Unterstützt durch NIH R01 HL74082, der Hartwell-Stiftung und der Focused Ultrasound Surgery Foundation.

1. Mikroblasen Produktion <ol><li> Zur Vorbereitung Albumin Mikrobläschen (MBS), setzen Sie eine 1% ige Lösung von Albumin in physiologischer Kochsalzlösung in einen Kolben mit einer Decke aus Gas (Octafluorpropan) oberhalb der wässrigen Phase. Kurz beschallen die Lösung (30 sec) mit einem Ultraschall-Desintegrator mit einem erweiterten ½ &quot;Titan-Sonde ausgestattet. Diese Formulierung ist ähnlich Optison (GE Heathcare), die in einem Konzentrationsbereich von 0,5 bis 1,2 x 10 9 MB / ml versehen ist. Bestimmen Sie bedeuten MB Durchmesser mit einer Multisizer Coulter Counter. Das Albumin bedeuten MB Durchmesser in dieser Studie verwendet wurde 1.93um ± 1.63um. </li><li> Zur Herstellung Lipid MBs, bereiten eine wässrige Dispersion von 1 mg / ml Polyethylenglykol-40-stearat (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) und 2 mg / ml Distearoyl Phosphatidylcholin (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) und sonciate wie zuvor beschrieben (1,1) mit decafluorobutane Gas. Bestimmen Sie bedeuten MB Durchmesser mit einer Multisizer Coulter Counter. Die mittlere Lipid MB Durchmesser in dieser Studie verwendet wurde 2.01um ± 1.29um. </li></ol> 2. Nanopartikel Fabrication <ol><li> Diese Methoden wurden von angepassten Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsion Lösungsmittelverdampfung Technik, die von Davda (2002) und Chappell (2008) beschrieben. </li><li> Bereiten Sie eine 2% Poly (vinylalkohol) PVA-Lösung durch Auflösen von 20 g PVA in 1000 ml deionisiertem Wasser (DI). Anschließend Lösung voll und ganz auf einer Rührplatte über Nacht auflösen. Centrifuge Lösung bei 1000 rpm für 10 Minuten und Filter mit einer 0,22 &amp;mgr; m Sterilfilter zu entfernen restliche ungelöste PVA. </li><li> Zur Herstellung von Rinderserumalbumin (BSA) geladen Poly (Milchsäure-co-Glykolsäure) (PLAGA)-Nanopartikel (NPs), lösen 180mg der nicht begrenzten 85:15 PLAGA in 6ml Methylenchlorid (MC) in einem Glasszintillationsröhrchen. Vortex die MC / PLAGA Lösung für 2 Minuten. </li><li> Lösen gewünschte Nutzlast (15mg BSA) in 1,5 ml PBS. Fügen Sie die PBS / BSA-Lösung in zwei Teile, die PLAGA / MC-Lösung mit Intervallschaltung Vortexen. Platzieren Lösung auf Eis für 5 Minuten und beschallen zu 45W für 120 Sekunden. </li><li> Fügen Sie die MC / PLAGA / Nutzlast / PBS Lösung 24ml von 2% PVA, in zwei Teile mit mittleren Vortexen. </li><li> Platzieren Sie die Lösung auf Eis für 5 Minuten und beschallen zu 45W für 120. </li><li> Rühren Sie die NP-Emulsion für 12 Stunden auf einer Rührplatte in einem Abzug der Verdunstung von MC und NP stabilisieren kann. </li><li> Die Suspension für 25 Minuten bei 20.000 rpm bei 4 ° C zweimal, um NPs zu isolieren und zu entfernen Rest PVA. Das Pellet in 8ml von DI-Wasser und Zentrifuge für 10 Minuten bei 1000 rmp bei 4 ° C, um die 100nm Bevölkerung von NPs zu isolieren. </li><li> Isolieren Sie den Überstand und Blitz einfrieren bei -80 ° C lyophilisiert die gefrorene Probe für 48 Stunden. Lagern Sie die lyophilisierte Partikel in einem Exsikkator bei -80 ° C bis zum Zeitpunkt der Nutzung. </li></ol> 3. Composite-Delivery Vehicle Fabrication (Protokoll vom VisEn Chemie Hinweise angepasst) <ol><li> Umwandlung von VivoTag680 zu Carboxy Oberfläche Funktionalität <ol><li> Kombinieren Sie eine Durchstechflasche VivoTag680 mit 50 ul 1,0 M HEPES, pH 7 und Bernsteinsäureanhydrid (2,5 mg, 25 ĩmol) in 25 ul DMSO. Dann werden 50 ul von 1,0 M NaOH zu dieser Lösung gründlich gemischt; ermöglichen Lösung für 2 Stunden bei Raumtemperatur vor Licht geschützt zu reagieren. Purify Partikel mit Bio-Rad BioGel (P100, Medium) Elution mit 0,1 M MES-Puffer, pH 6,0. Sammeln Sie die grüne Band. </li></ol></li><li> Die Aktivierung der Carboxy-modifizierte VivoTag680 <ol><li> Kombinieren Sie Carboxy-modifizierte VivoTag680 in 0,1 M MES-Puffer, pH 6 erhalten, mit 1 mg 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-Carbodiimid (EDC) und 2,2 mg N-Hydroxysulfosuccinimid (Sulfo-NHS). Nach 2 h bei Raumtemperatur reagieren. </li><li> Purify aktiviert Partikel von überschüssigem aktivierenden Agens (EDC) durch Gelfiltration unter Verwendung von Bio-Rad BioGel (P100, Medium) Elution mit 0,1 M MES-Puffer, pH 6,0 und sammeln die grünen Band. Unmittelbar Konjugat der aktivierten Partikel zu Amin-haltigen Molekülen (z. B. BSA-beladenen Nanopartikel). Lassen Sie die Lösung für 2 Stunden bei Raumtemperatur reagieren. Amine konjugierte NPs wurden aus mehr als EDC durch Zentrifugation bei 20.000 rpm für 60min bei 4 ° C, Abgießen des Überstandes nach Zentrifugation und Resuspendieren in 0,1 MES-Puffer gereinigt. </li></ol></li><li> Stoppen Sie hier, um VivoTag680 getaggt NPs für Drug-Delivery-Studien herzustellen. </li><li> Konjugation von Carboxy-modifizierten PLGA-BSA-VivoTag680 Nanopartikel (NP680) um Albumin Mikrobläschen <ol><li> Kombinieren Sie NP680 in 0,1 M MES-Puffer, pH 6 mit 1 mg 1-Ethyl-3-(3 dimethylaminopropyl)-Carbodiimid (EDC) und 2,2 mg N-Hydroxy-sulfosuccinimide (Sulfo-NHS) erhalten. Lassen Sie die Lösung für 1 Stunde bei Raumtemperatur reagieren. </li><li> Purify aktiviert Nanopartikel aus über EDC durch Zentrifugation bei 20.000 rpm für 60min bei 4 ° C, Abgießen des Überstandes nach Zentrifugation. Resuspendieren Nanopartikel in 0,1 MES-Puffer. </li><li> Wash Albumin MBs dreimal entgast PBS, um überschüssige BSA aus der Lösung zu entfernen. </li><li> Unmittelbar Konjugat der aktivierten Partikel zu Amin-haltigen Molekülen (z. B. Albumin Mikroblasen). Lassen NP680 Lösung für 2 Stunden bei Raumtemperatur reagieren. Purify NP680 konjugierte Mikrobläschen (MNCA) vom ungebundenen NP680s durch dreimaliges Waschen mit entgastem PBS. </li><li> Bestimmen