Wir sind dankbar, dass Dr. Andrew Hollander, Sara Davis, Lee Shuman, Tim Jenkins, und Dr. Xiangsheng Xu für ihre fachkundige Unterstützung. Wir erkennen die Unterstützung von Dr. Ann Kennedy. BCB wurde auf der Strahlenbiologie Training Grant C5T32CA009677 unterstützt. JFD wurde auf der Burroughs Wellcome Career Award for Medical Wissenschaftler (1006792) unterstützt. JLB wurde auf der Supers Zuschuss (5 R25 CA140116-03) unterstützt. Wir möchten Dr. Steve Hahn, deren Ermutigung und Unterstützung hat dazu beigetragen, dass unsere Forschung möglich anzuerkennen. Wir möchten auch die University of Pennsylvania Nano-Bio-Interface Center (NBIC) und Dr. Dennis Discher für Ermutigung und hilfreiche Kommentare. Wir erkennen die Small Animal Imaging Facility (SAIF) an der University of Pennsylvania für die Nutzung ihrer MRI und optische / Biolumineszenz Core Facilities. Diese Techniken wurden im Rahmen von Projekten, die von den National Institutes of Health (RC1 CA145075 und K08 unterstützt wurden entwickelt NS076548-01).

A. Pre-Operative Tumor Cell Preparation <ol><li> Transduzieren U251 Glioblastom multiforme Zellen mit einem lentiviralen Expressionsvektor (pGreenFire, System Biosciences), um stabil exprimieren, das Glühwürmchen-Luciferase-Gen. </li><li> Diese Zellen wurden in 10 ml komplettem Dulbeccos Modifikation von Eagle-Medium (DMEM), welches aus DMEM besteht, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum, 1% Penicillin-Streptomycin und 1% nicht-essentielle Aminosäuren in einem T75 Zellkulturflasche Inkubieren bei 5% C0 2 und 37 ° C. </li><li> Führen Standard-Zellkultur, beginnend mit dem Waschen der Zellen mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), gefolgt von TRYPSINIERUNGSFLASCHEN. </li><li> Quench das Trypsin mit komplettem DMEM wird die Lösung auf eine 50 ml-Erlenmeyerkolben und bestimmen die zelluläre Konzentration unter Verwendung des Coulter Counter. </li><li> Zentrifugieren der geernteten Zellen in komplettem DMEM für 3 min bei etwa 3000 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Nach Zentrifugation der anzusaugenf die Medien und nur ein Pellet von Zellen am Boden des 50 ml-Erlenmeyerkolben. </li><li> Arbeiten schnell, um die Zellen vor dem Austrocknen zu verhindern, erneut die Zellen in einem Volumen von frischem Komplettmedium DMEM um die gewünschte Konzentration von 50.000 Zellen / ul und Transfer zu einem 2 ml sterile Fläschchen auf Eis gelegt zu erreichen. </li><li> Zellen auf Eis sollte kurz auf eine niedrige Einstellung alle ~ 20 min, um die Zelladhäsion zu verhindern verwirbelt werden. Die Zellen können sicher für intrakranielle Implantationen werden bis zu zwei Stunden nach der Platzierung auf Eis verwendet. </li></ol> B. Orthotopische Xenograft Implantation <ol><li> Wiegen nackte athymischen NCr Maus (nu / nu), um eine Basis, vor der Implantation Gewicht herzustellen. Wir wählen normalerweise Mäusen 6-10 Wochen alt mit Gewichten zwischen 17 und 24 Gramm. </li><li> 1 Stunde vor der Implantation, pre-medicate die Maus mit 5 mg / kg des nicht-steroidalen entzündungshemmenden Wirkstoff Meloxicam als subkutane Injektion zur Behandlung von postoperativen Schmerzen und Entzündungen. </li><li> AnesthetizE das Tier mit einer intraperitonealen Injektion einer Ketamin / Xylazin Mischung bei einer Dosis von 140 mg / kg und 10 mg / kg. </li><li> Bestätigen Sie, dass die Maus ausreichend betäubt durch die Beurteilung des Tieres spontane Reaktion auf eine Zehe Prise ist. Wenn das Tier reagiert auf die Zehen Prise, verzögern den Vorgang, bis die Betäubung wirksam werden kann oder zu prüfen, Einbringung zusätzlicher Anästhesie (&lt;25% der ursprünglichen Menge). </li><li> Vorbereiten der anästhesierten Maus zur Positionierung im Stoelting Digitale Gerade für Mouse stereotaktische Plattform (Stoelting Inc.) durch Einhaken der Mäuse Schneidezähne im Beißstange der Schnauze Restrainer und Anziehen der Nase Klemme über der Schnauze, während sichergestellt wird, dass der Maus Kopf eingeschaltet ist eine Ebene Ebene. </li><li> Übertragen der zurückhaltende Maus nach Stoelting stereotaktischen Plattform Einstellen der Positionierung des Tieres, so daß