Wir danken Herrn Hajime Ichijo für Video-Aufzeichnung und hilfreiche Ratschläge für die Bearbeitung des Videos. Wir danken auch Drs.Yuji Tsunekawa und Kaichi Yoshizaki für Art-Assistent für Video-Aufzeichnung. Diese Arbeit wird durch KAKENHI am Young Scientist B und auf die vorrangigen Bereiche-Molecular Brain Science aus MEXT von Japan unterstützt. Wir erkennen die Unterstützung der Global COE Program &quot;Basic und Translational Research Center for Global Brain Science&quot; von MEXT Japans und der Core Research für Entwicklungskreis Science and Technology (CREST) ​​aus der japanischen Science and Technology Corporation aus Japan Science and Technology Agency (JST) .

1. Einrichten des WEC-System <ol><li> Joint ein 0,22 um Membranfilter mit dem Einlass Silikonschlauch im WEC-System a). </li><li> Öffnen Sie das Ventil einer Gasflasche mit O 2 (95%) und CO 2 (5%). Durchfluss des Gasgemisches in die Trommel über die sprudelnde Flasche mit Wasser autoklaviert. </li><li> Passen Sie den Volumenstrom des Gasgemisches zu 50 cc. </li><li> Legen Sie die aus lassen Silikonschlauch in eine Flasche Wasser und überprüfen Sie die Strömung von Gas-Gemisch. </li><li> Drehen Sie die Trommel mit einer Geschwindigkeit von 20 U / min. </li></ol> 2. Vorbereitung des Kulturmediums <ol><li> Thaw Ratte sofort zentrifugiert (IC) Serum bei 37,0 ° C b). Add D-Glucose (2 mg / ml) in Serum aufgetaut in einer autoklavierten 100 ml Becher. Kulturmedium sollte in der primären Kultur Ebene (z. B. mit einer Kapuze) hergestellt werden. </li><li> Add Antibiotika-Antimykotikum (100X) Flüssigkeit, um das Serum mit 1: 400 Verdünnung. </li><li> Vaporize verbleibenden Isofluran (wegen Anästhesie von Ratten während der Blutentnahme) aus dem Serum für 20 Minuten bei Raumtemperatur (RT) c). </li><li> Sterilisieren des Kulturmediums mit einem 0,45 um Membranfilter. </li><li> Gießen Sie 3,0 ml des Mediums in jeder Kultur Flasche und verschließen Sie oben auf jeder Flasche mit einem Silizium-Stecker, mit Alufolie abgedeckt (vgl. Rz. 14) d). </li><li> Bereiten Sie drei oder vier zur Verfügung Petrischalen mit Tyrode-Salzlösung e). </li></ol> 3. Anästhesie der Ratte und der Isolation der Gebärmutter <ol><li> Anesthetize einer zeitlich trächtigen Ratten tief mit inhalativen oder parenterale Anästhetika. </li><li> Reinigen Sie den Bauchbereich des narkotisierten trächtigen Ratten mit 70% Ethanol. </li><li> Pick-up die Haut mit einer Pinzette und exteriorisieren der Bauchdecke, indem man die Haut mit großen Scheren f). </li><li> Pick-up die Bauchdecke mit einer Pinzette und machen U-förmigen großen Längsschnitten auf der Bauchdecke mit großen Scheren bis zur Brustwirbelsäule g). </li><li> Bär weg den Darm auf der linken Seite mit einer Pinzette und setzen Sie ein Ende des Uterus mit dem Eierstock. </li><li> Pick-up am Ende des Uterus mit einer Pinzette und schneiden Sie die Position zwischen der Gebärmutter und Eierstöcke mit großen Scheren. </li><li> Nehmen Sie die Gebärmutter von trächtigen Ratten, indem das Fett um die Gebärmutter bis zum anderen Ende der Gebärmutter. </li><li> Übertragen Sie die Gebärmutter auf eine Petrischale mit Tyrode-Salzlösung. </li><li> Euthanize der Ratte durch übermäßige Gabe von Anästhetika oder Genickbruch nach dem Entfernen der Gebärmutter. </li></ol> 