Sie die Konzentration der MNCAs mit einem Coulter Counter. </li></ol></li></ol> 4. Tumor-Modell Alle Tierexperimente wurden in Übereinstimmung mit einem Tier-Protokoll von der University of Virginia Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. <ol><li> C6 Giloma Ratte Tumor-Zelllinie wurde von Dr. Jason Sheehan von UVA (Charlottesville, VA) zur Verfügung gestellt. <ol><li> Cells Linie wurde getestet, um sicherzustellen Zellen wurden Mykoplasmen kostenlos. </li></ol></li><li> Pflegen Sie die Zelllinie in F-12K Nutrient Mixture mit 16% Pferdeserum, 3% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Pen-Strep (Gibco, USA) bei 37 ° C und 5% CO 2. Ergänzt </li><li> Impfen C57BLJ6/Rag1 Mäuse (Jackson) mit 3 x 10 6 C6 Giloma Tumorzellen in 300 ul PBS subkutan in die linke Hinterlauf aufgehängt. Lassen Tumor für 12 Tage wachsen, um einen maximalen Durchmesser von 8-10mm erreichen. </li></ol> 5. In Vivo Ultraschall-Anwendung <ol><li> Anesthetize Mäuse mit einer intraperitonealen (IP) Kombination Injektion von Ketamin-Hydrochlorid (60 mg / kg Körpergewicht) und Xylazin (0,1 mg / kg Körpergewicht) vor der Behandlung. </li><li> Bereiten Sie eine Wartung Betäubung von Ketamin-Hydrochlorid (20 mg / kg Körpergewicht) und Xylazin (0,3 mg / kg Körpergewicht). Verwalten, wie gebraucht. </li><li> Kanülieren die Schwanzvene jedes Tier für die intravenöse (IV) Verabreichung eines MB, MB / NP oder MNCA Lösung. </li><li> Tumor Perfusionsmessungen <ol><li> IV Infusion einer Lipid-MB-Lösung (1x10 8 MB ​​/ g Körpergewicht in 0,3 ml 0,9% iger Kochsalzlösung) mit einer Rate von 15μl/min mit einer kontinuierlichen Infusionspumpe (Harvard Apparatus PHD 2000; Harvard Apparatus, Holliston, MA). </li><li> Ein Acuson Sequoia 512 Ultraschall-System (Siemens Medical Solutions, Mountain View, CA) mit einer 8 13 MHz linear 15L8 Sonde ausgerüstet war in dieser Studie verwendet, um den Kontrast verstärkt Tumorperfusion quantifizieren. Paar der 15L8-Sonde, um den Tumor mit einer Wasser-Ultraschall-Gel (Parker Laboratories Aquasonic 100; Parker Laboratories, Inc., Fairfield, NJ). Scan der Tumor in B-Mode, die beste Bildebene zu erhalten. </li><li> Im Gegensatz Pulssequenz (CPS)-Modus, erwerben einen kontinuierlichen Video-Capturing Mikrobläschen Signalintensität 5 Sekunden vor und 20 nach, die mit hoher Amplitude &quot;Burst&quot;-Puls bei einer Bildwiederholrate von 13Hz. Wiederholen Sie die Messungen in vier Bildebenen. </li><li> Warten Sie zehn Minuten an Albumin MBs einfließen und initiieren therapeutischen niederfrequenten Behandlung zu ermöglichen Lipid MBs aus dem Kreislauf zu löschen. </li></ol></li><li> Therapeutische Ultraschallbehandlung <ol><li> Zehn Minuten nach Tumorperfusion Messungen (5,3) Paar ein 0,75&#39;&#39;Durchmesser 1 MHz unfokussierten Wandler (A314S; Panametrics, Waltham, MA) auf die Haut über der Flanke Tumor. IV Infusion einer Albumin MB (1 x10 5 MB / g Körpergewicht in 0,3 ml 0,9% iger Kochsalzlösung), MB / NP (1 x10 5 MB / g und 0,2 ug NPs / g Körpergewicht in 0,3 ml 0,9% iger Kochsalzlösung) oder MNCA-Lösung (1 x10 5 MNCAs / g Körpergewicht in 0,3 ml 0,9% iger Kochsalzlösung). </li><li> Drug Delivery-Behandlung <ol><li> Insonate für 60 Minuten mit der &quot;1-Burst&quot;-Pulssequenz (5.4.2.2) während einer kontinuierlichen Infusion von NPs, eine Co-Injektion von MBs und NPs oder MNCAs (5.4.1). </li><li> Die &quot;1-Burst&quot; pulsierende Sequenz besteht aus 100 aufeinanderfolgenden 1 MHz Sinusoide (ED = 0,00002) jeweils von 1V Spitze-Spitze-Amplitude von einem Waveform-Generator (AFG-310; Tektronix, Inc., Beaverton, OR). Amplify die Wellenform-Signal durch einen 55 dB RF mit einem Leistungsverstärker (ENI 3100LA; Elektronische Navigation Industries, Richardson, TX). </li></ol></li><li> Ablative Behandlung <ol><li> Identisch mit 5.4.2.1, jedoch insonate mit dem &quot;5-Burst-Medium&quot; oder &quot;5-Burst - Extended&quot; Pulssequenz </li><li> Die &quot;5-Burst-Medium&quot; pulsierende Sequenz besteht aus 5000 1 MHz Sinusoide (duty cycle = 0,005) jeweils von 1V Spitze-Spitze-Amplitude. Die &quot;5-Burst-Exteneded&quot; pulsierende Sequenz besteht aus 10000 1 MHz Sinusoide (duty cycle = 0,01) jeweils von 1V Spitze-Spitze-Amplitude. </li><li> Während der Zeit Verlauf des Experiments überwachen Tumor Temperatur durch eine Nadel Thermoelementsonde (Omega T-Typ, HYP1-30-1/2-TG-60-SMPW-M) 2cm in den Tumor. Rekord Temperaturmessungen alle fünf Minuten. </li></ol></li></ol></li><li> Wiederholen Tumorperfusion Messungen in 5,3 10 Minuten nach therapeutischer Behandlung beschrieben. </li></ol> 6. Tumorperfusion Quantifizierung <ol><li> Mit dem CPS-Programm auf der Sequoia, geben Sie ACQ-Modus. Wählen the region of interest über den kompletten Tumorvolumen. Perfusion Erholung Kurven der Form generiert werden y = A (1 - e-βt) + C (Sadlowski 2002; Chromas 2001; Yeh 2004), die Anpassung an die CPS-Daten. Bewerten β, ein relatives Maß der roten Blutkörperchen Geschwindigkeit, Vorbehandlung und Nachbehandlung. </li><li> Export CPS-Dateien für die Offline-Analyse. Konvertieren von Daten in AVI-Dateien. Pause avi-Dateien in Frame-by-Frame-Bildsequenzen. Mit Compaq Visual Fortan oder eine ähnliche Software-Paket, erzeugen eine zeitlich gemittelte Bild aller Bilder von der zerstörerischen Impuls auf 8 Sekunden nach dem zerstörerischen Impuls. </li><li> Um festzustellen, perfundierten Tumor-Bereich, mit ImageJ-Software, gelten eine Schwelle von 247 um die 8-bite die Zeit gemittelt CPS Bild und Quantifizierung der Prozent verbesserte Pixel innerhalb des Tumorvolumens. Overlay den entsprechenden B-Bild mit der Zeit gemittelt Schwellenwert Bild genau zu definieren Tumor-Bereich. </li><li> Durchschnittliche die prozentuale perfundierten Bereich für ein Minimum von vier