aus den Mittel TRPV-infizierten experimentellen Messungen für jede Behandlung. </li><li> Normalisieren Sie die Daten, indem jede Hintergrund subtrahiert Wert vom Fahrzeug-only-Wert auch. </li><li> Sobald ein Experiment wurde mehrmals, eine Einweg-Varianzanalyse (one-way ANOVA) Test-und Mehrfach c wiederholtERGLEICH Post-Test durchgeführt, um zu bestimmen, ob jede der Behandlungen zeigt einen statistisch signifikanten Unterschied von der Fahrzeug einzige Behandlung für jeden Kanal werden. </li></ol></li></ol> . 5 Alternative Protokoll: Kinetic Plattentests <ol><li> Führen Sie alle Schritte durch Zugabe von Behandlungen (Schritt 2.3). </li><li> Seal Platte mit Haftklebefolie abdecken und in Plattenleseraum auf 37 ° C ins Gleichgewicht Hinweis: Besondere Sorgfalt ist auf Platten bei 37 ° C konstant zu halten, um übermäßige Zellstress und Kondensation zu verhindern. Kinetischen Assays ist es besonders wichtig, einen gepufferten Medium (Natriumbicarbonat und HEPES), um richtigen pH ohne Zusatz von 5% CO 2 erhalten. </li><li> Set-Plattenlesegerät manuell zu gewinnen, um die Sättigung des späteren Zeitpunkten zu verhindern. Anmerkung: Die genaue Verstärkungsoptimierung kann durch Durchführen einer Endpunkt-Assays unter ähnlichen Bedingungen erhalten werden. </li><li> Erwerben Stundenwerte für 8-24 hpi und normalisieren mit ähnlar Verfahren wie in Endpunkt-Assay (Schritt 4.2). </li><li> Individuelle Zeitpunkte für die statistische Signifikanz unter Verwendung ähnlicher Verfahren wie das zuvor beschriebene Endpunkt-Assay analysiert werden. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren und keine Patente auf Viren oder Screening-Verfahren anhängig.

Hier haben wir den praktischen Einsatz eines mehrstufigen Vaccinia-Reportervirus (TRPV), die reproduzierbar ist, Echtzeit-Feedback Maßnahmen der Virusreplikation liefert beschrieben. Durch die Verwendung von gut definierten Pockenvirus-Inhibitoren, konnten wir zeigen, dass TRPV reagiert in einer Weise, die mit dem Wirkmechanismus verstanden, für jeden Inhibitor. Während die TRPV Virus bietet die umfassendsten Informationen über Viren Bühne Progression, zweistufig (IREV, LREV) und einstufigen (EV, IV, LV)-Viren kön...