4. Beseitigung von Embryonen aus der Gebärmutter <ol><li> Kurz spülen die Gebärmutter in Tyrode-Salzlösung und überträgt es auf die zweite Petrischale mit einer feinen Pinzette h). </li><li> Unter einem Binokular, pick up der Gebärmutterwand mit einer feinen Pinzette und schneiden Sie die Gebärmutterwand an der gegenüberliegenden Seite der Mesometrium Verbindung mit Blutgefäßen mittels ophthalmologischen geraden Schere. </li><li> Legen Sie die Spitze des ophthalmologischen geraden Schere in den Raum zwischen der Gebärmutterwand und decidua. Cut der Gebärmutterwand längs der antimesometrial Seite. </li><li> Clump der Decidua am mesometrial Seite und separaten conceptuses aus der Gebärmutter mit zwei Paaren von feinen Pinzette i). </li><li> Transfer conceptuses zum dritten Petrischale mit einer sterilisierten Glaspipette mit einem geeigneten Durchmesser. </li></ol> 5. Präparation Rattenembryonen <ol><li> Legen Sie eine Spitze der microforceps in die Dezidua und machen einen Querschnitt über die decidua rund um die Fruchtblase mit zwei Pinzetten. </li><li> Legen Sie die Spitzen der Pinzette in die Decidua an der Plazenta Seite und machen Sie zwei Längsschnitten auf der Decidua an die Spitze. </li><li> Entfernen Sie die Decidua an der Plazenta Seite durch Herausreißen, die mit zwei Pinzetten. Entfernen Sie die restlichen decidua mit zwei Pinzetten. </li><li> Pick up Reichert-Membran, machen ein horizontaler Schnitt auf sie, und trennen Sie die Membran von der Fruchtblase bei der Anti-Plazenta-Seite. </li><li> Machen Sie ein kleines Loch auf dem Dottersack in der Nähe des Kopfes des Embryos mit dem zwei Pinzetten, und schneiden Sie den Dottersack mit einem Paar von ophthalmologischen gebogene Schere. Es ist wichtig, nicht zu größeren Blutgefäße schädigen. </li><li> Pick-up das Amnion an der Stelle um den Kopf des Embryos mit den beiden Paaren von feinen Pinzette und ziehen Sie vorsichtig den Embryo aus dem Dottersack durch Zerreißen der Amnion h). Der Körper des Embryos sollte aus dem Dottersack gezogen werden, um die Sauerstoffversorgung für den Embryo im Stadium midgestation erhöhen. </li></ol> 6. Whole Embryo Kultur <ol><li> Überprüfen Sie Schäden an der Plazenta, Dottersack, und der Zustand der Herzschlag und Blutkreislauf. </li><li> Im Bewusstsein der nicht Dehnen der Nabelschnur, Transferder Embryo zu einer Kultur-Flasche mit einem sterilisierten Glaspipette. Carry over von Tyrode-Salzlösung zur Kultur-Flaschen sollten so wenig wie möglich. </li><li> Entfernen Sie eine nicht-Loch-Silizium-Stecker aus der Rotator Trommel. Verbinden Sie die Kultur-Flasche mit einem Stopfen mit einem Loch für den Rotator Trommel der WEC-System senkrecht. Achten Sie darauf, nicht zu zwingen, auf die Trommel gelegt in ungeeigneten Richtungen, da der Rotor Trommel ist ein sehr feines Gerät. Die Flaschen mit den präparierten Embryonen sind zur Kultur einer nach dem anderen übertragen; Öffnung der Tür des Inkubators sollten minimiert werden, um die Temperatur des Inkubators vermeiden, ist zurückgegangen j werden). </li><li> Nach 10 h Kultur, erhöhen Sie den Volumenstrom des Gasgemisches bis zu 75 ccm und bis zu 100 ccm nach 24 h (Tabelle 1). </li><li> Das Kulturmedium sollte etwa 24 Stunden durch die Übertragung der kultivierten Embryonen in eine neue