die Spitzen der Stäbe Ohr am kaudalen Ende des Gehörgangs sind. Sobald das Tier Schädel-to-caudal Positionierung hat adjusted, sichern den Biss bar an den stereotaktischen Rahmen. Die Maus sollte auf einer festen Kunststoff-Heizplatte (Harvard Apparatus) mit Klebeband an den Stoelting Plattform, um Feedback-gesteuerte Temperaturregelung während der Operation stellen gesichert werden ruhen. </li><li> Stellen Sie die Höhe des Ohres Bars wie nötig und wechselt dann das Ohr Bars in den kaudalen Anteil des Gehörgangs und sichern Sie sie, so dass die Maus den Kopf in einer ebenen Fläche ist und immobilisiert auf Fingerdruck. Überwachen sorgfältig auf Anzeichen von Atemnot nach der Platzierung des Ohres Bars. Lösen und neu zu positionieren, wenn das Tier in Not ist. </li><li> Legen der geschmierten Spitze eines rektalen Temperaturfühler angeschlossen an die TCAT-2DF Temperaturregler (Harvard Apparatus) des Tieres Temperatur zu überwachen und eine Rückkopplungssteuerung auf der Heizplatte unterhalb des Maus positioniert, um den Körper des Tieres Temperatur bei 36 aufrechtzuerhalten ° C während die Prozedur. </li><li> Bewerben Augensalbe in die Augen zu prevent Trocknen. </li><li> Bewerben betadine Lösung der Oberseite der Maus den Kopf, um die Inzisionsstelle desinfizieren, wobei darauf zu achten die Augen zu vermeiden. </li><li> Führen Sie einen Zeh Prise zu bestätigen, dass die Maus bewusstlos ist, liefert eine kleine Menge von zusätzlichen Ketamin / Xylazin (&lt;25% der ursprünglichen Dosis), wenn nötig. </li><li> Reinigen 0,45 mm Grat Bohrmeißels (Stoelting), die an der Bohrmaschine (Foredom Mikrobohrers) unter Verwendung eines Alkohol-Pad und dann Sterilisieren der Bohrkrone in einer Glasperle Sterilisator (Germinator 500, CellPoint Scientific) für 15 sec, Eintauchen nur den Bohrer in die Sterilisator Perlen. </li><li> Verwendung einer sterilen Skalpell ein 0,75 cm Inzision in Längsrichtung in der Mitte der Kopfhaut, der sich von der Ebene der Augen kaudal. Bestätigen Visualisierung der bregma. </li><li> Befestigen Sie das Bohrfutter der Stoelting Plattform und legen Sie eine Bohrmaschine (Foredom MicroDrill) mit einer 0,45 mm-Fräse Bohrer (Stölting) in die Bohrerhalterung, befestigen Sie sie in Position. </li><li> Setzen Sie den Bohrer genau über ter Bregma und dann Null-out die x-, y-, z-Koordinaten des digitalen stereotaktischen Display. Bewegen Sie die Spitze des Bohrers in eine Position 2 mm posterior und 1,5 mm lateral des bregma in der rechten Gehirnhälfte und Bohrer in das Tier den Schädel mit dem Foredom Bohrer, Durchstechen nur die Knochen. Ein steriler Wattetupfer kann verwendet werden, um sanft zurückzuziehen die Kanten des Einschnitts, um die Visualisierung des Schädels zu erleichtern. </li><li> Entfernen des Bohrers und der Bohrerhalterung vom stereotaktischen Plattform. </li><li> Bringen Sie die Nanomite Injektor Spritzenpumpe (Harvard Apparatus) der stereotaktischen Plattform. </li><li> Entfernen Sie die Zellen aus Eis und entweder vorsichtig vortexen das Fläschchen mit den Tumorzellen mit kurzen Impulsen oder sanft Flick das Fläschchen zu resuspendieren der Zellen. Ausarbeitung 7 ul der Zellsuspension durch eine 30-Gauge-1 &quot;langen, flachen Kegel Nadel an einer 10 &amp;mgr; l-Spritze (Hamilton Spritze). Vermeiden Sie große Luftblasen in der Spritze. Sicherstellen, dass sich keine Luftblasen in der Anfangsphase 6 ul des Fluids which will das Gesamtvolumen in die Maus injiziert werden. Kleine Luftblasen in den verbleibenden 1 ul sind ohne Bedeutung. Vermeiden Sie wiederholte draw-ups der Zellsuspension, wenn möglich, um Schäden an den Zellen zu minimieren. </li><li> Positionieren Sie den geladenen Spritze in der Spritze Injektor. Verwendung eines Alkohols Pad, einem Entfernen der Zellsuspension Fluid, die an der Spitze der Nadel, um eine Kontamination des Inzisionsstelle mit Krebszellen, die in Tumorzellen wachsen in der extrakraniellen Raum führen könnten erscheint. </li><li> Stellen Sie die Einspritzpumpe auf 6,0 ul bei einer Geschwindigkeit von 0,5 ul / min liefern. Die 1 ul Zellsuspension in der Spritze verbleibenden nach der Implantation sichergestellt, dass die