CPS-Clips, um eine endgültige perfundierten Gebiet zu einem bestimmten Zeitpunkt für einen bestimmten Tumor zu erhalten. </li><li> Nehmen Sie das Produkt Prozent perfundierten Bereich (6,4) und β (.1), relative Tumordurchblutung bestimmen. </li></ol> 7. Nanopartikel Bioverteilung in Tumor <ol><li> Zwölf Tage vor der Behandlung mit fluoreszenzmarkierten NPs Ort Mäuse auf einem niedrigen alfasprot Ernährung (Harlan, Indianapolis IN) zu reduzieren Autofluoreszenz durch normale Maus chow bei der Abbildung entstehen. </li><li> Shave der Imaging-Website (Flanke Leber), alle Haare zu entfernen. </li><li> Rückstände von Haaren mit einem chemischen Haarentfernung Mittel wie Nair. <ol><li> Spülen aller verbleibenden chemischen Haarentferner oder eine Verätzung auftreten. </li></ol></li><li> Bild Mäuse auf der FMT-System (VisEn Medical) vor der Behandlung und 0, 1, 4 und 24 Stunden nach der Behandlung wie in 5.4.2 beschrieben. </li><li> Vor Bildgebung betäuben Mäusen mit einer IP-Verbindung Injektion von Ketamin-Hydrochlorid (60 mg / kg Körpergewicht) und Xylazin (0,1 mg / kg Körpergewicht). Bewegen Sie die Maus auf dem Imaging-Kassette. Erwerben Reflexion Bilder in weißem Licht und fluoreszierende Modi. Führen Sie fluoreszierenden tomographischen Bildgebung in der VT680-Kanal. </li><li> Verwende den FMT Software 3D-Rekonstruktionen der Bilddaten unter Verwendung eines normierten Born-Gleichung zu erzeugen. Nach der Rekonstruktion, wählen Volumina von Interesse (VOI), indem Sie eine Region of Interest (ROI) in allen 3 Bildebenen (X, Y, Z). Eine mittlere Fluoreszenz-Wert und insgesamt VOI Volumen und Fluorochrom-Konzentration aufgrund fluoreszenzmarkierten BSA-Nanopartikeln, wird für VOI umfasst die Füße und in der Leber erzeugt werden. </li></ol> 8. Tumor Growth Rate <ol><li> Bewerten Tumorvolumen, indem sie täglich Messungen mit digitalen Kaliber. Berechnen Tumorvolumina mit einem Ellipsoid Annäherung; V = 1 / 6 π abc. Wo a, b und c sind die maximalen Durchmesser des Tumors in drei orthogonalen Ebenen gemessen. </li></ol> 9. Tumor Processing and Analysis <ol><li> Sieben Tage nach der Behandlung euthanize Tiere. Kanülieren des linken Ventrikels und exsanguinate Blut mit 10 ml 2% Heparinisiertes Tris CaCl 2-Puffer (0,68 mM) Perfusion von 10 ml Tris CaCl 2-Puffer (0,68 mM), jeweils für 10 Minuten bei 100 mmHg gefolgt. </li><li> Perfusion-fix Gewebe mit einer Infusion von 4% Paraformaldehyd in PBS (4 ° C) für 10 Minuten bei 100 mmHg. Lassen Sie Probe für 60 Minuten zu beheben. </li><li> Excise Proben in Paraffin eingebettet und geschnitten in 5-Mikron-Abschnitte. </li><li> Führen Sie Standard-Hämatoxylin-Eosin-Färbung zur histologischen Veränderungen, die als Ergebnis der Ultraschall-Aufnahmen entstanden sein könnten bewerten. </li><li> Zum Nachweis von apoptotischen Zellen, verwenden Sie ein Terminal Desoxynucleotidyltransferase vermittelten Desoxyuridintriphosphat nick end labeling (TUNEL)-Assay (ApoptTag Kit, Intergen Co., Norcross, GA, USA). </li></ol> 10. Repräsentative Ergebnisse 1. Nanopartikel Fabrication (2,0) <ol><li> Wenn dieses Protokoll korrekt vorgeformt ist NPs werden in Form sphärischer, wie Raster-Elektronen-Mikroskopie (SEM) bestimmt, und eine Gauß-Verteilung rund um 100nm, durch Lichtstreuung Techniken bestimmt. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 1 dargestellt. </li></ol> 2. Targeted Drug Delivery (5.4.1) <ol><li> Basierend auf den veröffentlichten Studien in unserem Labor (Song 2002, Chappell 2008) und unveröffentlichte Ergebnisse in Abbildung 2, Ultraschall-Mikrobläschen Zerstörung führt zu verbesserter Lieferung von intravaskulären Nanopartikel Tumorgewebe durchgeführt. Wir haben auch gezeigt, dass unsere MNCA Lieferung Technik führt zu erhöhten Nanopartikel Lieferung sofort nach der Behandlung. </li></ol> 3. Tumor Ablation (5.4.3) <ol><li> Wir haben das verlängerte Ultraschall Mikroblasen Zerstörung, bei relativ niedrigen Arbeitszyklen (0,005 bis 0,01), die Ergebnisse in mechanische Abtragung der gezeigtenTumor Mikrovaskulatur und Regression des Tumorwachstums. Wenn dieses Protokoll ordnungsgemäß durchgeführt wird sollte man erwarten, Änderungen in (i) Geschwindigkeit des Tumorwachstums (Abb. 3), (ii) Tumor Hämodynamik (Abbildung 4), (iii) nekrotischen Bereich, und (iv) die Apoptose. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2145/2145fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Charakterisierung von Nanopartikeln PLAGA Lager BSA. (A) SEM-Bild korrekt hergestellt Nanopartikel. (B) REM-Aufnahme von unsachgemäß hergestellt Nanopartikel. <img src="/files/ftp_upload/2145/2145fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. (A) Fluoreszenz-vermittelte Tomographie (FMT) Bilder von Ultraschall behandelt (oben) und Kontrolle behandelt (unten) subkutane Gliome unmittelbar nach der Behandlung mit einem MNCAs, bei denen Nanopartikel (NPs) Lager 680 Fluoreszenz-Signale werden auf überlagert Graustufen planar Anregungslicht Bild. <img src="/files/ftp_upload/2145/2145fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Representative fache Änderung des Tumorwachstums nach Mikroblasen Schalluntersuchung mit den fünf-Burst erweitert pulsierende Protokoll. <img src="/files/ftp_upload/2145/2145fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. B-Mode (A, C) und kontrastverstärkten Sonographie (B, D) Bilder einer subkutanen C6 Gliom Tumor in einer Maus. In der ersten Vorbehandlung Bild (A) die Grenze von meist echoarmen Tumor in blau verfolgt worden. Zeitlich mittlere Enhancement nach intravenöser Injektion eines Kontrastmittels in (B) Vorbehandlung gezeigt. Nachbehandlung, vor Kontrastmittelinjektion ist die Tumor wieder meist echoarm (D). Nach Kontrastmittelinjektion, gibt es deutlich weniger Verbesserung in den Tumor.