Kultur-Flasche mit frisch zubereiteten Medium gewechselt werden. Erhöhen Sie den Volumenstrom bis 125 ccm nach 34 Stunden und bis zu 150 ccm nach 48 h (Tabelle 1) </li><li> Überprüfen Sie gelegentlich den Zustand der kultivierten Embryonen durch Zählen Herzfrequenz (dh 120-150/min ist optimal) und durch Beobachtung die Durchblutung. Bei Bedarf zählen die Anzahl der Somiten, um das Wachstum der Embryonen in Tyrode-Salzlösung zu beurteilen. In der normalen Entwicklung ist eine Somiten in zwei Stunden zugegeben. </li><li> Wenn WEC abgeschlossen ist, stoppen Lieferung von Gas-Gemisch und ziehen Sie das Zuleitungsrohr und der Membranfilter zu vermeiden, zurück in das Zuleitungsrohr an der sprudelnden Flasche. </li></ol> 7. Hinweise <ol class="lalpha"><li> Die Temperatur im Inneren des WEC-System ist ständig auf 37,0-37,5 ° C gehalten </li><li> 100% Ratte IC Serum wird routinemäßig in unserer WEC für Ratten-und Mäuse-Embryonen verwendet werden, und bei -20 ° C vor dem Gebrauch. </li><li> Wir kaufen Ratte IC Serum, das von Ratten, die mit Isofluran gesammelt wird. </li><li> Einweg-Flaschen sind auch aus Ikemoto Rika zur Verfügung. Flaschen und Silikonstopfen sollten autoklaviert werden. </li><li> Dissection von Embryonen bei RT durchgeführt werden, da die Aufrechterhaltung von Embryonen bei niedrigen oder hohen Temperaturen während der Präparation spätere Entwicklung beeinflussen in WEC. </li><li> Werkzeuge für die Dissektion sind durch trockene Hitze sterilisiert. </li><li> Die Haut und Bauchwand getrennt geschnitten werden, um eine Kontamination der Haare in eine Schale wie möglich zu vermeiden. Wir wechseln ein paar große Schere und Pinzette mit einem neuen Paar von ihnen, wenn wir die Haut schneiden und zu isolieren, die Gebärmutter, bzw.. </li><li> Mit einer Pinzette, deren Spitzen in Ordnung ist sehr wichtig für Gewebe sicher zu sezieren. Wir manuell schärfen den Spitzen der Pinzette mit einem Stein und Maschinenöl. </li><li> Wir verwenden eine Seite der Pinzette wie ein Messer, um Überdruck von Embryonen zu vermeiden. </li><li> Wenn die Temperatur im Inneren des WEC-System durch das Öffnen der Tür immer wieder abnimmt, arbeiten wir weiter an der Ampel links auf die Temperatur im Inneren des Systems zu halten. </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 1 zeigt Verfahren der Zerlegung des Rattenembryo und kultivierten Ratte Embryonen. <img src="/files/ftp_upload/2170/2170fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Whole Embryo Kultur der E12.5 Rattenembryo. (A) A conceptus aus der Gebärmutter der schwangeren Ratten seziert. (B) Entfernung von der Dezidua in der Plazenta Seite. (C) Entfernung von Reichert-Membran. (D) Eröffnung der Dottersack. (E) Die Rattenembryo Kultivierung in der Flasche für 6 Stunden nach Beginn der WEC. (F) Die Rattenembryo für 42 h kultiviert. d, decidua; R; Reichert-Membran, p, Plazenta, ys, Dottersack, e, Embryo. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 0 Std. </td><td> 12 Stunden </td><td> 24 Stunden </td><td> 36 h </td><td> 48 Stunden </td></tr><tr><td> E12.5 Rattenembryo </td><td> 95% 50 cc </td><td> 95% 75 ccm (10 h) </td><td> 95% 100 cc </td><td> 95% 125 ccm (34 hr) </td><td> 95% 150 cc </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Optimale Sauerstoff Zustand.