Luftblasen, die häufig in der Spritze zu sammeln nicht in das Tier injiziert. Die Injektion von Luftblasen konnte in einer tödlichen Luftembolie führen. </li><li> Vorzurücken Nadel der Spritze durch das Bohrloch Aufrechterhalten der Nadel senkrecht (90 °) zu dem Schädel. Sobald die Nadel hat den Schädel, zero aus dem Koordinie durchlaufenates auf der stereotaktischen Digitalanzeige und dann langsam voran die Spitze der Nadel über einen Zeitraum von 4 min, bis er eine Tiefe von 2,5 mm erreicht hat. Die Nadel durch den Kortex und Abschnitte des hinteren Hippocampus. Die x-, y-, z-Koordinaten für die stereotaktische Implantation wurden gewählt, um eine seitlich angeordnete Tumor innerhalb des zerebralen Hemisphäre zu erzeugen, während die Vermeidung der Beschädigung kritischen Hirnstrukturen wie dem Thalamus und Nähe zu den Ventrikeln wodurch die Wahrscheinlichkeit von Impfen der Cerebrospinalflüssigkeit mit Tumorzellen das kann zu unerwünschten spinalen Tumoren geben. Ein hinterer Stelle relativ zum Bregma wurde ausgewählt, um die Wahrscheinlichkeit einer großen, lokal fortgeschrittenen Tumoren ulzerierenden in den Orbit zu reduzieren. Pause mit der Nadel in der Tiefe für 2 min und starten dann die Implantation von Zellen. </li><li> Während der Implantation, trocknen den Schädel wiederholt mit einem mikrochirurgischen Schwamm Speer jede Tumor enthaltenden Flüssigkeit, die aus dem Bohrloch kann refluxiert während entfernenImplantation. Verhindern, dass die Nadel mit der mikrochirurgischen Schwamm. Das Entfernen dieser Flüssigkeit sollte die Wahrscheinlichkeit verringern, der Tumor wächst in der extrakraniellen Raum. </li><li> Nach der Injektion abgeschlossen ist, lassen Sie die Nadel im Gehirn für ca. 2 min und dann langsam ziehen Sie die Nadel über einen Zeitraum von 3-4 min. </li><li> Lösen Sie die Ohr Bars und Schnauze restrainer und entfernen Sie die Maus aus der stereotaktischen Apparat. </li><li> Schließen Sie das Bohrloch im Schädel mit steriler Knochenwachs hinterlegt durch Reiben Wachs hin und her über dem Bohrloch aus dem hölzernen Ende einer sterilen Wattestäbchen. Weiterhin anwenden Knochenwachs bis das Loch vollständig abgedichtet ist und das Knochenwachs Abdichten des Bohrlochs ist bündig mit der benachbarten Schädel. </li><li> Re-Angleichung der Kanten des Einschnitts mit sterilen Wattestäbchen und wenden Veterinär Gewebekleber, um die Wunde zu versiegeln, wobei darauf zu achten Kleber Exposition gegenüber die Augen des Tieres zu vermeiden. </li><li> Schließlich legen Sie die Maus auf einem Heizkissen auf 37 °C, bis das Tier wieder das Bewusstsein. Übertragen Sie das Tier wieder in seinen ursprünglichen Käfig, sobald die Maus ist wach und ansprechbar. </li></ol> C. Bioluminescent Imaging (BLI) zur Überwachung Tumorwachstum und Ansprechen auf die Therapie Kurze Anweisungen für Biolumineszenz-Bildgebung. <ol><li> Anästhesieren Mäuse mit Tumor zuvor in einer Kammer implantierten mit 2% Isofluran und Sauerstoff. </li><li> Während die Mäuse betäubt sind, injizieren sie entweder subkutan oder intraperitoneal mit 60 ul D-Luciferin Kaliumsalz in PBS auf eine Konzentration von 50 mg / ml verdünnt. </li><li> Schalten auf den Fluss von Anästhesie an die Bugspitze im biolumineszierenden Bildgebungsscanner und schnellen Übertragen der Mäuse mit dem Scanner die Schnauzen Anordnen in den Bugspitzen. </li><li> Positionieren schwarzen Trennwänden zwischen den Mäusen, die Blutung von biolumineszenten Signals von einem Tumor begrenzen mit hoher Signalintensität zu einem benachbarten Tumor mit viel niedrigeren Signal. </li><li> Mitthe Living Image Software, nehmen häufiger Serienaufnahmen bis zu einer Gesamtdauer von bis zu 30 Minuten nach dem Zeitpunkt der Injektion von D-Luciferin. Wir bevorzugen Einstellung der Belichtungszeit auf &quot;Auto&quot;, um die Wahrscheinlichkeit eines Unter-oder überbelichteten Bild zu begrenzen. Keine einzige Exposition sollte&gt; 5 min. </li><li> Führen Sie wiederholen Biolumineszenz Bildgebung in angemessenen Abständen. Serielle wöchentlichen Bildgebung ist eine vernünftige Option für viele Längs-Experimenten testen Ansprechen auf die Behandlung. </li><li> Nach