Traditionell wird Virus-Expressions mit molekularbiologischen Techniken (zB Northern Blot, Western Blot, Microarray-Hybridisierung, etc.) 1 untersucht. Diese Verfahren sind in der Lage, detaillierte Informationen in Bezug auf die Kategorisierung Expressionsänderungen der einzelnen mRNAs bzw. Proteine, sind sie typischerweise nicht zugänglich Echtzeit-und Hochdurchsatzverfahren. Alternative Ansätze mit Fluoreszenz-basierten Reporter haben bisher bei der Arbeit mit Pockenviren angewandt worden; hat jedoch ihre Entwicklung und Nutzung durch abwechslungsreiche Ziele motiviert. Mehrere solche Verfahren wurden zur Selektion von rekombinanten Viren 2,3 entwickelt. Diese Techniken auszudrücken EGFP auf ordnungsgemäße Einbau und die Expression von exogener DNA aus rekombinanten Vaccinia-Klonen. Ebenso mehrere Vacciniastämme stabil exprimieren EGFP löslich oder GFP-markierten Proteine ​​unter einer nativen Vaccinia-Promotor exprimiert sind weit verbreitet. Diese sind typ.tisch verwendet werden, um das Eindringen von Viren und die Replikation während Antikörper-basierten Neutralisationstests, chemische Hemmung oder Vergleich der antiviralen Wirksamkeit 4-6 quantifizieren. Obwohl diese Viren nützlich erwiesen haben, sind sie in ihrer Fähigkeit, Informationen über den Punkt der Inhibition durch ihre Nutzung eines einzelnen mehrdeutigen frühen / späten viralen Promotor bereitzustellen begrenzt. Bisherige Verfahren haben auch die Verwendung von EGFP Protein gemacht mit suboptimalen Signal-zu-Rauscheigenschaften. Aufgrund der Komplexität des Pockenvirus-Replikation und der Mangel an vorhandenen Werkzeugen zur Verfügung, um Echtzeit-Änderungen in der viralen Genexpression zu untersuchen, haben wir eine Reihe von Einzel-und Mehrstufen-Reporter Viren 7,8 entwickelt. Wie bereits in früheren Veröffentlichungen beschrieben, diese Viren Ausdruck ein, zwei, oder drei spektral unterschiedlichen fluoreszierenden Proteinen aus nativen Vaccinia-Promotoren in der frühen, mittleren oder späten Stadien der Infektion. Diese Viren können unsed als Indikatoren für die Virusreplikation Fortschritte mit einem Fluoreszenzmikroskop und die sie für Hochdurchsatz-Platte-basierte Assays Leser gleich gut geeignet sind. Diese Viren sind einfach anstelle des Wildtyp-Virus verwenden, wachsen mit ähnlichen Kinetik gleichwertige Titer 7 zu erreichen. Bei der Planung und Erstellung dieser Viren wurde viel Sorgfalt bei der Auswahl der Fluorophore, die hohen Signal-zu-Hintergrund-Merkmale mit überlegener Effizienz Klapp müssen zuverlässige Quantifizierung mit schneller Rückmeldung an Veränderungen in der Expression (Venus, mCherry und TagBFP) Erleichterung aufgenommen. Zusätzlich Kombinationen von viralen Promotoren wurden ausgewählt, die eine hohe Wiedergabetreue, eindeutige Phase-spezifische Expression, die Bereitstellung von Informationen über das gesamte Spektrum der früh (C11R-Promotor), Mittelstufe (G8R Promotor) und späten (F17R Promotor) Genexpression zu produzieren, im Gegensatz zu zweideutig frühen / späten Veranstalter. Diese Viren können als ein Werkzeug verwendet werden, für investigating den Lebenszyklus des prototypischen Pockenvirus, Vaccinia-Virus. Vieles ist noch nicht bekannt über die Wirt-Virus-Interaktion trotz seiner langen Geschichte der Studie. Vaccinia ist komplex, produziert mehr als 200 einzigartige Proteine, von denen viele immunmodulatorische und hosten antagonistisch. Bei Infektion beginnt Vaccinia-Virus sofort frühen mRNA-Transkription. Dies wird durch eine RNA-Polymerase und Transkriptionsfaktoren, die auf der viralen Genoms während der Virion Verpackungs geladen und in einem angehaltenen Zustand, bis nachfolgende Infektion gehalten wurden, erleichtert. Diese frühe Ausdruck produziert vor allem Proteine ​​für die Unterdrückung der das Immunsystem des Wirts (mRNA Decapping, dsRNA-Sequestrierung und Köder Rezeptorproteine ​​sowie Inhibitoren der Apoptose, Stressantwort und Toll, IL, und NF-kB-Signalisierung) und Genom-Replikation erforderlich. Frühe Ausdruck produziert auch Transkriptionsfaktoren für Zwischenausdruck erforderlich. Zwischen Ausdruck schließt die Expression von Transkriptionsfaktoren spät. DiesAusdruck Kaskade führt zur Produktion von strukturellen und enzymatischen Virusproteine ​​während der späten Stadien der Infektion, die für die komplette Montage des reifen Virions Vaccinia notwendig sind. Unsere Gruppe von fluoreszierenden Reporter-Viren ermöglicht rasche Fortschritte im Verständnis der Biologie Pockenvirus hergestellt werden. Eine der häufigsten und zeitraubenden Methoden auf dem Gebiet der Virologie ist die Wachstumstest. Dies beinhaltet typischerweise Infizieren von Zellen, Festlegung einer Reihe von Behandlungen, Virus-Ernte durch Lyse von infizierten Zellen und der Quantifizierung des erhaltenen Virustiter durch Plaque-Assay. Mit den hier beschriebenen Reporter Viren ermöglicht Echtzeit-Messung der Viruswachstum, die leicht untersucht und verglichen zwischen zahlreichen Behandlungen, die parallel ausgeführt werden können. Wir sehen dieses Set von Reagenzien werden in verschiedenen Protokollen für die Identifizierung Veränderungen im viralen Genexpression in Reaktion auf Medikamente, RNAi-k verwendet werdennockdown oder Wirtsspektrum Einschränkung. Diese Methode ermöglicht auch High-Content-Analyse in einem größeren Maßstab als bisher zur Verfügung, so dass für Hochdurchsatz-Anti-Virus-Drogen-Bildschirme für speziell definierte Zielstufen von Interesse. Während zahlreiche mögliche Behandlungen zur Bekämpfung von Pockenvirus-Infektion identifiziert worden sind, die einzige von der FDA zugelassenen Therapien wirksam zur Behandlung von Pockenvirusinfektion sind die acyclischen Nucleosid-Phosphonats, Cidofovir, und Behandlung mit Vaccinia-Immunglobulin 9,10. Trotz der Ausrottung der Pocken im Jahr 1977 11, bleiben Pockenviren eine erhebliche Bedrohung für die menschliche Gesundheit 12. Einstellung der weit verbreiteten Impfung gegen Variola-Virus hat zu einer erhöhten Anfälligkeit für andere Pockenviren 13 geführt. Zum Beispiel werden die Regionen Zentralafrikas zuvor durch Impfung geschützt erleben einen Anstieg der Affenpocken-Virus-Infektionen 14. Erhebliche Bedenken hat auchhob in Bezug auf die latente Anfälligkeit für vorsätzliche Freisetzung von Variola-Virus. Aufgrund der begrenzten Therapien derzeit zur Verfügung, es besteht ein dringender Bedarf für die Entwicklung von neuartigen Behandlungen. Diese Reporterviren erlauben eine schnelle und Hochdurchsatz-Screening niedermolekularer Inhibitor zur Hemmung einer spezifischen Phase der Virusreplikation. Identifizierung von Inhibitoren, die viralen Expressions Stufen Ziel derzeit nicht das Ziel der Hemmung wird die Entwicklung von Kombinationstherapien mit erhöhter Potenz zu erleichtern. Man kann viel über Vaccinia Zellbiologie durch Beobachtung von Veränderungen in jeder Stufe der Genexpression zu entnehmen. Dämpfung durch chemische oder genetische Manipulation einer infizierten Wirtszelle wird in der Regel in Form von geringeren Virustiter ausgedrückt. Doch beim Vergleich der Entwicklung in den einzelnen Phasen des viralen Expressionskaskade, kann man ein vollständigeres Verständnis der Virus-Fitness ist Auswirkungen zu erhaltendurch eine besondere Behandlung ed. Diese Daten haben gezeigt, dass auch mit der traditionellen Virustiter Ausgangs korrelieren, aber detailliertere mechanistische Informationen sowie hohe Durchsatzkapazitäten 7.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum - Optima, Heat Inactivated (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450H</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamine, (L-glut)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>384 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates</td><td>Corning</td><td>3712</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin, 2X, Sterile, Irradiated</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td>TRLVMF</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide, Cell Culture (DMSO)</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB03091</td><td></td></tr><tr><td>1-&amp;beta;-D-Arabinofuranosylcytosine&amp;nbsp; (AraC), MW= 280 g/mol</td><td>SigmaAldrich Co</td><td>C6645</td><td></td></tr><tr><td>isatin &amp;beta; -thiosemicarbazone (IBT), MW= 234 g/mol</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9075202</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin, MW= 823 g/mol</td><td>SigmaAldrich Co</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>ST-246, MW= 376 g/mol</td><td>SIGA Labs, Corvallis, OR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>157-8</td><td></td></tr><tr><td>TempPlate RT optically clear film</td><td>USA Scientific</td><td>2978-2700</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Reduced Serum Medium</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr></tbody></table>