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	<li>New, D. A. T., Copp, A. J., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intoroduction.+In+mammalian+postimplantation+embryos.">Intoroduction. In mammalian postimplantation embryos.</a> In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. , 1-14 (1990).</li><li>Cockroft, D. L., Copp, A. J., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+culture+of+post+implantation+embryos.">Dissection and culture of post implantation embryos.</a> In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. , 15-40 (1990).</li><li>Morris-Kay, G. 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Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).</li><li>Osumi, N., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li><li>Arai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Fabp7,+a+downstream+gene+of+Pax6,+in+the+maintenance+of+neuroepithelial+cells+during+early+embryonic+development+of+the+rat+cortex.">Role of Fabp7, a downstream gene of Pax6, in the maintenance of neuroepithelial cells during early embryonic development of the rat cortex.</a> J. 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Es gibt zwei kritische Schritte in Nagetier WEC für den Erfolg. Erstens sollte die Dissektion Verfahren genau nicht zu beschädigen Embryonen, vor allem die Blutgefäße. Zweitens sollte das Verfahren so schnell wie möglich sein, da Sauerstoff und Nährstoffen nicht mehr versorgt werden über die Plazenta nach der Isolierung aus der Gebärmutter. Dies ist entscheidend für ältere Embryonen. Im Fall der Ratte WEC nach E12.5, sollten wir seziert Embryonen in Kultur-Flaschen Transfer innerhalb von 30 Minuten. <p cla...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Typ </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Kommentar </td></tr><tr><td colspan="5"> Einrichten WEC </td></tr><tr><td> WEC-System (10-0310) </td><td> Werkzeug </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-0310 </td><td> Ein weiteres kleines Modell ist ebenfalls erhältlich. </td></tr><tr><td> Silicon-Stecker, ohne ein Loch </td><td> Werkzeug </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-032-08 </td><td></td></tr><tr><td> Gas-Gemisch Zylinder </td><td> Werkzeug </td><td> Nikko Sanso </td><td> - </td><td> Mit 95% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid. Benutzerdefinierte Reihenfolge. </td></tr><tr><td> Gasregler </td><td> Werkzeug </td><td> Ono Seisakusho </td><td> WR-11 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 um Filter Millex GS </td><td> Werkzeug </td><td> Millipore </td><td> SLGS033SS </td><td></td></tr><tr><td colspan="5"> Anästhesie und Isolierung der Gebärmutter </td></tr><tr><td> Große Schere </td><td> Werkzeug </td><td> Napox </td><td> B-7H </td><td></td></tr><tr><td> Zange </td><td> Werkzeug </td><td> Napox </td><td> A-3-2 </td><td></td></tr><tr><td> Entsorgung Petrischale (90 mm x 15 mm) </td><td> Werkzeug </td><td> Iwaki </td><td> SH90-15 </td><td> Deep-Typ Gericht ist der beste für die Präparation. </td></tr><tr><td> Isofluran </td><td> Reagens </td><td> Abbott </td><td> B506 </td><td> Für Anästhesie </td></tr><tr><td> Pentobarbital-Natrium </td><td> Reagens </td><td> Schering-Plough Animal Health </td><td> - </td><td> Für Anästhesie </td></tr><tr><td> Tyrode-Salzlösung </td><td> Reagens </td><td> - </td><td> - </td><td> Nach wie das Protokoll in Ref. 2. Sparen Sie bei 4 ° C. </td></tr><tr><td> Timed-trächtigen Sprague-Dawley Ratten </td><td> Tier </td><td> Charles Rivers Laboratories in Japan </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td colspan="5"> Vorbereitung des Kulturmediums </td></tr><tr><td> Kultur Glasflasche </td><td> Werkzeug </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-032-05 </td><td></td></tr><tr><td> Entsorgung Kultur Flasche </td><td> Werkzeug </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-032-06 </td><td></td></tr><tr><td> Silicon-Stecker mit Loch </td><td> Werkzeug </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-032-07 </td><td></td></tr><tr><td> Aluminiumfolie </td><td> Werkzeug </td><td> Jedes Unternehmen, </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td> Autoklavieren Tasche </td><td> Werkzeug </td><td> Högy </td><td> HM-26 </td><td> Für Kultur-Flaschen </td></tr><tr><td> Autoklavieren Tasche </td><td> Werkzeug </td><td> Högy </td><td> HM-14A </td><td> Für Silikonstopfen </td></tr><tr><td> 0,45 um Filter Millex HA </td><td> Werkzeug </td><td> Millipore </td><td> SLHA033SS </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml konischen Rohr </td><td> Werkzeug </td><td> Becton Dickinson </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> 100 ml Becher </td><td> Werkzeug </td><td> Iwaki </td><td> TE-32 </td><td></td></tr><tr><td> Rat IC Serum </td><td> Reagens </td><td> Charles Rivers Laboratories in Japan </td><td> - </td><td> Siehe: Mr. Kunihiko Morisaki, TEL: +81- (0) 45-474-9336, Fax: +81- (0) 45-474-9340 </td></tr><tr><td> D (+)-Glucose </td><td> Reagens </td><td> Wako </td><td> 041-00595 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiotika-antimyotic Flüssigkeit </td><td> Reagens </td><td> Gibco </td><td> 15240 </td><td></td></tr><tr><td colspan="5"> Dissection von Embryonen </td></tr><tr><td> Ophthalmic gerade Schere </td><td> Werkzeug </td><td> Napox </td><td> MB50-7 </td><td> Zum Schneiden der Gebärmutterwand </td></tr><tr><td> Ophthalmic gebogene Schere </td><td> Werkzeug </td><td> Napox </td><td> MB54-2 </td><td> Zum Schneiden der Dottersack </td></tr><tr><td> Zange # 5 </td&gt; <td> Werkzeug </td><td> Kraft </td><td> T6715 </td><td></td></tr><tr><td> Zange # 5F </td><td> Werkzeug </td><td> Regine </td><td> T6819 </td><td></td></tr><tr><td> Glaspipette </td><td> Werkzeug </td><td> - </td><td> - </td><td> Made by Hand mit Pasteurpipette. </td></tr><tr><td> Autoklavieren Tasche </td><td> Werkzeug </td><td> Högy </td><td> HM-4 </td><td> Für Glas-Pipetten </td></tr><tr><td> Binokulares Mikroskop </td><td> Werkzeug </td><td> Leica </td><td> Mz7s </td><td></td></tr><tr><td> Licht </td><td> Werkzeug </td><td> Leica </td><td> CLS 150XD </td><td></td></tr><tr><td> Oil Stein </td><td> Werkzeug </td><td> Uchida Yoko </td><td> 833-2000 </td><td> Zum Schärfen der Zange </td></tr><tr><td> Maschinenöl </td><td> Werkzeug </td><td> Uchida Yoko </td><td> 835-0000 </td><td> Zum Schärfen der Zange </td></tr></tbody></table>