Aufnahme von Bildern, mit der Lebens-Bild Softwareprogramm zu Tumoren, indem ein Bereich von Interesse (ROI) um jeden Tumor in jedem Bild während des biolumineszierenden Bildgebungssitzung erworbenen analysieren. Anwenden eines zweiten, kleineren Bereich von Interesse auf die untere Flanke jeder Maus in jedem Bild als Hintergrund Region von Interesse, um die biolumineszierende Signal des Tumors vom Grad der Hintergrund biolumineszierenden Signalintensität zu korrigieren. Wir bevorzugen mit der &quot;Radiance&quot;-Einstellung als &quot;Counts&quot; als AusgabeformatWerte für biolumineszenten Signals. </li><li> Exportieren Sie die ROI-Ergebnisse in Excel und bestimmen den maximalen Hintergrund-adjusted Biolumineszenz-Signal für jede Maus. </li><li> Wiederholen biolumineszierenden Bildgebung wie angegeben für serielle Überwachung des Tumorwachstums. In unseren Experimenten führen wir wöchentlich BLI. Wir bevorzugen Bestimmen der maximalen BLI Signal für eine gegebene Bildgebungssitzung indem häufige Belichtungen über 5 - 30 min nach der Injektion von D-Luciferin. </li></ol> D. Repräsentative Ergebnisse Diese stereotaktischen Implantationstechnik mit einem erfolgreichen Tumor-take Rate von 90-100% und mit geringem perioperative Mortalität, die in der Regel weniger als 5% beträgt verbunden. Die Gefahr des unbeabsichtigten Nebenwirkungen ist auch günstig bei dieser Technik, einschließlich Komplikationen wie Seeder des Rückenmarks aus Tumorzellen in die Ventrikel oder extrakraniellen Tumorwachstum entweder Aussaat der Einschnitt mit Tumorzellen oder unzureichende Schließung des Bohrlochs implantiert einllowing intrakranialen Tumoren, durch die Öffnung in den Schädel zu erweitern. Ex vivo Analyse von Tumor-Xenotransplantaten gezeigt erwarteten Bereichen Hypoxie, erhöhte Expression von VEGF und Nekrose. Fluoreszenzmikroskopie für grün fluoreszierendes Protein (GFP) stabil durch unsere GBM Zelllinie exprimiert offenbarte die infiltrative Natur dieser Xenotransplantate. Abbildung 1 zeigt die Ergebnisse einer typischen erfolgreichen stereotaktische Implantation von GBM Zellen in das Gehirn einer Maus. Dies ist ein T2-gewichteten MRT-Hirnscans einer Maus Gehirn mit einem 9,4 Tesla Magneten 21 Tage nach der Implantation mit der hier beschriebenen Technik durchgeführt. Abbildung 1 zeigt einen einzigen Fokus des Tumors in der rechten Hemisphäre (konturiert in pink) mit 19 mm 3 das lokalisiert auf den genauen Koordinaten des Implantationsstelle. Abbildung 2 zeigt die Ergebnisse der Biolumineszenz Bildgebung mit den techn<html> iques hier beschriebenen für eine Gruppe von 10 Mäusen mit stereotaktisch implantierte Tumore, die gleichmäßig stratifiziert basierend auf maximale biolumineszierenden Signalintensität um entweder Schädelbestrahlung (4 x 4 Gy pro Tag Fraktionen) oder überhaupt keine Behandlung erhalten. In diesem Versuch zeigt, daß biolumineszente Bildgebung Strahlentherapie Proliferation der implantierten Tumoren hemmt, was zu keiner Erhöhung der detektierten biolumineszenten Signals, während das Signal im wesentlichen zunimmt Mock-bestrahlten Kontrolle Tumoren, durch unkontrollierten Proliferation der Krebszellen. Abbildung 1 (Video). Coronal MRI Abschnitte einer Mäusehirn mit einem U251 Glioblastom multiforme Tumor mit Konturierung des Tumorvolumens (in pink). Der Scan wurde unter Verwendung eines Spin-Echo-T2-gewichteten Protokoll auf einem 9,4 Tesla-Scanner. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4089/4089movie1.m4v" target="_blank">Klicken Sie hier, um Film anzusehen</a> . re 2 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4089/4089fig2.jpg &quot;/&gt; Abbildung 2. 10 Mäuse mit implantierten stereotaktisch Glioblastoma multiforme Tumoren wurden entweder mit externer Strahlentherapie bis 16 Gy in 4 Fraktionen oder keiner Behandlung behandelt. Mäuse wurden mit biolumineszierenden Bildgebung vor der Behandlung und wöchentlich nach Beginn der Behandlung abgebildet. Der Graph zeigt relativen Biolumineszenz als Median fache Änderung wo fache Änderung als das Verhältnis der gegenwärtigen maximalen Wert BLI Vorbehandlung maximalen Wert definiert ist BLI berechnet.