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Kritische Schritte Kanülierung der Maus Schwanzvene: Die intravenöse Injektion in die Maus Schwanzvene kann eine schwierige Prozedur sein. Allerdings kann eine Schwanzvene Katheter verbessern die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Injektion. Um den Katheter mehrmals hin und her biegen einem 25-Gauge-Nadel, bis es von der Nabe bricht. Legen Sie das stumpfe Ende in das Ende des PE 20 Rohre und dichten die Verbindung mit Silikonkleber. Zur Vorbereitung des Katheter...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>ApoptTag kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Intergen Co.</td>
<td>S7110</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>un-capped 85:15 poly(lactic-co-glycolic acid) (PLAGA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lakeshore Biomaterials</td>
<td>Custom</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vivo Tag 680</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VisEn Medical</td>
<td>10120</td>
<td>Used to Tag BSA</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly(vinyl alcohol)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>363136</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MicroTip Sonicator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Misonix</td>
<td>S-4000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sequoia</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Simons Medical</td>
<td>P.O.A</td>
<td>Equipped with CPS </td>
</tr>
<tr>
<td>FreeZone 2.5</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Labconco</td>
<td>7670020</td>
<td>Equipped with Nitrogen Trap</td>
</tr>
<tr>
<td>Methylene chloride (CH2Cl2)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>D37-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FMT 250</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VisEn Medical</td>
<td>P.O.A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>F-12K Nutrient Mixture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>21127-022</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>polyethyleneglycol-40 stearate </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Chemical </td>
<td>9004-99-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>distearoyl phosphatidylcholine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti Polar Lipids</td>
<td>770365</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Multisizer Coulter Counter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter </td>
<td>P.O.A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Waveform Generator </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tektronix, Inc.</td>
<td>AFG-310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>water-based ultrasound gel </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Parker Laboratories</td>
<td>Aquasonic 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Infusion pump </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>Harvard Apparatus PHD 2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide (EDC) </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pierce Biotechnology</td>
<td>25952-53-8</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pierce Biotechnology</td>
<td>106627-54-7</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Succinic anhydride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>603902</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Power Amplifier </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electronic Navigation Industries</td>
<td>ENI 3100LA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle Thermocouple Probe </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Omega</td>
<td>HYP1-30-1/2-T-G-60-SMPW-M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BioGel (P100, medium)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>150-4170</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>.75&#x2019;&#x2019; diameter 1 MHz unfocused transducer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Panametrics</td>
<td>A314S </td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