vaccinia reporter viruses for quantifying viral function at all stages of gene expression

Pockenviren sind eine Familie von Doppelstrang-DNA-Viren, die aktive menschliche Krankheitserreger wie Affenpocken, Dell contagiousum und Contagalo Virus enthalten. Die Familie umfasst auch die Pocken-Virus, Variola. Aufgrund der Komplexität des Pockenvirus-Replikation, bleiben noch viele Fragen hinsichtlich ihrer Genexpression Strategie. In diesem Artikel beschreiben wir die Konzeption und die Verwendung von rekombinanten Vaccinia-Viren, die Echtzeitmessung von einzelnen und mehrfachen Stufen der viralen Genexpression in einem Format mit hohem Durchsatz zu ermöglichen. Dies wird durch die Verwendung von spektral unterschiedlichen fluoreszierenden Proteine ​​als Reporter für jede der drei Phasen der Virusreplikation ermöglicht. Diese Viren einen hohen Signal-zu-Rausch-Verhältnis unter Beibehaltung Stufe spezifische Expressionsmuster, wodurch plattenbasierten Assays und mikroskopische Beobachtungen der Virus Vermehrung und Replikation. Diese Tools verwendet haben für antivirale Entdeckung, Studien der Virus-Wirt-Interaktion, und evolutionäre biologie.