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	<li>Stupp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma.">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> N. Engl. J. Med. 352, 987-996 (2005).</li><li>Jacobs, V. L., Valdes, P. A., Hickey, W. F., De Leo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+review+of+in+vivo+GBM+rodent+models:+emphasis+on+the+CNS-1+tumour+model.">Current review of in vivo GBM rodent models: emphasis on the CNS-1 tumour model.</a> ASN Neuro. 3, e00063 (2011).</li><li>Shelton, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+pre-clinical+in+vivo+mouse+model+for+malignant+brain+tumor+growth+and+invasion.">A novel pre-clinical in vivo mouse model for malignant brain tumor growth and invasion.</a> J. Neurooncol. 99, 165-176 (2010).</li><li>Brehar, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+xenograft+glioblastoma+implants+in+nude+mice+brain.">The development of xenograft glioblastoma implants in nude mice brain.</a> J. Med. Life. 1, 275-286 (2008).</li><li>Ozawa, T., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+Intracranial+Brain+Tumor+Xenografts+With+Subsequent+Analysis+of+Tumor+Growth+and+Response+to+Therapy+using+Bioluminescence+Imaging.">Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging.</a> J. Vis. Exp. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+monitoring+of+intracranial+glioblastoma+xenograft:+response+to+primary+and+salvage+temozolomide+therapy.">Bioluminescence monitoring of intracranial glioblastoma xenograft: response to primary and salvage temozolomide therapy.</a> J. Neurosurg. 107, 610-616 (2007).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Methode der stereotaktischen Implantation von Krebszellen bei Mäusen in diesem Papier beschrieben reproduzierbar erzeugt Tumoren, die vernünftigerweise zu rekapitulieren die infiltrative und schnelle Wachstum Muster der klinischen Glioblastoma multiforme 2, 6-8. Diese Technik eignet sich besonders für Experimente Stratifizierung Mäusen gleichmäßig auf verschiedenen Behandlungsgruppen, wo reproduzierbare Tumoren von vergleichbarer Größe und biologischen Eigenschaften und in bestimmten anatomischen ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Beschreibung </td><td> Lieferant </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Digitale Just for Maus Stereotaktische Instrument </td><td> Stoelting </td><td> 51730D </td><td> Stereotaktische Plattform für Maus-Implantation </td></tr><tr><td> Ketamin / Xylazin </td><td></td><td></td><td> Injizierbare Anästhesie </td></tr><tr><td> Puralube Vet Salbe (Augenheilkunde) </td><td> Amazon.com </td><td></td><td> Zum Trocknen der Maus in die Augen zu verhindern </td></tr><tr><td> Bohren Halter für die stereotaktische Plattform </td><td> Stoelting </td><td> 51681 </td><td></td></tr><tr><td> Mikromotor Bohrmaschine </td><td> Stoelting </td><td> 51449 </td><td> Zum Bohren durch den Schädel </td></tr><tr><td> 0,45 mm Hartmetall Bohrer </td><td> Stoelting </td><td> 514551 </td><td></td></tr><tr><td> Sterile Wattestäbchen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 23-400-100 </td><td></td></tr><tr><td> Glasperle trocken Sterilisator (Germinator 500) </td><td> Braintree Scientific </td><td> GER-5287 </td><td> Auf Metall chirurgische Instrumente zu sterilisieren </td></tr><tr><td> Maus Rektalsonde </td><td> Braintree Scientific </td><td> RET-3-ISO </td><td> Kompatibel mit dem Temperaturregler </td></tr><tr><td> Temperaturregler (TCAT-2DF) </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 727561 </td><td> Temperaturregler auf tierische die Temperatur während der Operation zu erhalten </td></tr><tr><td> Kleine Heizplatte </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 727617 </td><td> Für den Einsatz mit Temperaturregler auf Maus während der Operation zu wärmen. Die Heizplatte passt unter der Maus auf den stereotaktischen Plattform. </td></tr><tr><td> Einmalskalpelle </td><td> BD Bard-Parker </td><td> 2015-11 </td><td> Nr. 10 Skalpell </td></tr><tr><td> 10 Mikroliterspritze </td><td> Hamilton </td><td> 7635-01 </td><td> Zur Injektion von Tumorzellen </td></tr><tr><td> 30-Gauge-Nadeln, 1 &quot;lang, mit Kegelkuppe </td><td> Hamilton </td><td> Verschiedene </td><td> Müssen kompatibel sein mit dem 10 &amp;mgr; l-Spritze </td></tr><tr><td> Nanomite Programmierbare Spritzenpumpe </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 704507 </td><td> Digitale motorisierte Spritze Injektor zur stereotaktischen Gerät </td></tr><tr><td> Cellulose sterilen chirurgischen Speer Schwämmen </td><td> Ultracell </td><td> 40410 </td><td> Um das OP-Feld trocknen </td></tr><tr><td> Knochenwachs </td><td> Ethicon </td><td> W31 </td><td> Um das Bohrloch abzudichten </td></tr><tr><td> Tissumend II synthetischen resorbierbaren Gewebekleber </td><td> Veterinary Products Laboratories </td><td> 3002931 </td><td> Um den Einschnitt abzudichten </td></tr><tr><td> Hot Wasserpumpe mit Erwärmung pad </td><td> Gaymar </td><td> TP-650 </td><td> Wärmt Mäuse in postoperativen Phase </td></tr><tr><td> IVIS Lumina II </td><td> Caliper Life Science </td><td></td><td> Bioluminescent Imager </td></tr><tr><td> D-Luciferin Kaliumsalz </td><td> Gold Biotechnologie </td><td> LUCK-1 </td><td> Luciferin für Biolumineszenz Bildgebung </td></tr></tbody></table>

stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) ist ein hochwertiges primären bösartigen Hirntumors mit einer medianen Überlebenszeit von nur 14,6 Monate bei Menschen trotz Standard Tri-Modalität Behandlung, bestehend aus chirurgischen Resektion, postoperative Strahlentherapie und Temozolomid-Chemotherapie ein. Neue therapeutische Ansätze sind klar notwendig, um das Überleben der Patienten und die Lebensqualität zu verbessern. Die Entwicklung wirksamer Behandlungsstrategien würde Tiermodellen GBM, die menschliche Krankheiten zu rekapitulieren erlaubt noch serielle Bildgebung Tumorwachstum und Ansprechen auf die Behandlung zu überwachen unterstützt werden. In diesem Papier beschreiben wir unsere Technik zur präzisen stereotaktischen Implantation von bio-bebilderbare GBM Krebszellen in das Gehirn von Nacktmäusen was Tumorxenotransplantaten die wichtigsten klinischen Merkmale der GBM 2 rekapitulieren. Diese Methode führt zu Tumoren, die reproduzierbar sind und in präzise anatomische Standorten während es in vivo Biolumineszenz Bildgebung seriell zu überwachen intrakranialen Xenotransplantat Wachstum und ansprechend auf Behandlungen 3-5. Diese Methode wird auch von den Tieren mit niedrigem perioperative Morbidität und Mortalität gut vertragen.