contrast ultrasound targeted treatment of gliomas in mice via drug-bearing nanoparticle delivery and microvascular ablation

Wir entwickeln minimal-invasive Kontrastmittel Mikroblasen basierte therapeutische Ansätze, in denen die Permeabilisierung und / oder Abtragung der Mikrovaskulatur durch Variation Ultraschall pulsierende Parameter gesteuert werden. Insbesondere sind wir testen, ob solche Ansätze verwendet werden, um bösartigen Hirntumoren durch Drug-Delivery-und mikrovaskuläre Ablation behandeln. Vorläufige Studien wurden durchgeführt, um festzustellen, ob gezielte Wirkstoff-tragenden Nanopartikel Lieferung durch den Ultraschall-vermittelte Zerstörung von &quot;Verbundwerkstoff&quot;-Zusteller von 100nm Poly (Lactid-co-Glycolid) (PLAGA) Nanopartikel, die an Albumin geschält Mikrobläschen eingehalten werden zusammen erleichtert werden kann . Wir bezeichnen diese Mittel als Mikroblasen-Nanopartikel-Composite-Agenten (MNCAs). Wenn zur subkutanen C6 Gliome mit Ultraschall gezielt beobachteten wir eine sofortige 4,6-fache Erhöhung der Nanopartikel-Lieferung in MNCA behandelten Tumoren über Tumoren mit Mikrobläschen mit Nanopartikeln und einer 8,5 fachen Erhöhung gegenüber nicht behandelten Tumoren verabreicht behandelt. Darüber hinaus in vielen Krebs-Anwendungen, glauben wir, kann es wünschenswert sein, um gezielten Verabreichung von Medikamenten in Verbindung mit Ablation des Tumors Mikrozirkulation, die an Tumor Hypoxie und Apoptose führen durchzuführen. Zu diesem Zweck haben wir die Wirksamkeit von nicht-theramal durch Kavitation mikrovaskuläre Ablation getestet und zeigt, dass dieser Ansatz Tumorperfusion Reduktion, Apoptose, signifikante Wachstumshemmung und Nekrose hervorruft. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass unsere Ultraschall-gezielten Ansatz das Potenzial für therapeutische Effizienz, indem Tumor-Nekrose durch mikrovaskuläre Ablation und / oder gleichzeitig die Verbesserung der Droge Nutzlast in Gliomen zu erhöhen ist.