Als ein Beispiel für die typische Verwendung dieser Viren wurde das dreifache Fluoreszenz-Reportervirus verwendet, um den Punkt der Hemmung von mehreren wohldefinierten Pockenvirus-Inhibitoren zu vergleichen. HeLa-Zellen wurden in Gewebekultur behandelt vergoldet schwarz-mauert klar Flachboden-96-Well-Platten und über Nacht inkubiert. Konfluente Monolayer wurden bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 10 unter Verwendung von entweder dreifache Reporter Virus (TRPV, Tabelle...

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Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Wir beschreiben die Verwendung eines fluoreszierenden Reporter Vaccinia-Virus, das Echtzeit-Messung der viralen Infektiosität und Genexpression ermöglicht durch die Stufe-spezifische Expression von spektral unterschiedlichen Fluorophoren Reporter. Wir detailliert ein plattenbasierte Verfahren zum genauen Identifizieren der Phase, in der die Virusreplikation in Reaktion auf kleine Molekül Inhibierung betroffen.

Vaccinia-Viren Reporter zur Quantifizierung von Viral-Funktion auf allen Stufen der Genexpression

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.3K Aufrufe.  Boston University School of Medicine.  Wir beschreiben die Verwendung eines fluoreszierenden Reporter Vaccinia-Virus, das Echtzeit-Messung der viralen Infektiosität und Genexpression ermöglicht durch die Stufe-spezifische Expression von spektral unterschiedlichen Fluorophoren Reporter. Wir detailliert ein plattenbasierte Verfahren zum genauen Identifizieren der Phase, in der die Virusreplikation in Reaktion auf kleine Molekül Inhibierung betroffen. 

Serie: Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in bioterrorism is also a concern. A better understanding of the cellular factors that impact infection would facilitate the development of much-needed therapeutics. Recent advances in RNA interference (RNAi) technology coupled with complete genome sequencing of several organisms has led to the optimization of genome-wide, cell-based loss-of-function screens. Drosophila cells are particularly amenable to genome-scale screens because of the ease and efficiency of RNAi in this system 1. Importantly, a wide variety of viruses can infect Drosophila cells, including a number of mammalian viruses of medical and agricultural importance 2,3,4. Previous RNAi screens in Drosophila have identified host factors that are required for various steps in virus infection including entry, translation and RNA replication 5. Moreover, many of the cellular factors required for viral replication in Drosophila cell culture are also limiting in human cells infected with these viruses 4,6,7,8, 9. Therefore, the identification of host factors co-opted during viral infection presents novel targets for antiviral therapeutics. Here we present a generalized protocol for a high-throughput RNAi screen to identify cellular factors involved in viral infection, using vaccinia virus as an example.

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Novel host factors involved in viral infection can be identified through cell-based genome-wide loss of function RNAi screening. A Drosophila cell culture model is particularly amenable to this approach due to the ease and efficiency of RNAi. Here we demonstrate this technique using vaccinia virus as an example.

RNAi Screening für Host beteiligten Faktoren in Vaccinia Virus-Infektion mit Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells. Members of the orthopox genus include variola, the causative agent of human small pox, monkeypox, and vaccinia (VAC), the prototypic member of the virus family. Within the relatively large (~ 200 kb) vaccinia genome, three classes of genes are encoded: early, intermediate, and late. While all three classes are transcribed by virally-encoded RNA polymerases, each class serves a different function in the life cycle of the virus. Poxviruses utilize multiple strategies for modulation of the host cellular environment during infection. In order to understand regulation of both host and virus gene expression, we have utilized genome-wide approaches to analyze transcript abundance from both virus and host cells. Here, we demonstrate time course infections of HeLa cells with Vaccinia virus and sampling RNA at several time points post-infection. Both host and viral total RNA is isolated and amplified for hybridization to microarrays for analysis of gene expression.

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Protocol for Vaccinia infection of HeLa cells and analysis of host and viral gene expression. Part 1 of 3.