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Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

Wir beschreiben eine integrierte Methode für die präzise, ​​stereotaktische Implantation von humanen Glioblastom multiforme Zellen in den Gehirnen von Nacktmäusen und anschließende serielle<em&gt; In vivo</em&gt; Bildgebung zu überwachen und Wachstum Ansprechen auf die Behandlung der resultierenden Xenotransplantate.

Stereotaktische Intrakranielle Implantation und<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescent Imaging der Tumorxenotransplantaten in einem Maus-Modell-System des Glioblastoma multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality ...

stereotactic-intracranial-implantation-vivo-bioluminescent-imaging

Research

JoVE Journal

Medicine

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

25.4K Aufrufe.  University of Pennsylvania. Wir beschreiben eine integrierte Methode für die präzise, ​​stereotaktische Implantation von humanen Glioblastom multiforme Zellen in den Gehirnen von Nacktmäusen und anschließende serielle In vivo Bildgebung zu überwachen und Wachstum Ansprechen auf die Behandlung der resultierenden Xenotransplantate.

Serie: Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-Photonen-Imaging der Tumorzellinvasion in einem orthotopen Mausmodell des oralen Plattenepithelkarzinoms

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Forschung

Medizin

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung von Tumorhypoxie Dynamics of Breast Cancer Hirnmetastasen in einem Mausmodell

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate since the advent of in vivo bioluminescent imaging technologies 1-3. Indeed, the ability to locate and quantify tumor growth longitudinally in a single cohort of animals to completion of the study as opposed to sacrificing individual groups of animals at specific assay times has revolutionized how researchers investigate breast cancer metastasis. Unfortunately, current methodologies preclude the real-time assessment of critical changes that transpire in cell signaling systems as breast cancer cells (i) evolve within primary tumors, (ii) disseminate throughout the body, and (iii) reinitiate proliferative programs at sites of a metastatic lesion. However, recent advancements in bioluminescent imaging now make it possible to simultaneously quantify specific spatiotemporal changes in gene expression as a function of tumor development and metastatic progression via the use of dual substrate luminescence reactions. To do so, researchers take advantage for two light-producing luciferase enzymes isolated from the firefly (Photinus pyralis) and sea pansy (Renilla reniformis), both of which react to mutually exclusive substrates that previously facilitated their wide-spread use in in vitro cell-based reporter gene assays 4. Here we demonstrate the in vivo utility of these two enzymes such that one luminescence reaction specifically marks the size and location of a developing tumor, while the second luminescent reaction serves as a means to visualize the activation status of specific signaling systems during distinct stages of tumor and metastasis development. Thus, the objectives of this study are two-fold. First, we will describe the steps necessary to construct dual bioluminescent reporter cell lines, as well as those needed to facilitate their use in visualizing the spatiotemporal regulation of gene expression during specific steps of the metastatic cascade. Using the 4T1 model of breast cancer metastasis, we show that the in vivo activity of a synthetic Smad Binding Element (SBE) promoter was decreased dramatically in pulmonary metastasis as compared to that measured in the primary tumor 4-6. Recently, breast cancer metastasis was shown to be regulated by changes within the primary tumor microenvironment and reactive stroma, including those occurring in fibroblasts and infiltrating immune cells 7-9. Thus, our second objective will be to demonstrate the utility of dual bioluminescent techniques in monitoring the growth and localization of two unique cell populations harbored within a single animal during breast cancer growth and metastasis.

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Herein we describe the methods to construct, visualize, and quantify the bioluminescent reactions of both firefly and renilla luciferase enzymes expressed in metastatic breast cancer cells during their growth and metastasis in vivo.

In vivo Dual-Substrat Bioluminescent Imaging

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate ...