the method of rodent whole embryo culture using the rotator-type bottle culture system

Whole Embryo Culture (WEC) Technik hat im Jahr 1950 ist schon von New und seine Kollegen entwickelt und angewendet für Entwicklungsbiologie 1. Obwohl die Entwicklung und das Wachstum von Säugetieren Embryonen hängt entscheidend von der Funktion der Plazenta sind, ermöglicht WEC Technik uns zur Kultur Maus und Ratte Embryonen ex vivo Zustand während begrenzter Zeiträume entsprechend midgestation Stadien während der embryonalen Tag (E) 6,5-E12.5 in der Maus oder E8.5-E14.5 in der Ratte 2, 3, 4. In WEC, können wir direkt Bereichen von Embryonen mit feinen Glaskapillaren gewünschte Ziel, weil Embryonen unter dem Mikroskop manipuliert werden kann. Daher ist Nagetier WEC sehr nützliche Technik, wenn wir auf dynamische Entwicklungsprozesse postimplanted Säugerembryonen studieren wollen. Up to date, haben verschiedene Typen von WEC-Systeme bereits 1 entwickelt. Unter denen ist die Rotor-Typ Flasche Kultursystem beliebtesten und eignet sich für langfristige Kultur der Embryonen midgestation, dh nach E9.5 und E11.5 in der Maus und Ratte, bzw. 1. In diesem Video-Protokoll, demonstrieren wir unsere Standard-Verfahren der Ratte WEC nach E12.5 mit einem verfeinerten Modell der ursprünglichen Rotator System, das von Neu-und Cockroft 5, 6 entwickelt wurde, und stellen verschiedene Anwendungen der WEC-Technik für ein Studium in Säugetier-Entwicklung Biologie.

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The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole Embryo Kultur Technik ermöglicht es uns, Kultur Maus und Ratte Embryonen<em&gt; Ex vivo</em&gt; Zustand während begrenzter Zeiträume entsprechend midgestation Stufen. In diesem Video-Protokoll, demonstrieren wir unsere Standard-Verfahren der Ratte ganze Embryo Kultur nach E12.5 mit dem Rotor-Typ Flasche Kultur-System.

Die Methode der Nager Whole Embryo Culture mit der Rotator-type Bottle Kultur-System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

the-method-rodent-whole-embryo-culture-using-rotator-type-bottle

Research

JoVE Journal

Biology

23.6K Aufrufe.  Tohoku University Graduate School of Medicine. Whole Embryo Kultur Technik ermöglicht es uns, Kultur Maus und Ratte Embryonen Ex vivo Zustand während begrenzter Zeiträume entsprechend midgestation Stufen. In diesem Video-Protokoll, demonstrieren wir unsere Standard-Verfahren der Ratte ganze Embryo Kultur nach E12.5 mit dem Rotor-Typ Flasche Kultur-System.

Serie: The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Method for Culture of Early Hühnerembryonen ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Forschung

Biologie

Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of the lung endoderm with its surrounding mesenchyme and mesothelium. Lung mesenchyme has been shown to be the source of inductive signals for lung branching morphogenesis. Epithelial-mesenchymal-mesothelial interactions are also critical to embryonic lung morphogenesis. Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system (in the absence of maternal influence and blood flow). More importantly this technique can be readily done in a serumless, chemically defined culture media. Gain and loss of function can be achieved using expressed proteins, recombinant viral vectors and/or analysis of transgenic mouse strains, antisense RNA, as well as RNA interference gene knockdown.

Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system.

Embryonalen Maus-Lung Kultur, A-System, die molekularen Mechanismen des Branching Bewerten

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

Ein Ex-ovo Chicken Embryo Culture-System Geeignet für Imaging und Mikrochirurgie Anwendungen

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur Verfahren zur embryonalen Maus Herz

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

Maus embryonalen Entwicklung in einem Serum-freien Whole Embryo Culture-System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental biologist. For many organs it is difficult to access developing tissue to allow monitoring during ex vivo culture. The slice culture method allows access to tissue so that morphogenetic movements can be followed and specific cell populations can be targeted for manipulation or lineage tracing.
In this paper we describe a method of slice culture that has been very successful for culture of tooth germs in a range of species. The method provides excellent access to the tooth germs, which develop at a similar rate to that observed in vivo, surrounded by the other jaw tissues. This allows tissue interactions between the tooth and surrounding tissue to be monitored. Although this paper concentrates on tooth germs, the same protocol can be applied to follow development of a number of other organs, such as salivary glands, Meckel&#39;s cartilage, nasal glands, tongue, and ear.

Here we detail a method to culture tooth germs in mandible slices using a tissue chopper. This method allows unique access to the tooth during development, providing excellent opportunity for manipulation and lineage tracing, not available using more traditional culture methods.

Die Slice-Kultur-Verfahren zur Nach Entwicklung der Zahnkeime In Explantation Kultur

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

Herstellung von Ratten Serum Geeignet für Säugetier Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Errichtung einer extrazellulären sauren pH-Wert Kultursystem

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

Evaluating the Angiogenetic Properties of Ovarian Cancer Stem-Like Cells using the Three-Dimensional Co-Culture System, NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular matrix. The ability of CSCs to participate in the development of endothelium constitutes an important characteristic that directly contributes to the general understanding of the mechanisms of tumorigenesis and tumor metastasis. The purpose of this work is to establish a reproducible methodology to investigate the tumor-initiation capability of ovarian cancer stem cells (OCSCs). Herein, we examined the neovascularization mechanism between endothelial cells and OCSCs along with the morphological changes of endothelial cells using the in vitro co-culture model NICO-1. This protocol allows visualization of the neovascularization step surrounding the OCSCs in a time course manner. The technique can provide insight regarding the angiogenetic properties of OCSCs in tumor metastasis.

Ovarian cancer stem cells (OCSC) are responsible for cancer initiation, recurrence, therapeutic resistance, and metastasis. The OCSC vascular niche is considered to promote self-renewal of OCSCs, leading to chemoresistance. This protocol provides the basis for establishing a reproducible OCSC vascular niche model in vitro.

Bewertung der angiogenetischen Eigenschaften von Stammzellen von Eierstockkrebs mit dem dreidimensionalen Kokultursystem NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular ...

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus (AAV)2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

Adeno-associated viruses (AAV) are promising vectors for gene therapy applications. Here, the AAV2 vector is produced by co-culture of Spodoptera frugiperda (Sf9) cells with Sf9 cells infected with baculovirus (BV)-AAV2-GFP (or therapeutic gene) and BV-AAV2-rep-cap in serum-free suspension culture. Cells are cultured in a flask in an orbital shaker or Wave bioreactor. To release the AAV particles, producer cells are lysed in buffer containing detergent, which is subsequently clarified by low-speed centrifugation and filtration. AAV particles are purified from the cell lysate using AVB Sepharose column chromatography, which binds AAV particles. Bound particles are washed with PBS to remove contaminants and eluted from the resin using sodium citrate buffer at pH 3.0. The acidic eluate is neutralized with alkaline Tris-HCl buffer (pH 8.0), diluted with phosphate-buffered saline (PBS), and further concentrated with tangential flow filtration (TFF). The protocol describes small-scale pre-clinical vector production compatible with scale-up to large-scale clinical-grade AAV manufacturing for human gene therapy applications.

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

In this protocol, AAV2 vector is produced by co-culturing Spodoptera frugiperda (Sf9) insect cells with baculovirus (BV)-AAV2-green fluorescent protein (GFP) or therapeutic gene and BV-AAV2-rep-cap infected Sf9 cells in suspension culture. AAV particles are released from the cells using detergent, clarified, purified by affinity column chromatography, and concentrated by tangential flow filtration.