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis des Virus Gene Expression: Teil 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Biologie

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells. Members of the orthopox genus include variola, the causative agent of human small pox, monkeypox, and vaccinia (VAC), the prototypic member of the virus family. Within the relatively large (~ 200 kb) vaccinia genome, three classes of genes are encoded: early, intermediate, and late. While all three classes are transcribed by virally-encoded RNA polymerases, each class serves a different function in the life cycle of the virus. Poxviruses utilize multiple strategies for modulation of the host cellular environment during infection. In order to understand regulation of both host and virus gene expression, we have utilized genome-wide approaches to analyze transcript abundance from both virus and host cells. Here, we demonstrate time course infections of HeLa cells with Vaccinia virus and sampling RNA at several time points post-infection. Both host and viral total RNA is isolated and amplified for hybridization to microarrays for analysis of gene expression.

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Protocol for Vaccinia infection of HeLa cells and analysis of host and viral gene expression. Part 2 of 3.

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis des Virus Gene Expression: Teil 2

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Protocol for Vaccinia infection of HeLa cells and analysis of host and viral gene expression. Part 3 describes the process of fluorescently labeling the amplified RNA from both host and viral samples by amino allyl coupling of dyes. Part 3 of 3.

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis des Virus Gene Expression: Teil 3

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Tagging of viral proteins with fluorescent proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding of virus-host interactions. Vaccinia virus (VACV), the live vaccine used in the eradication of smallpox, is particularly amenable to fluorescent live-cell microscopy owing to its large virion size and the ease with which it can be engineered at the genome level. We report here an optimized protocol for generating recombinant viruses. The minimal requirements for targeted homologous recombination during vaccinia replication were determined, which allows the simplification of construct generation. This enabled the alliance of transient dominant selection (TDS) with a fluorescent reporter and metabolic selection to provide a rapid and modular approach to fluorescently label viral proteins. By streamlining the generation of fluorescent recombinant viruses, we are able to facilitate downstream applications such as advanced imaging analysis of many aspects of the virus-host interplay that occurs during virus replication.

A rapid and modular protocol for the generation of recombinant vaccinia viruses expressing fluorescently&#160;tagged proteins simultaneously using the method of transient dominant selection is described here.

Methodik zur effizienten Erzeugung fluoreszierender Vaccinia-Virusproteine

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To dissect the role of 5&#39;-poly(A) leader in mRNA translation during poxvirus infection we developed an in vitro transcribed RNA-based luciferase reporter assay. This reporter assay comprises of four core steps: (1) PCR to amplify the DNA template for in vitro transcription; (2) in vitro transcription to generate mRNA using T7 RNA polymerase; (3) Transfection to introduce in vitro transcribed mRNA into cells; (4) Detection of luciferase activity as the indicator of translation. The RNA-based luciferase reporter assay described here circumvents issues of plasmid replication in poxvirus-infected cells and cryptic transcription from the plasmid. This protocol can be used to determine translation regulation by cis-elements in an mRNA including 5&#39;-UTR and 3&#39;-UTR in systems other than poxvirus-infected cells. Moreover, different modes of translation initiation like cap-dependent, cap-independent, re-initiation, and internal initiation can be investigated using this method.

We present a protocol to study mRNA translation regulation in poxvirus-infected cells using in vitro Transcribed RNA-based luciferase reporter assay. The assay can be used for studying translation regulation by cis-elements of an mRNA, including 5&#8217;-untranslated region (UTR) and 3&#8217;-UTR. Different translation initiation modes can also be examined using this method.

In Vitro Transcribed RNA-basierter Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infizierten Zellen

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To ...

A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, studying IAV requires the use of laborious secondary approaches to detect the presence of the virus in infected cells and/or in animal models of infection. This limitation has been recently circumvented with the generation of recombinant IAVs expressing easily traceable fluorescent or bioluminescent (luciferase) reporter proteins. However, researchers have been forced to select fluorescent or luciferase reporter genes due to the restricted capacity of the IAV genome for including foreign sequences. To overcome this limitation, we have generated a recombinant replication-competent bi-reporter IAV (BIRFLU) stably expressing both a fluorescent and a luciferase reporter gene to easily track IAV infections in vitro and in vivo. To this end, the viral non-structural (NS) and hemagglutinin (HA) viral segments of influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) were modified to encode the fluorescent Venus and the bioluminescent Nanoluc luciferase proteins, respectively. Here, we describe the use of BIRFLU in a mouse model of IAV infection and the detection of both reporter genes using an in vivo imaging system. Notably, we have observed a good correlation between the expressions of both reporters and viral replication. The combination of cutting-edge techniques in molecular biology, animal research and imaging technologies, provides researchers the unique opportunity to use this tool for influenza research, including the study of virus-host interactions and dynamics of viral infections. Importantly, the feasibility to genetically alter the viral genome to express two foreign genes from different viral segments opens up opportunities to use this approach for: (i) the development of novel IAV vaccines, (ii) the generation of recombinant IAVs that can be used as vaccine vectors for the treatment of other human pathogen infections.