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The cell line was originally induced by intracranial injection of 3-methyl-cholantrene into a C57BL/6 syngeneic mouse strain 1; therefore, immunologically competent C57BL/6 mice can be used. While we use GL261, the following protocol can be used for the implantation and monitoring of any intracranial mouse tumor model. GL261 cells were engineered to stably express firefly luciferase (GL261-luc). We also created the brighter GL261-luc2 cell line by stable transfection of the luc2 gene expressed from the CMV promoter. C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr mice (albino variant of C57BL/6) from the National Cancer Institute, Frederick, MD were used to eliminate the light attenuation caused by black skin and fur. With the use of albino C57BL/6 mice; in vivo imaging using the IVIS Spectrum in vivo imaging system is possible from the day of implantation (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). The GL261-luc and GL261-luc2 cell lines showed the same in vivo behavior as the parental GL261 cells. Some of the shared histological features present in human GBMs and this mouse model include: tumor necrosis, pseudopalisades, neovascularization, invasion, hypercellularity, and inflammation 1.
Prior to implantation animals were anesthetized by an intraperitoneal injection of ketamine (50 mg/kg), xylazine (5 mg/kg) and buprenorphine (0.05 mg/kg), placed in a stereotactic apparatus and an incision was made with a scalpel over the cranial midline. A burrhole was made 0.1mm posterior to the bregma and 2.3mm to the right of the midline. A needle was inserted to a depth of 3mm and withdrawn 0.4mm to a depth of 2.6mm. Two &mu;l of GL261-luc or GL261-luc2 cells (107 cells/ml) were infused over the course of 3 minutes. The burrhole was closed with bonewax and the incision was sutured.
Following stereotactic implantation the bioluminescent cells are detectable from the day of implantation and the tumor can be analyzed using the 3D image reconstruction feature of the IVIS Spectrum instrument. Animals receive a subcutaneous injection of 150&mu;g luciferin /kg body weight 20 min prior to imaging. Tumor burden is quantified using mean tumor bioluminescence over time. Tumor-bearing mice were observed daily to assess morbidity and were euthanized when one or more of the following symptoms are present: lethargy, failure to ambulate, hunched posture, failure to groom, anorexia resulting in &gt;10% loss of weight. Tumors were evident in all of the animals on necropsy.

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

Intracranial implantation of GL261 cells into C57BL/6 mice produces malignant gliomas that recapitulate many of the hallmarks of human glioblastoma multiforme. We used GL261 cells stably expressing luciferase to allow us to use in vivo imaging to follow tumor progression. The surgery and 3D in vivo imaging are demonstrated.

Intrakranielle Implantation mit anschließender 3D In Vivo Bioluminescent Imaging von Murine Gliome

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

Live-Imaging of Drug Responses in der Tumor-Mikroumgebung in Mausmodellen von Brustkrebs

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

Despite the considerable progress made in the stent development in the last decades, cardiovascular diseases remain the main cause of death in western countries. Beside the benefits offered by the development of different drug-eluting stents, the coronary revascularization bears also the life-threatening risks of in-stent thrombosis and restenosis. Research on new therapeutic strategies is impaired by the lack of appropriate methods to study stent implantation and restenosis processes. Here, we describe a rapid and accessible procedure of stent implantation in mouse carotid artery, which offers the possibility to study in a convenient way the molecular mechanisms of vessel remodeling and the effects of different drug coatings.

A model of stent implantation in mouse carotid artery is described. Compared to other similar methods, this procedure is very rapid, simple and accessible, offering the possibility to study in a convenient way the vascular wall reaction to different drug-eluting stents and the molecular mechanisms of restenosis.

Ein Mausmodell der Stentimplantation in der Arteria carotis für das Studium der Restenose

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

A Novel Hochauflösende<em&gt; In vivo</em&gt; Bildtechnik, um die Dynamik der intrakranielle Strukturen zu Tumorwachstum und Therapeutics Studieren

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In-vivo-19 F-MRT für die Zellverfolgung

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Creating Anatomically Accurate and Reproducible Intracranial Xenografts of Human Brain Tumors

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live animal &#8211;&#160;particularly in sites with unique physiological and architectural qualities such as the brain. In vitro and ectopic models cannot account for features such as vasculature, blood brain barrier, metabolism, drug delivery and toxicity, and a host of other relevant factors. Orthotopic models have their limitations too, but with proper technique tumor cells of interest can be accurately engrafted into tissue that most closely mimics conditions in the human brain. By employing methods that deliver precisely measured volumes to accurately defined locations at a consistent rate and pressure, mouse models of human brain tumors with predictable growth rates can be reproducibly created and are suitable for reliable analysis of various interventions. The protocol described here focuses on the technical details of designing and preparing for an intracranial injection, performing the surgery, and ensuring successful and reproducible tumor growth and provides starting points for a variety of conditions that can be customized for a range of different brain tumor models.

The brain is a unique site with qualities that are not well represented by in vitro or ectopic analyses. Orthotopic mouse models with reproducible location and growth characteristics can be reliably created with intracranial injections using a stereotaxic fixation instrument and a low pressure syringe pump.

Erstellen Anatomisch genaue und reproduzierbare intrakranielle Xenografts der Menschen Hirntumoren

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

Intrauterine Telemetrie zur Maus Kontraktionsdruck messen<em&gt; In-vivo-</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...