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Contrast Ultrasound Targeted Treatment of Gliomas in Mice via Drug-Bearing Nanoparticle Delivery and Microvascular Ablation

Schalluntersuchung von Mikrobläschen ist eine vielversprechende Strategie für die Tumor Ablation bei reduziertem Zeit-gemittelten akustischen Kräfte, sowie für die gezielte Verabreichung von Therapeutika. Das Ziel der vorliegenden Studie ist es, niedrige Einschaltdauer Ultraschall pulsierende Strategien und Nanocarriern zu nicht-thermischen Ablation mikrovaskuläre und Nutzlast Lieferung an subkutanen C6 Gliomen zu maximieren.

Contrast Ultrasound gezielte Behandlung von Gliomen in Mäusen über Drug-Bearing Nanopartikel Liefer-und mikrovaskuläre Ablation

We are developing minimally-invasive contrast agent microbubble based therapeutic approaches in which the permeabilization and/or ablation of the ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.8K Aufrufe.  University of Virginia. Schalluntersuchung von Mikrobläschen ist eine vielversprechende Strategie für die Tumor Ablation bei reduziertem Zeit-gemittelten akustischen Kräfte, sowie für die gezielte Verabreichung von Therapeutika. Das Ziel der vorliegenden Studie ist es, niedrige Einschaltdauer Ultraschall pulsierende Strategien und Nanocarriern zu nicht-thermischen Ablation mikrovaskuläre und Nutzlast Lieferung an subkutanen C6 Gliomen zu maximieren.

Serie: Contrast Ultrasound Targeted Treatment of Gliomas in Mice via Drug-Bearing Nanoparticle Delivery and Microvascular Ablation

Introduction to the Ultrasound Targeted Microbubble Destruction Technique

In UTMD, bioactive molecules, such as negatively charged plasmid DNA vectors encoding a gene of interest, are added to the cationic shells of lipid microbubble contrast agents7-9. In mice these vector-carrying microbubbles can be administered intravenously or directly to the left ventricle of the heart. In larger animals they can also be infused through an intracoronary catheter. The subsequent delivery from the circulation to a target organ occurs by acoustic cavitation at a resonant frequency of the microbubbles. It seems likely that the mechanical energy generated by the microbubble destruction results in transient pore formation in or between the endothelial cells of the microvasculature of the targeted region10. As a result of this sonoporation effect, the transfection efficiency into and across the endothelial cells is enhanced, and transgene-encoding vectors are deposited into the surrounding tissue. Plasmid DNA remaining in the circulation is rapidly degraded by nucleases in the blood, which further reduces the likelihood of delivery to non-sonicated tissues and leads to highly specific target-organ transfection.

Ultrasound Targeted Microbubble Destruction (UTMD) can be used to direct site-specific delivery of bioactive molecules, including therapeutic genes, to target organs accessible to ultrasound, such as the heart and liver1-6.

Einführung in die Ultraschall-gezielte Mikroblasen Zerstörung Technik

In UTMD, bioactive molecules, such as negatively charged plasmid DNA vectors encoding a gene of interest, are added to the cationic shells of lipid ...

Forschung

Biotechnik

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Cellular Lipidextraktion für Targeted Stable Isotope Dilution Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Analyse

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. Urgent need exists to develop novel clinically-translatable therapeutic strategies that can improve on the dismal survival statistics of pancreatic cancer patients. Although gene therapy in cancer has shown a tremendous promise, the major challenge is in the development of safe and effective delivery system, which can lead to sustained transgene expression. 
Gelatin is one of the most versatile natural biopolymer, widely used in food and pharmaceutical products. Previous studies from our laboratory have shown that type B gelatin could physical encapsulate DNA, which preserved the supercoiled structure of the plasmid and improved transfection efficiency upon intracellular delivery. By thiolation of gelatin, the sulfhydryl groups could be introduced into the polymer and would form disulfide bond within nanoparticles, which stabilizes the whole complex and once disulfide bond is broken due to the presence of glutathione in cytosol, payload would be released 2-5. Poly(ethylene glycol) (PEG)-modified GENS, when administered into the systemic circulation, provides long-circulation times and preferentially targets to the tumor mass due to the hyper-permeability of the neovasculature by the enhanced permeability and retention effect 6. Studies have shown over-expression of the epidermal growth factor receptor (EGFR) on Panc-1 human pancreatic adenocarcinoma cells 7. In order to actively target pancreatic cancer cell line, EGFR specific peptide was conjugated on the particle surface through a PEG spacer.8
Most anti-tumor gene therapies are focused on administration of the tumor suppressor genes, such as wild-type p53 (wt-p53), to restore the pro-apoptotic function in the cells 9. The p53 mechanism functions as a critical signaling pathway in cell growth, which regulates apoptosis, cell cycle arrest, metabolism and other processes 10. In pancreatic cancer, most cells have mutations in p53 protein, causing the loss of apoptotic activity. With the introduction of wt-p53, the apoptosis could be repaired and further triggers cell death in cancer cells 11. 
Based on the above rationale, we have designed EGFR targeting peptide-modified thiolated gelatin nanoparticles for wt-p53 gene delivery and evaluated delivery efficiency and transfection in Panc-1 cells.