Influenza A viruses (IAVs) are contagious respiratory pathogens that cause annual epidemics and occasional pandemics. Here, we describe a protocol to track viral infections in vivo using a novel recombinant luciferase and fluorescence-expressing bi-reporter IAV (BIRFLU). This approach provides researchers with an excellent tool to study IAV in vivo.

Ein luziferasefluoreszierendes Reporter-Influenzavirus zur Live-Bildgebung und Quantifizierung von Virusinfektionen

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has been responsible for over 242 million infections and more than 4.9 million deaths worldwide. Similar to other viruses, studying SARS-CoV-2 requires the use of experimental methods to detect the presence of virus in infected cells and/or in animal models. To overcome this limitation, we generated replication-competent recombinant (r)SARS-CoV-2 that expresses bioluminescent (nanoluciferase, Nluc) or fluorescent (Venus) proteins. These reporter-expressing rSARS-CoV-2 allow tracking viral infections in vitro and in vivo based on the expression of Nluc and Venus reporter genes. Here the study describes the use of rSARS-CoV-2/Nluc and rSARS-CoV-2/Venus to detect and track SARS-CoV-2 infection in the previously described K18 human angiotensin-converting enzyme 2 (hACE2) transgenic mouse model of infection using in vivo imaging systems (IVIS). This rSARS-CoV-2/Nluc and rSARS-CoV-2/Venus show rSARS-CoV-2/WT-like pathogenicity and viral replication in vivo. Importantly, Nluc and Venus expression allow us to directly track viral infections in vivo and ex vivo, in infected mice. These rSARS-CoV-2/Nluc and rSARS-CoV-2/Venus represent an excellent option to study the biology of SARS-CoV-2 in vivo, to understand viral infection and associated COVID-19 disease, and to identify effective prophylactic and/or therapeutic treatments to combat SARS-CoV-2 infection.

This protocol describes the dynamics of viral infections using luciferase- and fluorescence-expressing recombinant (r)SARS-CoV-2 and an in vivo imaging systems (IVIS) in K18 hACE2 transgenic mice to overcome the need of secondary approaches required to study SARS-CoV-2 infections in vivo.

Live-Bildgebung und Quantifizierung von Virusinfektionen in transgenen K18-hACE2-Mäusen mit Reporter-exprimierendem rekombinantem SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

A Luciferase-Fluorescent Reporter Influenza Virus to Track Viral Infections

Source: Chiem, K., et al. <a href="https://app.jove.com/v/59890">A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection.</a> J. Vis. Exp. (150), (2019).
This video demonstrates a method to track viral infections in mouse models using a recombinant luciferase and fluorescence protein-expressing bi-reporter Influenza A virus. This method enables both in vivo and ex vivo studies, enabling researchers to gain insights into viral dynamics and the effects of interventions.

Ein Luziferase-fluoreszierendes Reporter-Influenzavirus zur Verfolgung von Virusinfektionen

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. In ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Imaging and Visualization Techniques

A Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-Infected Cells

Source: Dhungel, P., et al. <a href="https://app.jove.com/v/59626">In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates an assay to study the translation regulation in poxvirus-infected cells. Uninfected and virus-infected cells were co-transfected with mRNAs encoding for firefly luciferase (Fluc) and Renilla luciferase (Rluc), with the Fluc mRNA containing a 5&#39; Poly(A) leader sequence. Upon adding bioluminescent substrates on lysed cells, measure the signal from both the luciferases to identify the translational advantage of the Fluc mRNA in virus-infected cells, conferred by the leader sequence.

Ein Luciferase-Reporter-Assay zur Untersuchung der Translationsregulation in Pockenvirus-infizierten Zellen

1. Transfect mRNA to Cells

	Seed HeLa cells in a 24-well plate (to be approx. ~80-90% confluent the next day) and incubate overnight in an incubator at ...

Vaccinia-Viren Reporter zur Quantifizierung von Viral-Funktion auf allen Stufen der Genexpression

Zusammenfassung

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