Type B gelatin-based engineered nanovectors system (GENS) was developed for systemic gene delivery and transfection in the treatment of pancreatic cancer. By modification with epidermal growth factor receptor (EGFR) specific peptide on the surface of nanparticles, they could target on EGFR receptor and release plasmid under reducing environment, such as high intracellular glutathione concentrations.

Gentransfer und Transfektion in humanen Pankreaskarzinom-Zellen mit Epidermal Growth Factor Gelatin-Based Engineered Nanovektoren Rezeptor-gezielte

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Advances in microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and reproducible microfluidic systems for conducting biological and biochemical experiments at the micro- and nanoscales 1,2. In addition, microfluidics have also been specifically used to quantitatively analyze hematologic and microvascular processes, because of their ability to easily control the dynamic fluidic environment and biological conditions3-6. As such, researchers have more recently used microfluidic systems to study blood cell deformability, blood cell aggregation, microvascular blood flow, and blood cell-endothelial cell interactions6-13.However, these microfluidic systems either did not include cultured endothelial cells or were larger than the sizescale relevant to microvascular pathologic processes. A microfluidic platform with cultured endothelial cells that accurately recapitulates the cellular, physical, and hemodynamic environment of the microcirculation is needed to further our understanding of the underlying biophysical pathophysiology of hematologic diseases that involve the microvasculature.
Here, we report a method to create an "endothelialized" in vitro model of the microvasculature, using a simple, single mask microfabrication process in conjunction with standard endothelial cell culture techniques, to study pathologic biophysical microvascular interactions that occur in hematologic disease. This "microvasculature-on-a-chip" provides the researcher with a robust assay that tightly controls biological as well as biophysical conditions and is operated using a standard syringe pump and brightfield/fluorescence microscopy. Parameters such as microcirculatory hemodynamic conditions, endothelial cell type, blood cell type(s) and concentration(s), drug/inhibitory concentration etc., can all be easily controlled. As such, our microsystem provides a method to quantitatively investigate disease processes in which microvascular flow is impaired due to alterations in cell adhesion, aggregation, and deformability, a capability unavailable with existing assays.

A method to culture an endothelial cell monolayer throughout the entire inner 3D surface of a microfluidic device with microvascular-sized channels (&lt;30 &mu;m) is described. This in vitro microvasculature model enables the study of biophysical interactions between blood cells, endothelial cells, and soluble factors in hematologic diseases.

Endothelialisierten Mikrofluidik für ein Studium Mikrovaskuläre Wechselwirkungen in Hämatologische Krankheiten

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Evaluation von polymeren Gene Delivery-Nanopartikeln durch Nanopartikel Tracking-Analyse und High-throughput Durchflusszytometrie

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An oscillatory motion is generated at the focus of a 93-element and 4.5 MHz center frequency HIFU transducer by applying a 25 Hz amplitude-modulated signal using a function generator. A 64-element and 2.5 MHz imaging transducer with 68kPa peak pressure is confocally placed at the center of the HIFU transducer to acquire the radio-frequency (RF) channel data. In this protocol, real-time monitoring of thermal ablation using HIFU with an acoustic power of 7 W on canine livers in vitro is described. HIFU treatment is applied on the tissue during 2 min and the ablated region is imaged in real-time using diverging or plane wave imaging up to 1,000 frames/second. The matrix of RF channel data is multiplied by a sparse matrix for image reconstruction. The reconstructed field of view is of 90&#176; for diverging wave and 20 mm for plane wave imaging and the data are sampled at 80 MHz. The reconstruction is performed on a Graphical Processing Unit (GPU) in order to image in real-time at a 4.5 display frame rate. 1-D normalized cross-correlation of the reconstructed RF data is used to estimate axial displacements in the focal region. The magnitude of the peak-to-peak displacement at the focal depth decreases during the thermal ablation which denotes stiffening of the tissue due to the formation of a lesion. The displacement signal-to-noise ratio (SNRd) at the focal area for plane wave was 1.4 times higher than for diverging wave showing that plane wave imaging appears to produce better displacement maps quality for HMIFU than diverging wave imaging.

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound HIFU Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound HMIFU

This article describes real-time monitoring of HIFU ablation in canine liver with high frame rate ultrasound imaging using diverging and plane wave imaging. Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound is used to image the decrease of acoustic radiation force induced displacement in the ablated region.

Echtzeit-Überwachung von hochintensiven fokussierten Ultraschall (HIFU) Ablation<em&gt; In-vitro-</em&gt; Canine Livers Verwendung harmonische Bewegung Imaging für fokussierten Ultraschall (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. Recently, nanoparticles (NPs) have shown significant promise in the development of such delivery systems. Here, a liquid crystal NP (LCNP)-based delivery system has been employed for the controlled delivery of a water-insoluble dye, 3,3&#8242;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO), from within the NP core to the hydrophobic region of a plasma membrane bilayer. During the synthesis of the NPs, the dye was efficiently incorporated into the hydrophobic LCNP core, as confirmed by multiple spectroscopic analyses. Conjugation of a PEGylated cholesterol derivative to the NP surface (DiO-LCNP-PEG-Chol) enabled the binding of the dye-loaded NPs to the plasma membrane in HEK 293T/17 cells. Time-resolved laser scanning confocal microscopy and F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging confirmed the passive efflux of DiO from the LCNP core and its insertion into the plasma membrane bilayer. Finally, the delivery of DiO as a LCNP-PEG-Chol attenuated the cytotoxicity of DiO; the NP form of DiO exhibited ~30-40% less toxicity compared to DiOfree delivered from bulk solution. This approach demonstrates the utility of the LCNP platform as an efficient modality for the membrane-specific delivery and modulation of hydrophobic molecular cargos.

A liquid crystal nanoparticle (LCNP) nanocarrier is exploited as a vehicle for the controlled delivery of a hydrophobic cargo to the plasma membrane of living cells.

Gezielte Plasma Membrane Lieferung eines Hydrophobic Transport Encapsulated in einem Liquid Crystal Nanoparticle Träger

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to the placenta while minimizing fetal and maternal side effects remains challenging. Targeted nanoparticle carriers provide new opportunities to treat placental disorders. We recently demonstrated that a synthetic placental chondroitin sulfate A binding peptide (plCSA-BP) could be used to guide nanoparticles to deliver drugs to the placenta. In this protocol, we describe in detail a system for assessing the efficiency of drug delivery to the placenta by plCSA-BP that employs three separate methods used in combination: in vivo imaging, high-frequency ultrasound (HFUS), and high-performance liquid chromatography (HPLC). Using in vivo imaging, plCSA-BP-guided nanoparticles were visualized in the placentas of live animals, while HFUS and HPLC demonstrated that plCSA-BP-conjugated nanoparticles efficiently and specifically delivered methotrexate to the placenta. Thus, a combination of these methods can be used as an effective tool for the targeted delivery of drugs to the placenta and development of new treatment strategies for several pregnancy complications.

We describe a system that utilizes three methods to evaluate the safety and effectiveness of placenta-targeted drug delivery: in vivo imaging to monitor nanoparticle accumulation, high-frequency ultrasound to monitor placental and fetal development, and HPLC to quantify drug delivery to tissue.

Umfassende Bewertung der Wirksamkeit und Sicherheit von Plazenta-gezielte Medikamentenverabreichung mit drei komplementäre Methoden

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell mimicking environment. Furthermore, the development of cell-free expression systems has demonstrated the ability to reconstitute the protein production, transcription and translation processes (DNA&#8594;RNA&#8594;protein) in a controlled manner, harnessing synthetic biology. Here we describe a protocol for preparing a cell-free expression system, including the production of a potent bacterial lysate and encapsulating this lysate inside cholesterol-rich lipid-based giant unilamellar vesicles (GUVs) (i.e., stable liposomes), to form synthetic cells. The protocol describes the methods for preparing the components of the synthetic cells including the production of active bacterial lysates, followed by a detailed step-by-step preparation of the synthetic cells based on a water-in-oil emulsion transfer method. These facilitate the production of millions of synthetic cells in a simple and affordable manner with a high versatility for producing different types of proteins. The obtained synthetic cells can be used to investigate protein/RNA production and activity in an isolated environment, in directed evolution, and also as a controlled drug delivery platform for on-demand production of therapeutic proteins inside the body.

This protocol describes the method, materials, equipment and steps for bottom-up preparation of RNA and protein producing synthetic cells. The inner aqueous compartment of the synthetic cells contained the S30 bacterial lysate encapsulated within a lipid bilayer (i.e., stable liposomes), using a water-in-oil emulsion transfer method.

Herstellung von Proteinproduktion synthetischer Zellen mit zellfreien bakteriellen Extrakten, Liposomen und Emulsionstransfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Patient-Specific Polyvinyl Alcohol Phantom Fabrication with Ultrasound and X-Ray Contrast for Brain Tumor Surgery Planning

Phantoms are essential tools for clinical training, surgical planning and the development of novel medical devices. However, it is challenging to create anatomically accurate head phantoms with realistic brain imaging properties because standard fabrication methods are not optimized to replicate any patient-specific anatomical detail and 3D printing materials are not optimized for imaging properties. In order to test and validate a novel navigation system for use during brain tumor surgery, an anatomically accurate phantom with realistic imaging and mechanical properties was required. Therefore, a phantom was developed using real patient data as input and 3D printing of molds to fabricate a patient-specific head phantom comprising the skull, brain and tumor with both ultrasound and X-ray contrast. The phantom also had mechanical properties that allowed the phantom tissue to be manipulated in a similar manner to how human brain tissue is handled during surgery. The phantom was successfully tested during a surgical simulation in a virtual operating room.
The phantom fabrication method uses commercially available materials and is easy to reproduce. The 3D printing files can be readily shared, and the technique can be adapted to encompass many different types of tumor.

This protocol describes the fabrication of a patient specific skull, brain and tumor phantom. It uses 3D printing to create molds, and polyvinyl alcohol (PVA-c) is used as the tissue mimicking material.

Patientenspezifische Polyvinylalkohol-Phantomfertigung mit Ultraschall- und Röntgenkontrast für die Planung von Hirntumorchirurgie

Phantoms are essential tools for clinical training, surgical planning and the development of novel medical devices. However, it is challenging to create ...